Summary
Этот протокол описывает использование анализатор состава тела и метаболических животных системы мониторинга характеризовать состав тела и метаболических параметров у мышей. Для применения этих методов в качестве примера используется модель ожирения, вызванных высоким содержанием жиров питание.
Abstract
Изменения в составе тела (fat или мышечной массы), метаболических параметров, таких как потребление кислорода всего тела, затрат энергии и использование подложки и поведения, например, питания и физической активности могут обеспечить важную информацию относительно основных механизмов болезни. Учитывая важное значение состава тела и метаболизм в развитие ожирения и его последующие осложнения, это необходимо сделать точные меры этих параметров в параметре доклинических исследований. Достижения в области технологий за последние несколько десятилетий сделали возможным для получения этих мер в моделях грызунов в неинвазивные и продольные моды. Следовательно эти метаболических меры оказались полезными при оценке ответа генетических манипуляций (например нокаут или трансгенных мышей, вирусный нокдаун или гиперэкспрессия генов), экспериментальных наркотиков/соединение скрининг и диетическое, поведенческих или физической активности вмешательств. Здесь мы описываем протоколы, используемые для измерения состава тела и метаболических параметров с помощью системы в Чоу кормили высоких жира диета кормили мышей и мониторинга животного.
Introduction
Метаболизм подкрепляет многие аспекты нормального клеточного, орган и физиологии всего тела. Следовательно в параметре различных патологий, изменения метаболизма может непосредственно способствовать базового условие или могут негативно повлиять как побочный эффект патологии. Традиционно метаболические и исследований в энергетический баланс были сосредоточены на области ожирения и соответствующих условий, таких как сопротивление инсулина, заранее диабет, глюкозы нетерпимость, сердечно-сосудистые заболевания и диабет. Это исследование является оправданным ввиду эскалации распространенности таких условий во всем мире и индивидуальных, социальных, и экономических издержек этих условий нанести. Таким образом развитие превентивных стратегий и новых терапии ожирения целевой является постоянной целью в исследовательских лабораториях во всем мире и доклинические мыши модели сильно полагаться на эти исследования.
В то время как взвешивание мышей обеспечивает надежную оценку веса или потери, он не обеспечивает разбивку различных компонентов, которые составляют всего тела композиция (жировой массы, мышечной массы, свободной воды, а также других компонентов, таких как мех и когти). Весом жировых отложений на завершение исследований, когда мышь умершего обеспечивает точное измерение различных жировых отложений, но может предоставить только данные для точки один раз. Как следствие часто бывает необходимо зарегистрировать несколько когорты для изучения развития ожирения в течение времени, значительно увеличение поголовья, время и затраты. Использование двойного энергии рентгеновская абсорбциометрия (DEXA) обеспечивает подход к оценке содержимого тела жира и мышечной ткани и позволяет исследователю для получения данных в продольные моды. Однако эта процедура требует мышей наркотизированных1, и повторяющиеся приступы анестезии могут повлиять накопления жировой ткани или повлиять на другие аспекты метаболических регулирования. EchoMRI использует relaxometry ядерного магнитного резонанса для измерения жира и мышечной массы, бесплатная вода и общее содержание воды. Это достижимо благодаря созданию контраст между компонентами различных тканей, с различиями в продолжительности, амплитуда и пространственного распределения созданного радиочастот, позволяя определение и количественная оценка каждого типа ткани. Эта техника является выгодным, как это неинвазивный, быстрый, простой, не требует анестезии или радиации и, главное, позитивно протестирована против химического анализа2.
Ключевым моментом ожирения и связанных с ними исследований является уравнение баланса энергии. Хотя накопление жира является более сложным, чем чисто энергии (пищи) против энергии из (расход энергии), они являются жизненно важными факторами, чтобы иметь возможность измерить. Ежедневные расходы энергии будет в общей сложности четыре различных компонентов: (1) расходы базальной энергии (метаболизма); (2 расходы энергии за счет теплового эффекта потребления продовольствия; (3) энергии, необходимой для терморегуляции; и (4) энергию потратил на физической активности. Как расходование энергии генерирует тепло, измерения производства тепла животное (известный как Прямая калориметрия) может использоваться для оценки расходов энергии. Кроме того измерение вдохновил и истек концентрации O2 и CO2, что позволяет для определения всего тела O2 потребления и производства CO2 , могут быть использованы как способ косвенно измерить (косвенные калориметрия) тепла производства и поэтому рассчитать расходы энергии. Увеличение потребления пищи или сокращение расходов энергии будет предрасполагают мышей к увеличению веса и наблюдения за изменениями в этих параметров может дать полезную информацию, вероятно механизмов действий в конкретных моделях ожирения. Связанные метаболических параметр интерес — коэффициент дыхательных путей обмена (RER), показатель доли субстрата/топлива (т.е., углеводов или жиров), переживает метаболизм и используются для производства энергии. Следовательно измерение потребляемой пищи (потребляемой энергии) в сочетании с уровни физической активности, O2 потребления, RER и расходование энергии может обеспечить широкое понимание профиля метаболизм организма. Один из методов для сбора таких данных является использование всеобъемлющего лабораторных животных, мониторинга системы (МОЛЛЮСКИ), которая базируется на косвенные калориметрии метода для измерения расходов энергии и имеет дополнительные возможности определения уровней физической активности (луч перерывы) и потребление пищи через весы включены в измерительной камеры.
В этом протоколе мы предоставляем прямой описание использования анализатор состава тела для оценки состава тела в мышей и метаболических животных системы мониторинга для определения аспекты метаболизма. Соображения и ограничения для этих методов будет обсуждаться, а также предлагаемые методы анализа, интерпретации и представления данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты описал были утверждены Комитетом Альфред медицинских исследований образования участковых животных этики (AMREP АЭС) и мышей были предоставлены гуманной помощи с учетом национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (NHMRC) Австралии руководящих принципов Экспериментов на животных. Животные были в ведении их предписанные диеты и воды ad libitum и размещается в среде с контролируемой температурой (~ 21-22 ° C) с свет 12 h и 12 h темноте циклом. Семь неделя старый самцов мышей (на фоне C57Bl/6J) были откармливаются либо регулярные нормального Чоу (состоящий из 76% кДж от углеводов, 5% жира, белка 19%; см. таблицу материалы, энергия содержимого 14.3 МДж/кг) или для группы высокого кормления жиров, высоким содержанием жиров диеты (HFD) ( энергии содержание 19 МДж/кг, состоящий из 36% кДж из углеводов, жиров 43%, 21% белка, каналы специальности) за 3 недели. Вес тела и измерений состава тела с помощью EchoMRI машины были сделаны за неделю в то время как Метаболический Анализ мониторинга имели место в МОЛЛЮСКОВ после 3 недели диеты.
1. Процедура анализатор состава
Примечание: Для оптимального функционирования, EchoMRI 4-в-1 используется в настоящем протоколе должны содержаться в комнату, где температура воздуха является стабильной и не колебаться. В идеале это должна постоянно контролироваться. Перемещение машины и перерывы к власти также следует по возможности избегать. Если блок питания была прервана, и система должна быть перезапущена, позволяют по крайней мере 2-3 ч для машины, чтобы разогреть прежде чем использовать его снова. Перед началом, убедитесь, что вы носите правильные средства индивидуальной защиты.
- До начала сканирования мыши, выполните тест системы на машине анализатор состава тела. Это включает использование стандарт калибровки (упоминаемый как рапсовое масло системы испытательный образец (расходы)) проверить точность этого документа и чтобы убедиться, что там было без дрейфа в ее точности.
- Откройте системного программного обеспечения, затем нажмите кнопку панели инструментов системы тестирования или нажав «Alt + Y» одновременно.
- Прежде, чем испытание системы осуществляется на компьютере, подождите напоминание, чтобы проверить, что правильно затраты (в данном случае мыши-расценки) помещен внутри Гантри системы ( рис. 1). После подтверждения, что это действительно так, согласиться продолжить тест, который займет несколько минут для завершения.
- После того, как был принят системный тест, вперед продолжите сканирование.
- Если тест системы не удается, повторите тест системы.
- Если машина продолжает оставаться вне диапазона (указывает, что произошло отклонение), калибровка может быть необходимо исправить ситуацию. Выполните это, следуя указаниям или как описано в руководстве пользователя, предоставленное во время покупки. Если проблема не устранена, проверьте руководство3 или сообщить о проблеме в службу поддержки производителя и получить дальнейшие инструкции.
- Место мыши в держатель мелких животных образца (длинный цилиндр) держать их содержащихся в машине. Чтобы сделать это, поместите держатель горизонтально, подобрать мышь и сначала вставьте его в отверстие головки блока цилиндров. Медленно и тщательно принести держателя в вертикальное положение так, чтобы указатель мыши находится в нижней части цилиндра и готовы для анализа.
- Однажды в держатель, Вставьте разделитель для ограничения движения мыши во время измерения периода. В некоторых случаях, с чрезвычайно активные мышей может быть необходимо держать разделитель в месте с пальца.
Примечание: Ознакомить мышей с размещением в держатели образца до их первоначального анализа для снижения стресса. Использование красного цвета животных образца держателя может также уменьшить потенциальной реакции на стресс, как мышей считают, что они находятся в темноте. - В рамках программного обеспечения выберите папку (Папка инструментов) для сохранения данных и создать имя файла.
- При необходимости, уменьшить количество случайный шум в жировой и мышечной измерений путем увеличения числа первичных скоплений сканирования. После запуска программного обеспечения первичного накопления установлено рекомендуемое значение по умолчанию для общего ежедневного использования; Если нет особых причин для изменения этих параметров, параметры по умолчанию даст необходимый уровень точности для пользователей.
- Если вы не заинтересованы в получении данных для свободной воды и воды, выключите воду стадии, выбрав вкладку, чтобы сказать нет. Это будет значительно сократить длительность проверки и повысить пропускную способность.
- Инициировать сканирование, выбрав «начать проверку» или нажав клавишу F5 на клавиатуре. Введите все необходимые данные о животных (например, животное ID, массы тела, и т.д.) и нажмите «ОК» или клавишу F5, чтобы начать проверку, которая займет около 1 мин.
- После того, как были получены данные, удалите держателя животного, содержащие мыши из машины и место животных обратно в своей клетке. После того, как все животные были отсканированы, экспортируйте данные для дальнейшего анализа и сортировки.
- До и после использования тщательно очистите животных Держатели согласно инструкциям производителя. Как эти держатели изготавливаются из акрилового пластика, изопропиловый спирт этиловый спирт следует избегать и как они могут вызвать растрескивание владельцев и/или быстрое ухудшение держателя, тем самым увеличивая вероятность поломки. Вместо этого используйте теплую воду для мытья посуды решения или, если требуется дальнейшее дезинфицирующее, используйте F10 (при разбавлении колера) или других дезинфицирующим или чистящие аэрозоли, (см. Таблицу материалы) и затем вытереть.
2. метаболические животное процедуры системы мониторинга
Примечание: Система требует ~ 2 h для разминки и стабилизации. Если компьютер был выключен, он должен быть включен чтобы позволить циркония ячейку, чтобы быть нагрета до 725 ° C. Также мы обычно место мышей в анализатор состава тела предыдущий день до ввода системы мониторинга животного чтобы избежать любых проблем с сдержанность стресса.
- Убедитесь компьютере, подключенном к системе мониторинга животного и открыть программу управления. Выберите параметр «Oxymax Utility» из меню инструментов инициировать насосов.
- Заполнить бутылки воды с соответствующим водой, взвесить и проверить здоровье мышей и организовать питание. Если измерение потребления пищи в системе, рассмотрим растиранием пищи. Заполните пищи бункера, удручает подпружиненной платформы и кончик еда в воронку. Убедитесь, что еда Хоппер и бутылка воды полностью обеспечить, что есть достаточно пищи и воды в прошлом отведенное время экспериментальных.
- Проверить статус drierite/осушитель; Если цвет индикатора, он должен быть синий и поэтому сухой, но если это Розовый/Пурпурный, он имеет значительные влаги поглощения и следует заменить или пополнить.
- Проверьте состояние ловушки аммиака и известково и при необходимости замените. Если в ловушку аммиака подключен два в то время, когда вторая ловушка показывает признаки изменения цвета, заменить первый. Увеличение CO2 смещение также может означать необходимость замены извести соды.
Примечание: Осушитель можно сушить в духовке и повторно, однако мы следовать рекомендациям производителя системы использовать свежий каждый раз. - Соберите камер. Для этого, место пищи бункера на баланс, затем поместить камеру на вершине с перфорированной платформу, которая становится Пол камеры вставляется. Осторожно поместите курсор мыши в камере и наденьте крышку системы с передней и клипы и храните до позиционирования бутылку воды и крепления. В качестве меры предосторожности, повторно проверьте все крышки камеры, мыши и воды (рисунок 2A-D).
Примечание: В зависимости от размера мышей рассматривается, это может быть необходимо отрегулировать высоту пространства выше Хоппер еда так что мышей имеют доступ к пищу, но не хватает пространства, что они могут спать прямо на вершине кормушки. - Как это было рекомендовано, что газовые датчики калибруются перед каждой эксперимент, калибровки системы.
- Используйте газ известные композиции (0,5% CO2, 20,5% O2, баланс азота). Подключите калибровки бензобака к системе через регулятор и шланг. Включите и обеспечить выходного давления бак является чтение 5-10 psi.
Примечание: Некоторые системы будет иметь второй танк, шланг и регулятор для использования чистого азота как «смещения» газ. Система, которую мы работаем использует вместо извести соды для создания свободного воздуха CO2 . - Выполните процедуры для калибровки O2 и датчики CO2 . Выберите «Калибровка» из меню Сервис и последовательно калибровки O2 и CO2. Перед калибровки убедитесь, что пример 1) и ссылку потоков 0.400 LPM, датчик температуры 2 циркония O2 725 ° C (± 1 ° C), 3) образца и ссылка сушилка и воздушные насосы находятся на, и 4 газ калибровка придает и включен.
- При необходимости, когда калибровка датчика2 O, слегка отрегулируйте смещение элемента управления на передней части датчика кислорода циркония для достижения значение коэффициента2 O 1,0000 (± 0.0002). Это чтобы убедиться, что он находится в допустимых пределах (выделены зеленым шрифтом в программного обеспечения отображения на экране компьютера).
- После успешного O2 и калибровка датчика CO2 выключить газовый баллон калибровки и отсоединить шланг от регулятора. После калибровки,2 O для ведения воздуха (атмосферного) следует читать 20.92 (± 00.02). Если калибровка из терпимости, повторить и относятся к неисправности гиды от производителя. В противном случае обратитесь к изготовителю для получения дальнейших инструкций.
- Используйте газ известные композиции (0,5% CO2, 20,5% O2, баланс азота). Подключите калибровки бензобака к системе через регулятор и шланг. Включите и обеспечить выходного давления бак является чтение 5-10 psi.
- Перейти к экспериментальной установки. Выберите «экспериментальная файл открыть» из меню «эксперимент». Выберите соответствующий шаблон (например, мышь). Под «Настройка» в меню «эксперимент» определяют параметры эксперимента, которые должны быть записаны (например, мыши ID, веса, группа и т.д.) отменить выбор любой камеры не в использовании и выберите место для эксперимента, чтобы спастись.
- Обеспечивать весы были тарированного если измерения потребления пищи и начать захват данных, выбрав «Запуск» в меню «эксперимент». Данные регистрируются на разные сроки в зависимости от фенотип, институциональных руководящих принципов на животных изоляции и использования системы.
Примечание: В наших руках, регулярно эксперимента в течение 48 часов, с первой 24 h используется как акклиматизации в новой среде и второй 24 h, используемых для анализа данных. Период сбора данных на основе как долго следователь хочет держать их мышей поодиночке жильем и зависит от одобрения животных этики. Кроме того если существуют положения, мышей может прижились в камерах до помещены в систему и подключен. Каждая палата измеряется приблизительно раз в 13 мин, когда 12 камерная система используется. - Регулярно проверяйте и результаты, которые получены в то время как мыши в системе для обеспечения благополучия животных и что соответствующие данные собираются. Любой вопрос может быть могут быть определены на данном этапе и исправить. Проверить на каждой мыши, ежедневно утром и вечером, когда они находятся в системе.
- Проверьте метаболических вкладки в верхней части страницы файла данных для данных, собранных в реальном времени для каждой мыши в отношении потребления, RER и энергии расходы кислорода. Тем временем, луч перерывы и данные о потреблении продуктов питания могут быть расположены в активность и питание вкладок, соответственно. Проверьте, что «O2 в» чтение вокруг 20.90-20.94, «CO2 в» составляет около 0,040 - 0.050, RER между 0,7 и 1, а скорость потока постоянна на 0,5 - 0,6 Л/мин.
- На регулярной основе проверьте что мышей имеют доступ к продовольствию и воде, и что они потребляют каждый. Убедитесь, что они не демонстрируют каких-либо признаков бедствия как копать в перфорированного настила. Кроме того отслеживать результаты, которые отображаются.
- По завершении экспериментальных отведенное время, выберите «остановить» из меню «эксперимент» и экспортировать результаты (CSV-файлы, файл > Экспорт > создать тему CSV) для анализа.
- Проверьте здоровье мышей, взвесить их и затем вернуться в их дома клетки.
- Мышь может быть враждебными друг к другу после разделения, поэтому контролировать после того, как они размещаются вместе снова.
- Разбирать клетки, удалить избыток продовольствия из бункеров и наконечник из фекалий, мочи и питание от клетки. Погружаться бутылки и sippers в разбавленный раствор T-bac, замочить и чистой других компонентов в растворе разбавленных отбеливатель. Промойте чистой водой и оставить воздух сухой.
- Вычислить метаболических параметров с программным обеспечением. Программное обеспечение использует ряд уравнений для предоставления окончательных данных выход4.
Для расчета потребления и двуокиси углерода производства кислорода: потребление кислорода: VO2 (LPM)= V,яO2i - VoO2o; Производство двуокиси углерода: VCO2 (LPM)= VoCO2o-V,яCO2i
Где: V,я = скорость ввода вентиляции (LPM), Vo = производительность вентиляции (LPM), O2i = O2 концентрация на вход, O2o = O2 концентрация на выходе, CO2i = CO2 концентрация на вход, CO2o = концентрация CO2 на выходе.
Для расчета RER: RER = VCO2 / VO2. Обратите внимание, что окисление белков не измерялась и поэтому RER не была скорректирована для этого.
Для расчета энергии расходов: расходы энергии: CV = 3.815 + 1.232* RER
Жара (ккал/ч)) = CV * VO2. Где: CV-теплотворная способность (отношения между тепла и объем потребления кислорода). Это происходит от «элементы из науки питания» ссылаются как на Table ласк, входят Грэм ласк.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Типичные изменения отображены результаты, показано на рисунке 3 в параметров состава тела при высоких жиров питание, измеренного через EchoMRI. В начале был никакой разницы в любой параметр измеряется (рис. 3A-F). Однако после всего 1 неделю высоким содержанием жиров питание, было значительное увеличение массы тела, жировой массы, а массы жира в группе HFD (рис. 3а,B,D). Величина различий между двумя группами для этих мер продолжает расти над 3 недели диетического вмешательства. Мышечной массы, бесплатная вода и содержание всего воды (рис. 3 c,E,F) не отличались между группами в любой момент времени. Можно также увидеть, что Чоу кормили мышей, продолжали набирать вес за период исследования (Рисунок 3А) и что это было за счет увеличения мышечной массы (рис. 3 c), а не жировой массы увеличение (рисунок 3B).
Как можно увидеть на рисунке 4, три недели высокой жира кормления привело к ряду изменений, обнаруженных в метаболизм животных, системы мониторинга. VO2 когда не корректируется с учетом массы тела был значительно выше в более высоким содержанием жира, кормили мышей (рис. 4A). В частности нормализации VO2 через две различные факторы привели к две разные результаты. Нормализация веса всего тела, привело к никакой разницы в VO2 между стандартным Чоу кормили и высоким содержанием жира кормили мышей, в то время как нормализации для мышечной массы производятся значительные различия (рис. 4б,C). Эти результаты показывают, что нормализация VO2 данных путем деления массы переменных существенно влияют результаты, и следует проявлять осторожность при толковании данных VO2 , когда он выражается таким образом. Подробное обсуждение о том, как выразить VO2 данных и последствия нормализации различными параметрами увидеть потрясающе дискуссии в Tschop, et al. 5 в их руководстве анализ мыши энергии метаболизма, Tschop и коллеги предлагают использование анализа совместно дисперсии (ANCOVA) статистически допросить эффекты веса тела или состава тела на расходование энергии и данные о потреблении продуктов питания . В этом случае выполнение ANCOVA на данных показано на рисунке 4A, с использованием веса тела как залежки, показывает, что статистически значимой разницы не существует между нормальной Чоу и HFD, таким образом что указывает после учета веса тела, никаких различий в потреблении кислорода между группами. Этот результат может быть легко визуализировать при печати VO2 против веса тела как рассеяния, как показано на рисунке 4 d. Заговор против веса тела (рис. 4 d) VO2 показывает, что VO2 данные лежат на общей линии связи с веса тела, с тяжелее животных, потребляющих больше кислорода. Следует отметить заговор против мышечной массы VO2 показывает, что данные VO2 лежат на две отдельных линии связи с мышечной массы (Рисунок 4E).
RER был значительно ниже в высоких жиров, кормили мышей, указанием жира использования углеводов использования когда кормили высоких жиров (Рисунок 5A). Расход энергии (тепла) без нормализации было увеличено в тяжелее животных, скорее всего из-за животных, имеющих более метаболически активные ткани (Рисунок 5B), с этой разницей, утрачивается после нормализации веса тела (рис. 5 c). Также, обратите внимание, увеличение VO2, RER и энергетических расходов в темной цикла по сравнению с свет цикла, когда мышей более активны. Эти различия представляют собой классического ежедневных изменений в метаболизм возникающие у мышей. В этом примере, мы разделили данные на блоки 12 h, разделение данных далее на меньшие время эпохы также может быть полезным. Уровни физической активности также являются фактором, способствуют расходование энергии. Это не отличались между группами, предполагая, что уменьшение в движении не был водителем ожирением фенотип в высоких жиров, кормили мышей (рис. 5 d).
С другой стороны уравнения баланса энергии это количество энергии, которая потребляется и попадает в организм. Взглянуть на этот аспект метаболизма мы проанализировали количество пищи, что мышей потребляется в метаболизм животных, система мониторинга. Как можно наблюдать в рисунке 6A, мышей ели то же количество пищи, как измеряется по весу или при нормализации веса тела (на рисунке 6B). (ANCOVA, снова может использоваться для оценки воздействия массы тела на потребление пищи). Нормализация пищи веса тела может быть важным шагом для рассмотрения, если расходы энергии также были нормализованы к весу, таким образом сохраняя каждой стороны уравнения энергетического баланса. В то время как мыши съели то же количество пищи, важно для учета плотности энергии каждого из используемых диеты. Когда принимая во внимание этот фактор, мы наблюдаем мышей на HFD, потребляют больше энергии (рис. 6 c) и от этих экспериментов вполне вероятно, что это сводит ожирением фенотип. Это, так как мышей принимают больше энергии, но они не являются пропорционально тратить больше энергии, может объясняться их ожирения для хранения энергии.
Статистика
Все данные в настоящем документе представлены как среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). Статистическая значимость была установлена на уровне p < 0,05. * Указывает p < 0,05, ** указывает p < 0.01, *** указывает p < 0,001 и n = 6 для каждой группы, если не указано. Следователи смогли быть ослеплен диетическую группу вмешательства из-за разницы в цвета диет. Мышей были случайно выбраны, о том, какой диеты они были даны.
Рисунок 1 : Правильное размещение мыши затрат и держатель мелких животных образца, содержащий мышей с анализатором состава тела. Выполнить проверку системы с помощью стандартного калибровки (расходы), или для сканирования мышей в держатель образца мелких животных, место каждого внутри Гантри системы. Красные стрелки показывают цилиндр, в котором будет содержаться мышей, ввод Портальные машины.
Рисунок 2 : Собрание отдельных камер. A) место Хоппер еда в центре баланса. B) вставить платформы в каждой камере и место камеры над бункером. C) место мышей в камерах индивидуально и закрепите крышку. D) положение бутылку воды и закрепите.
Рисунок 3 : Тела анализа состава за 3 недели высоким содержанием жиров. A) вес, B) жировой массы, C) lean массы, D) массовой доли жира, E) бесплатно содержание воды, и F) всего содержание воды. Круги представляют Чоу нормальной диете, квадраты представляют собой HFD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Метаболических параметров, полученные из метаболических экспериментов животных системы мониторинга после 3 недель соответствующей диеты. Мышей были размещены в камерах для 48 ч с первых 24 ч, действуя в качестве ознакомления. Данные, полученные из второй 24 h проанализированы и представлены в эти цифры. A) Raw VO2 ставки, B) VO2 нормализации веса тела C) VO2 нормированы мышечной массы, D) весят рассеяния для нескорректированные VO2 (всего 24 h период) для тела, t и E) нескорректированные VO2 мышечной массы. A-C Белые бары представляют нормальной Чоу диета, черные полосы представляют собой высоким содержанием жиров. D-E Круги представляют Чоу нормальной диете, квадраты представляют собой HFD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : A) дыхательной коэффициент обмена (RER), B) тепла (энергии расходы), и C) тепла, нормализации веса тела. D) уровни активности рассчитывается как сумма амбулаторных X и Y пучка перерывов и Z луч перерывов. Белые бары представляют Чоу нормальной диете; черные полосы представляют HFD.
Рисунок 6 : Данные о потреблении продуктов питания, полученных в системе для финала 24 h. A) пищи в граммах, B) пищи, нормализации веса тела и C) вычисляемые калоража. n = 4-5 (3 мышей были исключены из-за большой беспорядок с их питание). Белые бары представляют Чоу нормальной диете; черные полосы представляют HFD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важнейшие шаги
Протоколы, описанные здесь, представляют собой пример способов измерения состава тела и различных метаболических параметров в мышей, используя анализатор состава тела и метаболических животных, система мониторинга. Для обоих методов критически важно для обеспечения оптимально работают машины, и для этого, важно, что исследователь выполняет тест системы для анализатор состава тела и калибруется в состав известного газа для метаболических животных мониторинга системы до использования оборудования. Это обеспечит большую согласованность результатов и возможность для выявления любых возможных проблем с механизмом.
Способ, в котором данные нормируется для метаболического контроля эксперименты на животных также жизненно важное значение для обеспечения достоверности результатов, полученных из метода. Как указано в наших представителя результаты (рис. 4A-E) VO2 могут сообщаться в ряде различных способов: его абсолютная скорость (Л/мин), по отношению к массе тела мыши (мл/кг * мин), или по отношению к мышечной массы тела (мл/кгLBM * min) Если данные доступны (например, полученные из анализатор состава тела). В зависимости от фенотипа может быть более подходящим, нормализовать значения определенным образом, чтобы исключить любой потенциальной предвзятости. Например если животное увеличение массы тела, они имеют больше ткани, которая предоставляется возможность потреблять кислород и естественно их энергии расходы выше. Нормализации для всего тела масса не может быть лучшим вариантом как он будет смещения к наблюдения снижение потребления кислорода на единицу массы, несмотря на то, что потребление кислорода тканей не могут быть различными. В качестве альтернативы для нормализации веса тела один можно нормализовать мышечной массы тела мыши. Как lean ткани масса отвечает главным образом за потребление кислорода, и мышечная масса обычно неизменными или только незначительно различается экспериментальных групп, нормализации таким образом может быть более представительным способом выражения VO2 данных. Следует отметить, что мышечной массы отсека состоит из многих различных тканей, все с различными метаболизма, и следовательно нормализации таким образом могут не быть уместным или предоставить любую информацию в которой мышечной массы компонент является движущей изменения. Кроме того она исключает вклад жировой массы компонента на метаболизм.
Учитывая эти вопросы, альтернативный метод статистически на основе был также предлагаемый5,6. Анализ ковариации (ANCOVA) является статистический тест, который позволяет сравнение переменной (например, расход энергии) по нескольким группам при коррекции для других факторов или переменные называют ковариат. В этой форме такие факторы, как вес тела жировой массы и мышечной массы могут быть включены как переменные, которые влияют на расходы энергии, но даже этот метод имеет свои собственные конкретные допущения6, включая тот факт, что использование нескольких переменных в ANCOVA скорее всего аннулировать его, если переменные являются независимыми друг от друга. Там, как представляется, не идеальный или общепринятого единого способа нормализовать и настоящем VO2 или энергии данных о расходах, она может быть целесообразным отображения и представления данных в ряде способов, чтобы дать читателю ясное представление о фенотипа. Уровни физической активности может увеличить потребление кислорода, и поэтому в животных, имеющих активности фенотипов (увеличение или уменьшение), он также может быть необходимо нормализовать счета/изменения в движение, чтобы определить, если это можно объяснить частично или полностью Учетная запись для изменения VO2.
Модификации и устранение неполадок
Представитель результаты, отображаемые в этом протоколе были получены из экспериментов, проведенных при комнатной температуре 21-22 ° c. Термонейтральной зона мыши находится около 30 ° C, поэтому в традиционном доме животных с его температуры, равным 20-22 ° C для человеческого комфорта, мыши ставится под теплового стресса. Чтобы противостоять этому, не дрожи термогенеза активируется на эти холодные температуры, что приводит к вверх к 2 раза увеличение расходов энергии между мышей, размещенный на 20 ° C по сравнению с теми, кто размещается в 30 ° C7. Экологические корпус мыши является важным фактором для этих экспериментов, как уже было показано, что жилье мышей в thermoneutrality может потенцировать развития некоторых условий, такие как атеросклероз8 и высоким содержанием жиров диеты индуцированной Патогенез безалкогольных жирная болезнь печени (NAFLD)9. Температура окружающей среды поэтому является также важным фактором при проведении экспериментов в метаболизм животных, системы мониторинга, как фенотип может присутствовать при определенных температурах, но не на других, что может указывать на потенциальные механизм действий. Один из таких сценариев может быть фенотип, которая включает активацию набранных бежевый жира, whereby большее количество этой ткани позволяет для большего увеличения термогенеза под кулер условия10. Таким образом это может быть необходимо изменить экологических набор вверх, что было описано в эти текущие эксперименты и проводить эксперименты по несколько окружающей температуры чтобы получить точное описание истинный метаболический статус модели. Для устранения неполадок из-за технических ошибок, может потребоваться связаться с производителями непосредственно для инструкции. Если есть проблемы с этим типом анализатор состава тела рекомендуется выполнить тест повторить сканирование, которая проходит 25 проверок против стоимости. Компания будет нужна эта информация для диагностики. Аналогичным образом метаболизм животных системы мониторинга, если возникают вопросы, соберите файлы данных с момента последнего, система работала хорошо и с возникновения вопросов таким образом, чтобы поддержка можно сделать вероятность диагноза.
Ограничения
Хотя анализатор состава тела обеспечивает отличные данные на накопление жира всего тела, он не позволяет для определения региональных жировых депо. Это имеет важное значение в области исследований ожирения, как не все жира это то же самое, с расположением, накопленный жир и ее функциональных свойств, имеет особенно важное значение. Действительно защитные эффекты подкожных жировых отложений (или метаболически здоровых жиров) были описаны11. Микро Компьютерная томография (микро CT) может различать подкожной и висцерального жира12, как магнитно-резонансная томография (МРТ) анализ13. Использование этих методов может представить дополнительную информацию на сайте жировые накопления. Метаболизм животных, система мониторинга также имеет свои ограничения. Хотя общие ежедневные расходы энергии может быть измерена, система не способна взыскательных между различными компонентами, которые составляют расходы энергии. Еще одно ограничение системы является, что вполне возможно, что ожирение может развиваться без измеримых сокращение расходов энергии, обнаружены через эти виды систем, даже независимо от изменения потребления продовольствия/энергии. Исследования показали, что малые снижение затрат энергии, которые являются достаточно весомыми, чтобы вызвать значительный вес, получить в долгосрочной перспективе, не могут быть обнаружены энергично в таких метаболических систем за короткий срок14,15, 16. Хотя мы использовали n 6 для каждой группы в текущем исследовании продемонстрировать эту методологию в качестве примера исследования, чтобы обнаружить небольшие различия в расходов энергии, которые могли бы способствовать ожирения вероятно требует много больше мышей5. Прогресс в урегулировании обнаружения этих систем и способность выполнять эти виды исследований в течение более длительного периода времени будет помощь в способности обнаруживать эти небольшие, но значительные изменения. Что касается измерения потребления пищи обычно наблюдается что 24 h прием пищи в мышей, размещается в метаболизм животных, система мониторинга ниже будет наблюдаться в клетке, дома, вероятно, по причинам, выше. Таким образом помимо контроля за приемом пищи в этой системе, мы дополнительно оценить потребление пищи в дома клетки мышей. Хотя это может быть сделано только в ситуации, где мышей от конкретных экспериментальных групп размещаются отдельно, он имеет преимущество, позволяя вблизи постоянной ежедневной оценки. Следователь просто весит количество пищи в бункере в определенное время дня, всегда приходится пищи, разбросанных по всей клетке и затем делит это общее количество пищи, потребляемой на количество мышей в клетке.
Будущие приложения
Хотя в рамках этого обзора мы использовали ожирения, приобретенные через высоким содержанием жиров питание как пример болезненное состояние, где измерения состава тела и метаболических параметров являются полезными, далеко от использования этого оборудования сводится к этой области исследований. Использование этих методов является также ценным при изучении таких заболеваний, как диабет, сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с возрастом саркопения, бренность, рак кахексия, мышечная дистрофия и липодистрофия. Хотя первоначальные расходы на покупку такой инфраструктуры является значительным, возможность использования оборудования через несколько и различных областях медицинских исследований снижает опасность этой первоначальной стоимости. Кроме того продолжающиеся реагентов и расходных расходы минимальны для этих машин; Однако профилактическое обслуживание и ремонт должны рассматривать и бюджете.
Так же, как мышечная масса, полученные через анализ состава тела может быть важным нормализации фактором для потребления кислорода, полученных от метаболических животного, системы мониторинга, мышечной массы определение может также использоваться для нормализации дозы тест наркотиков. К примеру в метаболических исследованиях, это обычным явлением для выполнения тест на переносимость глюкозы внутрибрюшинного или устные (ГЦГ), или тест толерантности внутрибрюшинного инсулина (МТС). Эти тесты изучить способность мыши распоряжаться глюкозы нагрузки или реагировать на инсулин. Изменения уровня глюкозы в крови в ответ на эти испытания предоставляет информацию о уровне всего тела глюкозы и инсулина терпимости в модели. Традиционно глюкозы и инсулина Болус, управляемых в этих тестах Дозировка осуществляется согласно веса тела мыши. Однако как модели ожирения накапливаться жировой массы над мышечной массы, дозировки на массы тела может смещения тяжелее модели к глюкозе в ГЦГ, они получают больше глюкозы. Это связано с тем, что печень, скелетных мышц и головного мозга, органов, которые распоряжаться большинства глюкозы в постсоветском натощак государства17, являются компонентами худой измерения массы и редко или слегка изменить в большинстве моделей. И наоборот в МТС, когда дозированной веса тела, тяжелее модель, которая будет получать больше инсулина может появиться более чувствительны к понижать эффекты инсулина, чисто потому, что он получил большее количество глюкозы. Поэтому если следователь имеет доступ к данным, состав тела, мышечной массы может быть наиболее целесообразной мерой, в отличие от массы всего тела, для вычисления такой дозировке18. Принимая это еще, мышечной массы данных, полученных из анализа состава тела может также использоваться для дозировки экспериментальные препараты, если возникла необходимость счета для мышечной массы на исключение жировой массы. Другое приложение метаболических животного, система мониторинга что не обсуждались или продемонстрировали в этой рукописи закрытых моторизованный третбан системы таким образом, чтобы параметры метаболизма обсуждались здесь также может измеряться во время присоединения Упражнение.
Процедуры, описанные в этом обзоре может использоваться для характеристики состава тела и различных метаболических параметров у мышей. Эти меры применимы к широкий спектр исследований и могут обеспечить важную информацию для описания фенотип. Данные, полученные из этих методов можно также предоставить доказательства к основных механизмов вождения конкретного метаболического фенотипа. Дальнейшее развитие и уточнение этих технологий позволит исследователям выдвинуть свои выводы к терапевтические результаты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим сотрудников из Альфред медицинских исследований и образования участковых животное услуги (как AMREP) команды за их помощь и уход мышей, используемые в данном исследовании и для поддержки оперативной инфраструктуры поддержки схемы викторианской эпохи государства Правительство.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 in 1 system | EchoMRI | 4 in 1 system | Whole body composition analyser |
| Canola oil test sample (COSTS) | EchoMRI | Mouse-specific (contact company for cat number) | |
| Animal specimen holder | EchoMRI | 103-E56100R | |
| Delimiter | EchoMRI | 600-E56100D | |
| 12 chamber system | Columbus Instruments | Custom built | Metabolic Caging System; includes control program |
| Drierite | Fisher Scientific | 238988 | CLAMS consumable |
| Calibration gas tank | Air Liquide | Mixed to order | Gas calibration (0.5% CO2, 20.5% O2, balance nitrogen). |
| Normal chow diet | Specialty Feeds | Irradiated mouse and rat diet | |
| High fat diet | Specialty Feeds | SF04-001 | |
| Balance | Mettler Toledo | PL202-S | Balance for weighing mice |
| TexQ Disinfectant spray | TexWipe | ||
| Hydrogen Peroxide cleaning solution | TexWipe | TX684 |
References
- Chen, W., Wilson, J. L., Khaksari, M., Cowley, M. A., Enriori, P. J. Abdominal fat analyzed by DEXA scan reflects visceral body fat and improves the phenotype description and the assessment of metabolic risk in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 303 (5), E635-E643 (2012).
- Kovner, I., Taicher, G. Z., Mitchell, A. D. Calibration and validation of EchoMRI whole body composition analysis based on chemical analysis of piglets, in comparison with the same for DXA. Int J Body Compos Res. 8 (1), 17-29 (2010).
- EchoMRI. Software User Manual: Whole body composition analyzer. , (2016).
- Columbus Instruments. Oxymax for Windows User Manual. , September (2014).
- Tschop, M. H., et al. A guide to analysis of mouse energy metabolism. Nat Methods. 9 (1), 57-63 (2011).
- Speakman, J. R. Measuring energy metabolism in the mouse - theoretical, practical, and analytical considerations. Front Physiol. 4, (2013).
- Swoap, S. J., et al. Vagal tone dominates autonomic control of mouse heart rate at thermoneutrality. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (4), H1581-H1588 (2008).
- Tian, X. Y., et al. Thermoneutral housing accelerates metabolic inflammation to potentiate atherosclerosis but not insulin resistance. Cell Metab. 23 (1), 165-178 (2016).
- Giles, D. A., et al. Thermoneutral housing exacerbates nonalcoholic fatty liver disease in mice and allows for sex-independent disease modeling. Nat Med. 23 (7), 829-838 (2017).
- Lee, M. W., et al. Activated type 2 innate lymphoid cells regulate beige fat biogenesis. Cell. 160 (1-2), 74-87 (2015).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity. Nat Med. 18 (10), 1539-1549 (2012).
- Judex, S., et al. Quantification of adiposity in small rodents using micro-CT. Methods. 50 (1), 14-19 (2010).
- Chaurasia, B., et al. Adipocyte ceramides regulate subcutaneous adipose browning, inflammation, and metabolism. Cell Metab. 24 (6), 820-834 (2016).
- Matthews, V. B., et al. Interleukin-6-deficient mice develop hepatic inflammation and systemic insulin resistance. Diabetologia. 53 (11), 2431-2441 (2010).
- Tschop, M., Smiley, D. L., Heiman, M. L. Ghrelin induces adiposity in rodents. Nature. 407 (6806), 908-913 (2000).
- Garcia, M. C., et al. Mature-onset obesity in interleukin-1 receptor I knockout mice. Diabetes. 55 (5), 1205-1213 (2006).
- Kowalski, G. M., Bruce, C. R. The regulation of glucose metabolism: Implications and considerations for the assessment of glucose homeostasis in rodents. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (10), E859-E871 (2014).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297 (4), E849-E855 (2009).
