Summary
Ce protocole décrit l’utilisation d’un analyseur de composition corporelle et le système de surveillance animale métabolique pour caractériser la composition corporelle et des paramètres métaboliques chez les souris. Un modèle de l’obésité induit par l’alimentation riche en graisses est utilisé à titre d’exemple pour l’application de ces techniques.
Abstract
Modifications de la composition corporelle (masse grasse ou maigre), les paramètres métaboliques tels que la consommation d’oxygène du corps entier, dépense énergétique et utilisation des substrats et des comportements tels que la prise alimentaire et l’activité physique peuvent fournir des informations importantes en ce qui concerne les mécanismes sous-jacents de la maladie. Compte tenu de l’importance de la composition corporelle et du métabolisme au développement de l’obésité et ses séquelles ultérieures, il est nécessaire de faire des mesures précises de ces paramètres dans le cadre de la recherche préclinique. Avancées technologiques dans les dernières décennies ont permis de tirer ces mesures dans les modèles de rongeurs de façon non invasive et longitudinale. Par conséquent, ces mesures métaboliques se sont avérés utiles pour évaluer la réponse des manipulations génétiques (souris knock-out ou transgéniques par exemple, précipitation virale ou la surexpression des gènes), dépistage de drogue/composé expérimental et diététiques, interventions de l’activité physique ou comportemental. Ici, nous décrivons les protocoles utilisés pour mesurer la composition corporelle et des paramètres métaboliques à l’aide d’un animal système dans nourris et hautes graisses régime alimentaire chez les souris nourries de surveillance.
Introduction
Métabolisme sous-tend les nombreux aspects de cellulaire normal, orgue et physiologie du corps entier. En conséquence, dans le cadre de diverses pathologies, altérations du métabolisme peuvent contribuer directement à l’affection sous-jacente ou pourraient être négativement touchées comme un effet secondaire de la pathologie. Traditionnellement, recherches métaboliques et les études sur l’équilibre énergétique ont été concentrées sur le domaine de l’obésité et les affections apparentées telles que résistance à l’insuline, pré-diabète, intolérance au glucose, les maladies cardiovasculaires et le diabète. Cette recherche est justifiée étant donné la prévalence croissante de ces conditions dans le monde entier et l’individu, société, et infligent des coûts économiques ces conditions. Par conséquent, l’élaboration de stratégies de prévention et de nouvelles thérapies pour objectif obésité est un objectif continu dans les laboratoires de recherche dans le monde entier et modèles murins précliniques sont fortement invoqués pour ces études.
Bien que pesant souris fournit une évaluation fiable du gain de poids ou de perte, il ne fournit pas une ventilation des différents composants qui composent la composition corporelle (masse grasse, masse maigre, eau gratuite ainsi autres composants tels que les fourrures et les griffes). Le pesage des coussinets adipeux à l’achèvement des études, une fois que la souris est décédée donne la mesure exacte des différents dépôts de graisse, mais ne peut fournir des données pour un moment unique. En conséquence, il est souvent nécessaire de s’inscrire plusieurs cohortes afin d’étudier l’évolution de l’obésité au temps, nettement plus en plus nombre d’animaux, temps et coûts. L’utilisation de bi-énergie absorptiométrie à rayons x (DEXA) fournit une approche pour évaluer le contenu du tissu gras et maigre corps et permet au chercheur d’obtenir des données de manière longitudinale. Toutefois, la procédure exige des souris d’être anesthésié1et des épisodes répétés d’anesthésie peuvent avoir une incidence l’accumulation du tissu adipeux ou impact sur d’autres aspects de la régulation du métabolisme. EchoMRI utilise la résonance magnétique nucléaire relaxométrie pour mesurer la masse grasse et maigre, eau gratuite et teneur en eau totale. Cet objectif est réalisable en raison de la création du contraste entre les composants de tissus différents, avec des différences dans la durée, l’amplitude et la répartition spatiale des radiofréquences générés, permettant à la délimitation et la quantification de chaque type de tissu. Cette technique est avantageuse car il est non invasif, rapide, simple, ne nécessite aucune anesthésie ou rayonnement et, surtout, a été positivement validé contre l’analyse chimique2.
Un facteur clé de l’obésité et la recherche connexe est l’équation de bilan énergétique. Accumulation de graisse est plus compliquée que purement énergétique (apport alimentaire) versus énergie (dépense énergétique), mais elles sont des facteurs essentiels pour pouvoir mesurer. Dépense énergétique quotidienne correspond au total des quatre éléments différents : (1) dépense énergétique basale (taux métabolique au repos) ; (2) la dépense d’énergie due à l’effet thermique de la consommation d’aliments ; (3) l’énergie nécessaire pour la thermorégulation ; et (4) l’énergie dépensée sur l’activité physique. Comme dépense d’énergie génère de la chaleur, la mesure de la production de chaleur par un animal (appelé calorimétrie directe) peut servir à évaluer la dépense énergétique. Sinon, mesure d’inspiré et expiré concentrations d’O2 et CO2, permettant la détermination de tout le corps O2 consommation et de production de CO2 , peut être utilisé comme un moyen de mesurer indirectement (indirect calorimétrie) production de chaleur et donc de calculer la dépense énergétique. Une augmentation de la prise alimentaire ou une baisse de la dépense énergétique sera prédisposent souris au gain de poids et les observations des variations de ces paramètres peuvent fournir des informations utiles des mécanismes susceptibles d’action dans des modèles particuliers de l’obésité. Un paramètre métabolique connexe d’intérêt est le ratio d’échanges gazeux (RER), un indicateur de la proportion de substrat/combustible (c.-à-d., hydrates de carbone ou de la graisse) qui subit le métabolisme et utilisées pour produire de l’énergie. Par conséquent, mesure de la prise alimentaire (énergie consommée) combinée avec des niveaux d’activité physique, la consommation de2 O, RER et dépense énergétique peut fournir une compréhension globale du profil métabolique de l’organisme. Une méthode pour collecter des données consiste à utiliser un animal de laboratoire complet système (palourdes), qui est basé sur la méthode de la calorimétrie indirecte pour mesurer la dépense énergétique et dispose des capacités supplémentaires de la détermination des niveaux d’activité physique (faisceau de surveillance pauses) et la prise alimentaire par l’intermédiaire des échelles incorporées dans la chambre de mesure.
Dans ce protocole, nous fournissons une description simple de l’utilisation d’un analyseur de composition corporelle pour évaluer la composition corporelle chez des souris et un système de surveillance métabolique animal pour mesurer des aspects du métabolisme. Problèmes et limitations de ces techniques seront discutées ainsi que les méthodes proposées d’analyse, interprétation et représentation des données.
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Protocol
Toutes les expériences décrites ont été approuvées par l’Alfred Medical Research Education Precinct Animal Ethics Committee (AMREP AEC) et de souris ont reçu des soins compatissants en ligne avec la santé nationale et du Medical Research Council (NHMRC) des lignes directrices de l’Australie sur Expérimentation animale. Les animaux étaient administrés à leur régime alimentaire et l’eau prescrites ad libitum et abrité au sein d’un environnement contrôlé en température (~ 21-22 ° C) avec une lumière de 12 h et 12 h-dark cycle. Sept semaines vieilles souris mâles (sur un fond de C57Bl/6J) recevaient des diètes régulières chow normal (énergie contenu 14,3 MJ/kg, composé de 76 % de kJ de glucides, 5 % de matières grasses, 19 % de protéines ; voir Table des matières) ou pour le groupe de graisse-alimentation élevé, une haute teneur en graisses pour maigrir (HFD) () 19 MJ/kg, composé de 36 % de kJ d’hydrates de carbone, 43 % de matière grasse, protéine de 21 %, spécialité se nourrit du contenu énergétique) pendant 3 semaines. Poids et Mensurations de composition à l’aide d’une machine de EchoMRI ont été faites par semaine alors que l’analyse de contrôle métabolique a eu lieu dans un palourdes après 3 semaines de la diète.
1. corps Composition Analyzer procédure
Remarque : Pour fonctionner de façon optimale, la EchoMRI 4-en-1 utilisé dans le présent protocole doit être contenue dans une pièce où la température de l’air est stable et ne fluctue pas. Idéalement, cela doit être constamment surveillée. Déplacement de la machine et les interruptions au pouvoir doit également être évitée si possible. Si l’alimentation a été interrompue et le système doit être redémarré, laisser au moins 2-3 h pour la machine pour se réchauffer avant de l’utiliser. Avant de commencer, assurez-vous que vous portez des équipements de protection individuelle approprié.
- Avant l’analyse de souris, effectuer un test du système sur la machine d’analyseur de composition de corps. Cela consiste à utiliser un étalon (dénommé une prise d’essai du système des huile canola (coûts)) pour tester la précision de l’instrument et à s’assurer qu’il n’y a eu aucune dérive dans l’exactitude des informations.
- Ouvrir le logiciel système, puis cliquez sur le bouton de barre d’outils de Test du système ou en appuyant simultanément sur « Alt + Y ».
- Avant l’essai de système est effectué par l’ordinateur, attendez un rappel vérifier que les coûts appropriés (dans ce cas les coûts propres à la souris) a été placé dans le portique du système ( Figure 1). Une fois confirmé que c’est effectivement le cas, accepter de procéder à l’essai, qui va prendre quelques minutes pour terminer.
- Une fois que le système de test a été passé, continuer avec la numérisation.
- Si le test du système échoue, répétez le test du système.
- Si la machine continue à être hors de portée (en indiquant qu'un écart s’est produite), étalonnage peut être nécessaire de corriger la situation. Compléter cela en suivant les instructions ou tel que décrit dans le manuel d’utilisation fourni au moment de l’achat. Si le problème persiste, vérifiez le manuel3 ou signaler le problème au service clientèle du fabricant et demander des instructions supplémentaires.
- Placez les souris dans un petit spécimen d’animaux-(long cylindre) pour garder leur contenu tandis que dans la machine. Pour ce faire, placez le support horizontal, soulevez la souris et l’insérer dans l’ouverture de la culasse tout d’abord. Lentement et soigneusement mettre le titulaire en position verticale, afin que la souris est au fond du cylindre et prêtes pour l’analyse.
- Une fois dans le support, insérer un séparateur pour limiter le mouvement de la souris au cours de la période de mesure. Dans certaines circonstances, avec des souris extrêmement actifs, il peut être nécessaire maintenir le délimiteur en place avec le bout de votre doigt.
NOTE : Familiariser les souris avec le placement dans le porte-spécimens avant leur analyse initiale pour réduire le stress. L’utilisation d’un porte-échantillon animal coloré rouge peut également réduire la réponse au stress potentiels, comme les souris se sentent qu’ils sont dans l’obscurité. - Dans le logiciel, sélectionnez un dossier (barre d’outils du dossier) pour enregistrer les données et créer un nom de fichier.
- Si nécessaire, réduire la quantité de bruit aléatoire dans les mesures gras et maigres en augmentant le nombre des accumulations primaires du scan. Une fois que le logiciel est lancé, les accumulations primaires est définie sur une valeur par défaut recommandée pour un usage quotidien général ; sauf s’il existe une raison particulière de changer ces paramètres, les paramètres par défaut donnera le niveau de précision nécessaire aux utilisateurs.
- Si ne pas intéressé à obtenir des données pour l’eau libre et total de l’eau, éteindre la scène de l’eau en sélectionnant l’onglet de dire non. Cela va réduire de façon significative la durée de scan et améliorer le débit.
- Lancer le scan en sélectionnant « Démarrer le scan » ou en appuyant sur F5 sur le clavier. Entrez toutes les données pertinentes sur l’animal (p. ex., animal ID, masse corporelle, etc..) et appuyez sur « OK » ou sur F5 pour commencer l’analyse, ce qui prendra environ 1 min.
- Après que les données ont été obtenues, retirez le support animal contenant la souris de l’ordinateur et placer le dos animal dans sa cage. Une fois que tous les animaux ont été balayés, exportez les données pour une analyse plus approfondie et la collation.
- Avant et après utilisation, nettoyez à fond les détenteurs d’animaux conformément aux instructions du fabricant. Car ces supports sont construits en plastique acrylique, alcool isopropylique et alcool éthylique doivent être évités, car ils peuvent provoquer la fissuration des titulaires et/ou une détérioration rapide de l’actionnaire, ce qui augmente la probabilité de rupture. Au lieu de cela, utilisez la solution de l’eau chaude pour la vaisselle, ou, si autre désinfectant est requise, utilisez F10 (à une dilution de 1:125) ou autres sprays désinfectants ou nettoyage (voir Table des matières) et puis essuyer.
2. métabolisme Animal suivi procédure système
Remarque : Le système nécessite environ 2 h à réchauffer et à stabiliser. Si la machine est éteinte, il doit être allumé pour permettre à la cellule de zircone à chauffer à 725 ° C. Aussi, nous mettons généralement souris dans l’analyseur de composition corporelle un jour avant à l’entrée de l’animal, système de surveillance pour éviter tout problème avec le stress de contrainte.
- S’assurer que l’ordinateur relié au système de surveillance animal est sous tension et ouvrez le programme de contrôle. Sélectionnez l’option « Utilitaire Oxymax » dans le menu outil pour initier les pompes.
- Remplir les gourdes d’eau appropriée, peser et inspecter la santé des souris et d’organiser des aliments. Si la mesure prise alimentaire dans le système, envisager de poudrage de la nourriture. Remplissez les trémies d’alimentation en appuyant sur la nourriture de plate-forme et de la pointe à ressort dans la trémie. Veiller à ce que la trémie de la nourriture et la bouteille d’eau sont complètement remplis pour s’assurer qu’il y a suffisamment de nourriture et eau pour durer le temps imparti expérimental.
- Vérifier l’état de la drierite/déshydratant ; Si vous utilisez un indicateur de couleur, il devrait être bleu et donc sécher, mais si c’est rose/mauve, il a eu absorption de l’humidité importante et doit être remplacé ou complété.
- Vérifiez l’état du piège de l’ammoniaque et de la chaux sodée et remplacer si nécessaire. Si le piège de l’ammoniac est connecté deux à la fois, quand le deuxième piège affiche des signes d’un changement de couleur, remplacer la première. Une augmentation du CO2 décalage peut aussi signifier qu’il fallait remplacer la chaux sodée.
NOTE : Déshydratant peut être séché dans un four et réutilisé, cependant, nous suivons les recommandations du fabricant du système à utiliser fraîche chaque fois. - Assembler les chambres. Pour ce faire, placez la trémie d’alimentation sur la balance, puis placez la chambre sur le dessus avec la plate-forme perforée qui devient le plancher de la chambre insérée. Soigneusement placer la souris dans la chambre et fixez le couvercle du système avec le front et clips en arrière et fixer avant le positionnement de la bouteille d’eau et de fixation. Par précaution, revérifiez tous les couvercles de chambre, les souris et l’eau (Figure 2 a-D).
Remarque : Selon la taille des souris en cours d’examen, il peut être nécessaire d’ajuster la hauteur des espaces au-dessus de la trémie d’alimentation afin que les souris aient accès à la nourriture, mais pas assez d’espace qu’ils peuvent dormir directement sur le dessus de la mangeoire. - Comme il est recommandé que les capteurs de gaz être étalonné avant chaque expérience, étalonner le système.
- Utiliser un gaz de composition connue (0,5 % de CO2, 20,5 % O2, équilibre d’azote). Relier le réservoir de gaz de calibrage au système via un régulateur et tuyau. Mettre en marche et s’assurer que la pression de sortie du réservoir est la lecture de 5 à 10 lb/po2.
Remarque : Certains systèmes ont un deuxième réservoir, tuyau et le régulateur pour l’utilisation de l’azote pur comme un gaz « offset ». Le système que nous opérons utilise plutôt Sodo pour générer l’air libre de CO2 . - Suivez les procédures pour calibrer l’O2 tant CO2 capteurs. Sélectionnez « calibration » dans le menu Outils et séquentiellement calibrer l’O2 tant de CO2. Avant de calibrer, s’assurer que l’échantillon 1) et les flux de référence sont 0,400 l/min, 2) la température de la sonde zircone O2 est 725 ° C (± 1 ° C), 3) se trouvent le sample et les référence plus sèches et les pompes à air, et 4) le gaz d’étalonnage et est allumé.
- Si nécessaire, lors de l’étalonnage de la sonde de2 O, légèrement Réglez le décalage sur l’avant de la sonde zircone pour atteindre une valeur de ratio2 O de 1.0000 (± 0,0002). Il s’agit d’assurer que c’est dans des limites acceptables (surlignés en vert polices dans l’affichage du logiciel sur l’écran de l’ordinateur).
- Après les succès d’O2 et CO2 calibrage de la sonde, éteignez la bouteille de gaz de calibrage et débranchez le tuyau du régulateur. Après calibration, O2 pour l’air de référence (atmosphérique) devraient lire 20,92 (± 00.02). Si l’étalonnage est hors tolérance, répéter et se reporter aux guides du fabricant en cas de problème. A défaut, contactez le fabricant pour obtenir des instructions supplémentaires.
- Utiliser un gaz de composition connue (0,5 % de CO2, 20,5 % O2, équilibre d’azote). Relier le réservoir de gaz de calibrage au système via un régulateur et tuyau. Mettre en marche et s’assurer que la pression de sortie du réservoir est la lecture de 5 à 10 lb/po2.
- Poursuivez le montage expérimental. Sélectionnez « ouvrir fichier expérimental » dans le menu de l’expérience. Sélectionnez le modèle approprié (par exemple, la souris). En vertu de « setup » dans le menu expérience définissent les paramètres de l’expérience qui doivent être enregistrées (par exemple, ID de souris, poids, groupe, etc.) désélectionner les chambres ne l’utilisez pas et sélectionnez l’emplacement pour l’expérience d’être sauvés.
- S’assurer que les échelles ont été tarés si la mesure de la prise alimentaire et commencent la saisie de données en sélectionnant « exécuter » dans le menu de l’expérience. Données sont capturées pour différentes durées selon le phénotype, les lignes directrices sur les animaux d’isolation et l’utilisation du système.
NOTE : Dans nos mains, l’expérience est régulièrement exécutée pendant 48 h, avec les premières 24 h, utilisé comme une acclimatation à ce nouvel environnement et le deuxième 24h utilisé pour l’analyse des données. La période de collecte de données est basée sur combien de temps le chercheur souhaite conserver leurs souris individuellement logés et dépend de l’approbation de l’éthique animale. Par ailleurs, si des dispositions existent, souris peuvent être acclimatés dans les chambres avant d’être utilisés dans le système et connectées. Chaque chambre est mesurée à environ une fois toutes les 13 mn quand un système de 12 chambres est en cours d’utilisation. - Vérifiez régulièrement et surveiller les résultats qui sont obtenus pendant que les souris sont dans le système pour assurer le bien-être des animaux et que nous recueillons des données appropriées. Toute question peut être en mesure d’identifier à ce stade et rectifiées. Vérifier sur chaque souris chaque matin et le soir quand ils sont dans le système.
- Vérifiez l’onglet métabolique en haut de la page de fichier de données pour les données collectées en temps réel pour chaque souris en ce qui concerne les dépenses de consommation, RER et l’énergie de l’oxygène. Pendant ce temps, des rondins pauses et données de consommation alimentaire peuvent se trouver dans les onglets de l’activité et l’alimentation, respectivement. Vérifiez que le « O2 dans » lit autour de 20.90-20,94, le « CO2 dans » avoisine 0,040 - 0,050, le RER est comprise entre 0,7 et 1, et le débit d’eau est constante à 0,5 - 0,6 L/min.
- À intervalles réguliers, vérifier que les souris aient accès à la nourriture et l’eau et qu’ils consomment chacun. S’assurer qu’ils ne manifestent pas des signes de détresse comme creuser dans le plancher perforé. En outre, suivre les résultats qui sont affichent.
- À la fin du temps alloué expérimentale, sélectionnez « stop » dans le menu de l’expérience et les résultats à l’exportation (sous forme de fichiers CSV, fichier > exportation > générer sujet CSV) pour analyse.
- Inspecter la santé des souris, pesez-les et puis retourner à leurs domicile cages.
- Souris peut être hostile envers l’autre après la séparation, donc surveiller une fois qu’ils sont logés ensemble à nouveau.
- Démonter les cages, retirer les excès de nourriture de trémies et astuce sur les fèces, l’urine et denrées alimentaires provenant des cages. Submerger les bouteilles et sippers en solution diluée de T-bac, tremper et nettoyer les autres composants de la solution eau de Javel diluée. Rincer à l’eau et laisser à l’air sec.
- Calculer les paramètres métaboliques avec le logiciel. Le logiciel utilise un certain nombre d’équations pour fournir les données finales sortie4.
Pour le calcul de la production de dioxyde de carbone et la consommation d’oxygène : la consommation d’oxygène: VO2 (l/min)= Vj’aiO2i - VoO2o; Production de gaz carbonique: VCO2 (l/min)= VoCO2o-Vj’aiCO2i
Où : Vi = le taux de ventilation d’entrée (LPM), Vo = le débit de ventilation (LPM), O2i = O2 concentration à l’entrée, O2o = la concentration de2 O en sortie, CO2i = la CO2 concentration à l’entrée, CO2o = la concentration de CO2 à la sortie.
Pour le calcul du RER : RER = VCO2 / VO2. Notez que l’oxydation des protéines n’a pas été mesurée et donc le RER n’a pas ajusté pour cela.
Pour le calcul de la dépense énergétique : dépense énergétique: CV = 3.815 + 1.232* RER
Chaleur (Kcal/h)) = CV * VO2. Où : Le CV est le pouvoir calorifique (la relation entre la chaleur et le volume de consommation d’oxygène). Il est dérivé de « L’éléments de la Science de la Nutrition » dénommé la Lusk Table, composé par Graham Lusk.
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Representative Results
Les résultats observés dans la Figure 3 affichent un changement typique dans les paramètres de composition du corps lors d’alimentation haute graisse, telle que mesurée par l’intermédiaire de EchoMRI. Au départ, il n’y avait aucun différence dans n’importe quel paramètre mesuré (Figure 3 a-F). Cependant, après seulement une semaine d’alimentation riche en graisses, il y avait une augmentation significative du poids corporel, masse grasse et taux de graisse corporelle massive dans le groupe SIH (Figure 3 a,B,D). L’ampleur des différences entre les deux groupes de ces mesures a continué d’augmenter au cours de l’intervention diététique de 3 semaines. Teneur totale en eau (Figure 3,E,F) la masse maigre et l’eau libre ne différaient pas des groupes à tout moment. On peut aussi considérer que le chow nourris de souris a continué à prendre du poids au cours de la période d’étude (Figure 3 a) et que c’était dû à une augmentation de la masse maigre (Figure 3) et non une masse grasse augmente (Figure 3 b).
Comme peut être vu dans la Figure 4, trois semaines d’alimentation graisse haute a entraîné un certain nombre de changements détectés chez l’animal métabolique, système de surveillance. VO2 lorsque non corrigées de poids corporel a été significativement plus élevée chez les riches en graisses plus lourdes nourri de souris (Figure 4 a). Notamment, normalisation de VO2 par l’intermédiaire de deux différents facteurs conduit à deux résultats différents. Nourris de normalisation au poids total du corps conduit à aucune différence de VO2 entre le chow standard et haute teneur en graisses nourris de souris, alors que la normalisation pour la masse maigre produit une différence significative (Figure 4 b,C). Ces résultats démontrent que la normalisation des données2 VO en divisant par variables massives significativement influé sur les résultats, et il faut être prudent lorsqu’on interprète les données de VO2 lorsqu’il est exprimé de manière. Pour une discussion détaillée de la façon d’exprimer les données2 VO et les effets de la normalisation aux différents paramètres, voir l’excellente discussion dans Tschop, et al. 5 dans leur guide pour l’analyse du métabolisme énergétique souris, Tschop et ses collègues suggèrent l’utilisation d’analyse de variance Co (ANCOVA) pour interroger statistiquement les effets du poids corporel ou de la composition corporelle sur la dépense d’énergie et de données sur l’apport alimentaire . Dans ce cas, l’exécution d’une ANCOVA sur les données présentées dans la Figure 4 a, à l’aide de poids corporel comme covariable, révèle qu’aucune différence statistiquement significative n’existe entre chow normal et HFD, ce qui indique qu’une fois que tenant compte du poids corporel, il y a aucune différence dans la consommation d’oxygène entre les groupes. Ce résultat peut être facilement visualisé lors du traçage de VO2 contre poids corporel comme un diagramme de dispersion comme illustré dans la Figure 4. Traçage de VO2 contre poids (Figure 4) montre que les données de2 VO se trouvent sur une ligne commune en ce qui concerne le poids corporel, avec les animaux plus lourds consomment plus d’oxygène. À noter, comploter contre la masse maigre de VO,2 montre que les données de2 VO se trouvent sur deux lignes distinctes en ce qui concerne la masse maigre (Figure 4E).
RER a été significativement plus faible dans la haute teneur en graisses nourri de souris, indiquant l’utilisation des graisse au cours de l’utilisation des glucides lorsque nourris avec le régime riche en graisses (Figure 5 a). Dépense d’énergie (chaleur) sans normalisation a augmenté chez les animaux plus lourds, probablement en raison des animaux ayant des tissus plus métaboliquement active (Figure 5 b), avec cette différence se perdre une fois normalisé au poids corporel (Figure 5). Notez également les augmentations de VO2, RER et la dépense énergétique dans le cycle sombre par rapport au cycle de lumière lorsque les souris sont plus actives. Ces différences représentent les altérations quotidiennes classiques du métabolisme qui se produisent chez les souris. Alors que dans cet exemple, nous avons divisé les données en blocs de 12 h, division des données de plus en plus petites époques de temps peut également être utile. Niveaux d’activité physique sont également un facteur qui contribuent à la dépense d’énergie. Ceux-ci n’étaient pas différents entre groupes, suggérant qu’une diminution de mouvement n’était pas le conducteur du phénotype obèse dans la haute teneur en graisses nourri de souris (Figure 5).
L’autre côté de l’équation de bilan énergétique est la quantité d’énergie qui est consommée et pénètre dans l’organisme. Pour regarder cet aspect du métabolisme, nous avons analysé la quantité de nourriture consommée des souris tandis que chez l’animal métabolique, système de surveillance. Comme peut être observé dans la Figure 6 a, les souris mangeaient la même quantité de nourriture telle que mesurée en poids ou lors de leur normalisation au poids corporel (Figure 6 b). (ANCOVA peut encore servir à évaluer l’impact du poids sur la prise alimentaire.) Normalisation de la prise alimentaire au poids corporel peut être une étape importante d’examiner si la dépense énergétique a également été normalisée au poids, gardant ainsi chaque côté de l’équation de l’énergie en équilibre. Alors que les souris a mangé la même quantité de nourriture, il est important de rendre compte de la densité d’énergie de chacun des régimes utilisés. Compte tenu de ce facteur, nous observons les souris sur le SIH consommant plus d’énergie (Figure 6) et de ces expériences, il est probable que c’est de conduire le phénotype obèse. C’est, étant donné que les souris prennent en plus d’énergie, mais ils ne dépensent pas proportionnellement plus d’énergie, leur obésité peut être attribuée au stockage de l’énergie.
Statistiques
Toutes les données dans le présent document sont présentées comme moyenne ± erreur-type de la moyenne (SEM). Signification statistique a été fixée à p < 0,05. * indique p < 0,05, ** indique p < 0,01, *** indique p < 0,001 et n = 6 par groupe, sauf indication. Les enquêteurs n’ont pas être aveuglés à l’intervention de groupe alimentaire en raison d’une différence de couleur des diètes. Les souris ont été choisis au hasard quant à quel régime, ils ont reçu.
Figure 1 : Mise en place correcte des coûts de la souris et porte-petit spécimen animale contenant la souris dans l’analyseur de composition corporelle. Pour effectuer un test du système à l’aide d’un étalon (frais) ou pour la numérisation des souris dans le porte-échantillon animal petit, placer chacun d’eux à l’intérieur du portique du système. Les flèches rouges indiquent le cylindre dans lequel les souris seront contenues dans le portique de la machine.
Figure 2 : Assemblée des chambres individuelles. A) Placez la trémie d’alimentation au centre de l’équilibre. B) insérer la plate-forme dans chaque chambre et lieu de la chambre sur la trémie. C) placer la souris dans les chambres individuellement et immobiliser le couvercle. D) positionner la bouteille d’eau et le fixer.
Figure 3 : Analyse de la composition du corps plus de 3 semaines d’un régime riche en graisses. A) poids corporel, B) graisse masse, C) pencher en masse, D) pourcentage en masse de graisse, E) gratuits de teneur en eau, et F) total de teneur en eau. Les cercles représentent le régime normal, carrés représentent HFD. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Paramètres métaboliques provenant de l’expérimentation système surveillance métabolique animale après 3 semaines des régimes respectifs. Souris ont été logés dans les chambres pendant 48 h avec les premières 24 h servant de familiarisation. Les données obtenues par le deuxième 24h a été analysées et présentées dans ces chiffres. A)2 taux de VO Raw, B) VO2 normalisé au poids corporel C) VO2 normalisée pour la masse maigre, D) dispersion pour non ajustés VO2 (période totale 24 h) à corps peser, t et E) non corrigées VO2 pour la masse maigre. A-C Les barres blanches représentent régime normal, les barres noires représentent régime riche en graisses. D-E Les cercles représentent le régime normal, carrés représentent HFD. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : A) le rapport d’échange respiratoire (RER), B) chaleur (dépense énergétique), et C) chaleur normalisé au poids corporel. D) des niveaux d’activité calculé comme la somme du déambulatoire, X et Y des faisceaux pauses et sauts de faisceau de Z. Les barres blanches représentent régime normal ; barres noires représentent HFD.
Figure 6 : Données sur l’apport alimentaire obtient dans le système pour la finale de 24 h. A) la prise alimentaire en grammes, B) apport alimentaire normalisé au poids corporel et C) l’apport énergétique calculée. n = 4-5 (3 souris ont été exclus en raison de faire un grand gâchis avec leur nourriture). Les barres blanches représentent régime normal ; barres noires représentent HFD. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Étapes critiques
Les protocoles décrits ci-après fournissent un exemple de façons de composition corporelle mesure et divers paramètres métaboliques chez la souris à l’aide d’un analyseur de composition corporelle et un animal métabolique, système de surveillance. Pour les deux techniques, il est extrêmement important de s’assurer que les machines fonctionnent de façon optimale, et pour ce faire, il est impératif que le chercheur effectue un test du système pour l’analyseur de composition corporelle et étalonne à une composition de gaz connus pour le métabolisme animaux surveillance système avant l’utilisation de l’équipement. Ceci assurera une plus grande cohérence des résultats et la possibilité de détecter les problèmes potentiels avec les machines.
La façon dont les données sont normalisées pour les suivi des expérimentations animales métaboliques est également primordial de s’assurer de la validité des résultats obtenus par la technique. Comme indiqué dans nos résultats représentatifs (Figure 4 a-E) VO2 peut être déclaré dans un certain nombre de différentes manières : son taux absolu (L/min), par rapport à la masse corporelle de la souris (mL/kg * min), soit par rapport à la masse maigre (mL/kgLBM * min) si ces données sont disponibles (par exemple provenant d’un analyseur de composition corporelle). Selon le phénotype, il peut être plus approprié de normaliser les valeurs de façon particulière pour écarter toute partialité potentielle. Par exemple, si un animal a augmenté la masse corporelle, ils ont plus de tissu qui est disponible et en mesure de consommer de l’oxygène et naturellement leur dépense énergétique est plus élevée. Normalisant à corps total masse peut être pas la meilleure option car il sera en biais vers l’observation d’une diminution de la consommation d’oxygène par unité de masse, même si la consommation d’oxygène des tissus ne peut pas être différente. Comme alternative à normaliser au poids corporel, on peut normaliser à la masse corporelle maigre de la souris. Comme la masse maigre, masse est principalement responsable de la consommation d’oxygène, et la masse maigre est généralement inchangée ou seulement légèrement différente entre groupes expérimentaux, normalisation de cette manière peut être une façon plus représentative d’exprimer les données2 VO. Il est à noter que le compartiment de masse maigre est composé de plusieurs tissus différents, tous avec différents métabolismes, et en conséquence normalisation de cette manière peut-être convenir pas et ne donne aucune indication dans quel composant masse maigre est de conduire le changement. En outre, il exclut la contribution de la masse grasse sur le métabolisme.
Compte tenu de ces problèmes, une méthode alternative de statistiques a également été proposé5,6. Analyse de covariance (ANCOVA) ) est un test statistique qui permet la comparaison d’une variable (par exemple, dépense d’énergie) à travers plusieurs groupes tout en corrigeant d’autres facteurs ou de variables appelées covariables. De cette manière des facteurs tels que poids, masse grasse et masse maigre peuvent figurer parmi les variables qui influencent la dépense d’énergie, mais même cette méthode a ses propres hypothèses spécifiques6, y compris le fait que l’utilisation de multiples variables dans ANCOVA est susceptible de il invalide à moins que les variables sont indépendantes de l’autre. Il semble y avoir aucun moyen simple parfait ou universellement acceptée pour normaliser et présent VO2 ou énergie données sur les dépenses, il peut être approprié afficher et présenter les données dans un certain nombre de façons de donner l’image plus claire du phénotype au lecteur. Niveaux d’activité physique peuvent augmenter la consommation d’oxygène, et donc chez les animaux qui ont des phénotypes de l’activité (une augmentation ou une diminution), il peut également être nécessaire de compte/normaliser des changements dans la circulation afin de déterminer si cela peut expliquer complètement ou partiellement tenir compte de tout changement de VO2.
Modifications et dépannage
Les résultats représentatifs affichés dans le présent protocole ont été extraites des expériences menées à une température ambiante de 21-22 ° C. La zone thermiquement neutre d’une souris est d’environ 30 ° C, donc dans une animalerie traditionnelle avec sa température réglée à 20-22 ° C pour le confort humain, une souris est soumise à un stress thermique. Pour contrer cela, non-frissons thermogenèse est activée à ces températures plus froides, ce qui entraîne l’accumulation sur une augmentation de 2 fois la dépense énergétique entre souris logé à 20 ° C par rapport à ceux logés à 30 ° C7. Le boîtier d’environnement de souris est une considération importante pour ces expériences comme il a été démontré que logement des souris à thermoneutralité peut potentialiser l’élaboration de certaines conditions telles que l’athérosclérose8 et riche en matières grasses régime alimentaire induite par pathogenèse de stéato stéatose hépatique (stéatose hépatique non alcoolique)9. Température ambiante est donc aussi un facteur important lorsqu’il procède à des expériences dans un animal métabolique, système de surveillance, comme un phénotype peut être présent à certaines températures, mais pas à d’autres, qui pourraient pointer vers un mécanisme potentiel de action. Un tel scénario pourrait être un phénotype qui implique l’activation de la graisse beige recrutée selon laquelle une plus grande quantité de ce tissu permet une augmentation plus grande thermogenèse sous refroidisseur conditions10. Ainsi, il peut être nécessaire de modifier l’environnement mis en place qui a été décrit dans ces expériences en cours et à effectuer des expériences sous plusieurs températures ambiantes pour obtenir une représentation exacte de la véritable situation métabolique du modèle. Pour le dépannage en raison d’erreurs techniques, il peut être nécessaire de contacter les fabricants directement pour instruction. S’il y a des problèmes avec ce type d’analyseur de composition corporelle, qu'il est recommandé d’effectuer un test de répéter l’analyse, qui s’étend de 25 balayages contre le coût. La compagnie aura besoin de cette information pour le diagnostic. De même avec le système de surveillance animal métabolique, si des problèmes surviennent, collecter les fichiers de données depuis la dernière fois que le système a bien fonctionné et les fichiers de quand les problèmes sont apparus pour que la prise en charge peut faire un diagnostic probable.
Limites
Alors que l’analyseur de composition corporelle fournit excellentes données sur l’accumulation de graisse corporelle, elle ne permet pas pour la détermination des dépôts adipeux régionales. Ceci est important dans le domaine de la recherche sur l’obésité, car pas toute la graisse est la même chose, avec l’emplacement de la graisse accumulée et ses propriétés fonctionnelles étant particulièrement important. En effet, les effets protecteurs de dépôts de graisse sous-cutanée (ou fat métaboliquement sain) ont été décrits11. Micro-la tomodensitométrie (micro-CT) peut distinguer sous-cutané et viscéral fat12, possible de l’analyse de l’imagerie par résonance magnétique (IRM)13. Utilisation de ces techniques peut fournir des informations complémentaires sur le site de l’accumulation de tissu adipeux. L’animal métabolique, système de surveillance aussi a ses limites. Alors que la dépense d’énergie quotidienne totale peut être mesurée, le système n’est pas capable de discerner entre les différents éléments qui composent la dépense d’énergie. Une autre limitation du système est qu’il est possible que l’obésité peut se développer sans une diminution mesurable dans la dépense d’énergie détectée par l’intermédiaire de ces types de systèmes, même indépendamment des altérations de l’apport alimentaire/énergétique. Des études ont montré que légères diminutions dans les dépenses d’énergie, qui sont suffisamment importantes pour provoquer un poids significatif gain à long terme, ne peuvent être détectés avec force dans de tels systèmes métaboliques sur le court terme14,,15, 16. Alors que nous avons utilisé un n de 6 par groupe dans cette étude pour démontrer cette méthodologie comme une étude de l’exemple, pour détecter de petites différences dans la dépense d’énergie qui pourraient contribuer à l’obésité probable exige beaucoup plus de souris5. Progrès dans la résolution de détection dans ces systèmes et la capacité d’exécuter ces types d’études sur une période plus longue facilitera la capacité de détecter ces changements plus petits mais importants. En ce qui concerne la mesure de la prise alimentaire, nous avons généralement observé que la prise alimentaire chez les souris logé dans l’animal métabolique, système de surveillance 24h est inférieure serait observée dans la cage, probablement pour les raisons susmentionnées. Par conséquent, en plus du suivi consommation de nourriture dans ce système, nous évaluons plus prise de nourriture dans les cages chez des souris. Alors que cela n’est possible dans une situation où les souris appartenant à certains groupes expérimentaux sont logés séparément, il a l’avantage de permettre près évaluation quotidienne continue. L’enquêteur a simplement pèse la quantité de nourriture dans la trémie à un moment précis de la journée, toujours comptables pour se nourrir, dispersé à travers la cage et divise ensuite ce montant total de la nourriture consommée par le nombre de souris présents dans la cage.
Applications futures
Alors que dans cette revue, nous avons utilisé l’obésité acquise par l’intermédiaire de l’alimentation à titre d’exemple d’un état de maladie où la mesure de composition corporelle et des paramètres métaboliques sont utiles, que l’usage de cet équipement est loin de limité à ce domaine de recherche riche en graisses. L’utilisation de ces techniques est également valable lorsque l'on étudie les maladies comme le diabète, les maladies cardiovasculaires, sarcopénie liée à l’âge, fragilité, cachexie cancéreuse, dystrophies musculaires et la lipodystrophie. Alors que le coût initial d’achat de ces infrastructures est considérable, la capacité d’utiliser l’équipement à travers de multiples et divers champs de la recherche médicale atténue ce coût initial. En outre, le réactif en cours et les coûts de consommables sont minimes pour ces machines ; Cependant, entretien préventif et entretien doivent considérer et budgétisés pour.
A l’instar de la masse maigre obtenue par analyse de composition de l’organe peut être un facteur important de normalisation pour la consommation d’oxygène provenant de l’animal métabolique, système de surveillance, détermination de la masse maigre permet également de normaliser les doses de médicament/test. Par exemple, dans les études de métabolisme, il est courant d’effectuer un test de tolérance au glucose intrapéritonéal ou par voie orale (GTT), ou un test de tolérance d’insuline intrapéritonéale (ITT). Ces tests d’examiner la possibilité d’une souris pour disposer d’une charge de glucose ou de répondre à l’insuline. Modifications de la glycémie en réponse à ces tests fournit des informations sur le niveau de glucose de l’organisme entier et tolérance de l’insuline dans le modèle. Traditionnellement, le bolus d’insuline et de glucose administré lors de ces essais est dosé selon le poids du corps de la souris. Cependant, comme les modèles de l’obésité s’accumuler la masse grasse au fil de la masse maigre, dosage par poids corporel pourrait biaiser le modèle plus lourd vers l’intolérance au glucose dans un GTT qu’ils reçoivent plus de glucose. Cela est dû au fait que les organes foie, muscle squelettique et le cerveau, qui disposent de la majorité du glucose à l’état post prandiale17, sont des éléments de la mesure de masse maigre et rarement ou légèrement change dans la plupart des modèles. À l’inverse, dans une ITT lorsque dosé au poids corporel, un modèle plus lourd qui recevrait plus d’insuline peut apparaître plus sensible pour le glucose, réduisant les effets de l’insuline simplement parce qu’il a reçu une plus grande quantité. Par conséquent, si l’enquêteur a accès aux données de composition de corps, la masse maigre peut être la mesure la plus appropriée, par opposition à la masse corporelle, pour ces calculs de dose18. Prenant cela encore, données de massives maigres obtenues par l’analyse de composition de corps pourraient également servir à la dose de médicaments expérimentaux si nécessaire pour tenir compte de la masse maigre, à l’exclusion de la masse grasse. Une autre application de l’animal métabolique, système de surveillance qui n’a pas été examinée ou démontrée dans ce manuscrit est d’y attacher un tapis de course motorisé fermé au système afin que les paramètres métaboliques discuté ci-après peut également être mesuré au cours exercice.
Les procédures décrites dans cet article peuvent être utilisés pour caractériser la composition corporelle et divers paramètres métaboliques chez les souris. Ces mesures s’appliquent à un large éventail de domaines de recherche et peuvent fournir des informations importantes pour la caractérisation d’un phénotype. Données tirées de ces méthodes peuvent également indiquer que vers des mécanismes sous-jacents, conduisant à un phénotype métabolique particulière. Poursuite du développement et le raffinement de ces technologies permettra aux chercheurs d’avancer leurs conclusions vers des résultats thérapeutiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions le personnel de la recherche médicale Alfred et équipe éducation Precinct Animal Services (AMREP AS) pour leur assistance et l’entretien les souris utilisées dans cette étude et pour la prise en charge du schéma opérationnel Infrastructure prend en charge de l’état de l’époque victorienne Gouvernement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 in 1 system | EchoMRI | 4 in 1 system | Whole body composition analyser |
| Canola oil test sample (COSTS) | EchoMRI | Mouse-specific (contact company for cat number) | |
| Animal specimen holder | EchoMRI | 103-E56100R | |
| Delimiter | EchoMRI | 600-E56100D | |
| 12 chamber system | Columbus Instruments | Custom built | Metabolic Caging System; includes control program |
| Drierite | Fisher Scientific | 238988 | CLAMS consumable |
| Calibration gas tank | Air Liquide | Mixed to order | Gas calibration (0.5% CO2, 20.5% O2, balance nitrogen). |
| Normal chow diet | Specialty Feeds | Irradiated mouse and rat diet | |
| High fat diet | Specialty Feeds | SF04-001 | |
| Balance | Mettler Toledo | PL202-S | Balance for weighing mice |
| TexQ Disinfectant spray | TexWipe | ||
| Hydrogen Peroxide cleaning solution | TexWipe | TX684 |
References
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