Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

إعداد موريني الغدة اللعابية اللهاة تستقيم مجهرية إينترافيتال

doi: 10.3791/57283 Published: May 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

يصف لنا وضع بروتوكول لفضح جراحيا واستقرار الغدة اللعابية اللهاة مورين للتصوير إينترافيتال باستخدام الفحص المجهري إينترافيتال منتصبة. هذا البروتوكول قابل للتكيف بسهولة إلى أخرى إفرازات الغدد للرأس ومنطقة الرقبة من الفئران والقوارض الصغيرة الأخرى.

Abstract

الغدة اللعابية اللهاة (SMG) هي واحدة من الغدد اللعابية الرئيسية الثلاثة، وهي تهم للعديد من المجالات المختلفة للبحوث البيولوجية، بما في ذلك بيولوجيا الخلايا والأورام، وطب الأسنان، وعلم المناعة. إس أم جي إفرازات غدة تتألف من الخلايا الظهارية الافرازية، myofibroblasts، خلايا بطانية، والأعصاب، والمصفوفة خارج الخلية. سابقا قد تم تصويرها العمليات الحيوية الخلوية في الفئران والفأر SMG، ومعظمها باستخدام مقلوب مجهر فوتون متعدد النظم. هنا، يمكننا وصف بروتوكولا مباشرة لإعداد العمليات الجراحية واستقرار SMG مورين في الفئران تخديره للتصوير في فيفو مع نظم تستقيم فوتون متعدد المجهر. نحن تقديم مجموعات تمثيلية إينترافيتال الصورة الذاتية ونقل الخلايا الفلورسنت، بما في ذلك العلامات من الأوعية الدموية أو القنوات اللعابية والجيل الثاني متناسق لتصور الكولاجين فيبريلار أدوبتيفيلي. وباختصار، لدينا البروتوكول يسمح لإعداد العمليات الجراحية الغدد اللعابية الماوس في الفحص المجهري تستقيم النظم التي تستخدم عادة لتصوير إينترافيتال في مجال علم المناعة.

Introduction

ويفرز اللعاب بواسطة إفرازات الغدد لتليين الطعام، وحماية السطوح المخاطية المسالك عن طريق الفم، وتسليم إنزيمات الجهاز الهضمي، وكذلك المواد المضادة للميكروبات1،2. بالإضافة إلى ثانوية الغدد اللعابية ويتخلل في سوبموكوسا عن طريق الفم، هناك ثلاث مجموعات ثنائية الغدد الرئيسية المحددة النكفية، تحت اللسان، واللهاة، وفقا لما الموقع1،2. على شكل هرم الخلايا الظهارية، نظمت في الأكياس على شكل قارورة (أسيني) أو ديميلونيس التي هي محاط بغشاء الطابق السفلي، وخلايا myoepithelial تفرز مكونات اللعاب1المصلي والأغشية المخاطية. المساحة لومينال الضيقة للمصارف أسيني في مجاري المقحم، التي توحد في مجاري striated حتى أنهم أخيرا الانضمام إلى مجرى هواء مطرح واحد1. القناة مطرح الرئيسية من إس أم جي يسمى مجرى الهواء في وارتون (WD) ويفتح في3،كارونكلي تحت اللسان4. ولذلك يمثل حجرة طلائي SMG بنية عالية أربوريزيد مع نقاط النهاية الطرفية المتعددة، تشبه حزمة من العنب1،،من56. إينتيرستيتيوم SMG يتكون من الأوعية الدموية واللمفاوية جزءا لا يتجزأ من النسيج الضام7 تحتوي على أعصاب الجهاز السمبتاوي8 و5من المصفوفة خارج الخلية. تحتوي أيضا على الغدد اللعابية القوارض والإنسان العادي تي الخلايا والضامة، والخلايا الجذعية9، فضلا عن خلايا البلازما التي تفرز الغلوبولين المناعي (IgA) في اللعاب9،10. بسبب وظائفها المتعددة الأوجه في الصحة والمرض، إس أم جي موضع اهتمام للعديد من مجالات البحوث البيولوجية، بما في ذلك طب الأسنان4وعلم المناعة11والأورام12، وعلم وظائف الأعضاء8وبيولوجيا الخلية 3.

تصوير من التفاعلات والعمليات الحيوية الخلوية أداة قوية في البحوث البيولوجية13،14. تطوير الأنسجة العميقة التصوير والابتكارات إينميكروسكوبيس استناداً الضوئية اللاخطية (نلو)، التي تعتمد على نثر أو امتصاص الفوتونات متعددة بواسطة العينة، سمح لمباشرة دراسة العمليات الخلوية في الأنسجة المعقدة13 ،15. امتصاص الفوتونات متعددة ينطوي على تسليم الطاقة الإجمالية الإثارة بالفوتونات طاقة منخفضة، أي حدود fluorophore الإثارة إلى المستوى البؤري ويسمح بالتالي أعمق اختراق الأنسجة مع انخفاض د والضوضاء من خارج التركيز الإثارة13،15. هذا المبدأ يعمل قبل يومين-فوتون مجهرية (02:00 م)، ويسمح بتصوير العينات الفلورسنت في أعماق تصل إلى 1 مم15،16. بينما المتاحة تجارياً 02:00 م أصبحت الأجهزة سهلة الاستخدام ويمكن الاعتماد عليها، هو التحدي الرئيسي لتصوير إينترافيتال فضح واستقرار الجهاز المستهدف من الفئران تخديره، خاصة بالنسبة لتصوير سلاسل الزمنية الفاصل بعناية. عدة طرق لتصحيح الانحراف الرقمية بعد قد تم الحصول على البيانات المنشورة17،18 وقمنا مؤخرا بتطوير "فيفوفولوو"، نظام تصحيح الآلي، الذي يصد الانجراف أنسجة بطيئة في الوقت الحقيقي باستخدام 19من مرحلة المحوسبة. ومع ذلك، أنها لا تزال حرجة للتصوير للتقليل من الأنسجة الحركة، لا سيما الحركات السريعة الناجمة عن التنفس أو ضربات القلب19عالية الجودة. وقد نشرت إجراءات إعداد وتحقيق الاستقرار لأجهزة متعددة، بما في ذلك الحبل الشوكي20و الكبد21والجلد22،23من الرئة والعقدة الليمفاوية24. وعلاوة على ذلك، تم المتقدمة3،25 نماذج لتصوير الغدة اللعابية الفئران ومزيد من الصقل لتصوير عالية الدقة إينترافيتال من الفاري SMG لتلائم مجهر مقلوب إعداد26، 27 , 28.

هنا، نحن نقدم بروتوكول عملي وقابلة للتكيف لتصوير إينترافيتال من SMG مورين استخدام تستقيم مجهرية غير الخطية، التي تستخدم عادة لتصوير إينترافيتال في مجال علم المناعة. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتعديل مرحلة التثبيت العاملين على نطاق واسع تستخدم للتحضير العقدة الليمفاوية المابضيه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم وافقت عليها "اللجنة الكانتونات" "التجريب الحيوان" عمل جميع الحيوانات وتجري وفقا للمبادئ التوجيهية الاتحادية.

1-تخدير الماوس

  1. ارتداء معدات الحماية الشخصية، بما في ذلك مختبر المعطف والقفازات.
  2. مزيج الكيتامين، إكسيلازيني، والمحلول الملحي بتركيز 20 ملغ/مل و 1 ملغ/مل، عامل على التوالي. حقن الأسهم العامل إينترابيريتونيلي (القائمة) في 8-10 ميليلتر/ز من الماوس. ضع الماوس مرة أخرى إلى القفص.
    ملاحظة: تم اختبار هذا البروتوكول للفئران الذكور والإناث 6-40 أسبوع مع خلفية C57BL/6.
  3. إعداد الحل أسيبرومازيني في 2.5 ملغ/مل وحقن 30 ميليلتر القائمة، 15 دقيقة بعد حقن xylazine الكيتامين (75 ميكروغرام/الماوس).
  4. بعد 5-15 دقيقة، تحقق للتخدير الكافي والتسكين بالسيطرة على ردود الفعل، مثلاً، منعكس سحب مخلب أو منعكس القرنية.
  5. التحكم لردود الفعل تقريبا كل 30 دقيقة أثناء مدة التجربة بأكملها. حقن تحت الجلد الكيتامين/xylazine في 1.5 ميليلتر/ز من الماوس، كل 60 دقيقة أو إذا أقدم من ردود الفعل الإيجابية.
    ملاحظة: لا يمكن استخدام التخدير استنشاق مثل إيسوفلوراني مع هذا البروتوكول، نظراً لتثبيت الماوس.

2-إزالة الفراء من ناحية التشغيل

  1. استخدام حلاقة الكهربائية حلق منطقة أن يوسع ما يقرب من 5 مم والذيلية الفم نحو الأرجل الأمامية، تمتد الفكين صوب كلتا الأذنين.
  2. تطبيق كريم لإزالة الشعر لمنطقة حلق مع مسحه القطن. بعناية ودقة إزالة بعد 3 دقائق، مثلاً، عن طريق المسح مع الأنسجة الرطبة.

3-إصلاح الماوس على المسرح

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول مرحلة مخصصة (الشكل 1) مزودة باثنين من أصحاب بحرية قابل للتعديل لكشوف الغطاء (أحد يعلق على المسرح مع المسمار، والأخرى ثابتة بشكل دائم على ذلك)؛ أشرطة الإذن المناظير باستخدام الأشعة للتعديل؛ سلسلة التي يمكن تشديد مع المسمار؛ معدن قابل لتعديل بحرية تدفئة الدائري؛ ومنطقة آثار معينة لوضع الجذع الماوس. يتم تعديل هذه المرحلة من مرحلة عقده الليمفاوية المابضيه، مع صاحب المناظير باستخدام الأشعة إضافة ودعما لكشف الغطاء السفلي يحملون SMG اكستيريوريزيد. خطط مفصلة أو يقتبس من المرحلة التي تتوفر عند الطلب.

  1. تعد المرحلة عن طريق إزالة أصحاب على الحلبة تدفئة وصاحب كشف الغطاء القابل للإزالة. قم بفك المسامير لأصحاب شريط الإذن وصاحب كشف الغطاء ثابت. الشريط قطعة من الشاش إلى منطقة مركز المرحلة، تخدم كالفراش للماوس.
  2. استخدام الغراء (انظر الجدول للمواد) لإرفاق زجاج غطاء قطرها 20 مم إلى الجزء العلوي من حامل معدني أسطواني (وهذا سوف يكون زجاج الغطاء السفلي). الصق زجاج غطاء 25 مم إلى الجزء السفلي من حامل معدني مسطح (وهذا سوف يكون زجاج الغطاء العلوي). التأكد من أن تتداخل النظارات تغطية حوالي 2-3 ملم مع أصحاب المعادن وأن تبقى بقية الزجاج خالية من الشحوم والغراء.
  3. ضع الماوس على ظهرها على الشاش، عمودي على السلسلة ممدد، مع رئيس توسيط بين القضبان الإذن.
  4. إصلاح في الأطراف العليا من الماوس على خشبة المسرح مع الشريط الجراحي.
  5. بعد ذلك، ربط السلسلة في القواطع الجبهة العلوي وتشديد حتى يصل الفك إلى وضع أفقي. استخدام ملقط منحنية زاوية طفيفة سحب اللسان من الفم، مما يسهل التنفس.
  6. محكم، ولكن لا قوة، سحب الذيل والشريط إلى المرحلة.
  7. قم بمحاذاة أشرطة الإذن لتحقيق زاوية حوالي 30° بين الشريط وحافة المسرح. للتأكد من هذه الزاوية، استخدم مسطرة مثلث لرسم زاوية اليمين واليسار 30 درجة على ورقة، ووضع المرحلة شفافة على الورق إلى محاذاة المكلفين تبعاً لذلك.
  8. إصلاح الفك بين القضبان الإذن بتحريك الشريط الأيمن والأيسر في نفس الوقت إلى الداخل حتى الفك اسم، وتشديد الخناق. مراقبة حركة الصدر قبل وأثناء وبعد تحديد الفك. انخفاض أو غياب التنفس يشير إلى أن يتم إصلاحها الحانات في الرقبة، لا عظم الفك؛ وفي هذه الحالة، كرر هذا الإجراء تحديد فورا.
  9. توفير التدفئة للماوس، مثلاً، عن طريق وضع مصباح تدفئة القريبة و/أو وسادة تدفئة تحت المرحلة.

4-الجراحة تعرض الغدة اللعابية استخدام ستيريوميكروسكوبي

ملاحظة: تتطلب الخطوات التالية استخدام ستيريوميكروسكوبي وغرامة الملقط، والمقص الجراحي. نظراً لهذا الإجراء المحطة الطرفية، ليس ضروريا للحفاظ على ظروف التشغيل العقيمة. ويكفي أدوات تنظيف الإيثانول.

  1. تحديد موقع الفص الأيمن SMG التقريبية التي تبحث عن انتفاخ طفيف في الجلد والذيلية للفم والانسي 5 مم من خط الفك 15 ملم تقريبا. رفع حظيرة جلد صغيرة في وسط الإنتفاخ وقطع لإنشاء وافتتاح حوالي 5 ملم في الطول.
  2. تطبيق حلقة 4 مم-عالية من الشحوم فراغ مباشرة على الجلد المحيطة بالخفض. (استخدم حقنه مليئة بالشحوم فراغ بإبرة حقن 25 غ يتثلم).
  3. ملء الطوق الشحوم مع المحلول الملحي ضمان بقاء الأنسجة رطبة أثناء العملية.
  4. تحت ستيريوميكروسكوبي، تعطيل النسيج الضام باستخدام الإجراء التالي: استخدام الملقط غرامة واحدة أن نتمسك بقطعة من النسيج الضام موصول مباشرة إس أم جي، واستخدام ملقط ثاني سحب النسيج الضام القاصي حتى أنها تتمزق. التأكد من بقاء بعض الأنسجة الضامة المرفقة إلى إس أم جي؛ هذا مرغوب فيه أنه يسمح للمناولة. لا تلمس الغدة نفسها بالملقط، حيث سيؤدي هذا النزيف.
  5. كرر هذا الاقتراح بإفساد النسيج الضام أولاً على رأس الغدة، ثم على الجانب الآنسي (بين الفص الأيمن والأيسر لاس أم جي). لا تفصل في تحت اللسان من غدة اللهاة.
  6. الاستمرار في إزالة النسيج الضام الأفقي عكس اتجاه عقارب الساعة حول إس أم جي (الآنسي إلى والذيلية، إلى الأعلى، إلى روسترال).
  7. ضمان أن لا يتم تمزق في إمدادات الدم اللمفاوي ناقل والقناة اللعابية، التي تقع كلها في حزمة في الجمجمة موقع الغدة،.
  8. بمجرد تعطل النسيج الضام الأفقي، استخدام الملقط لسحب النسيج الضام يعلق على نهاية SMG صعودا رفع نهاية والذيلية SMG والذيلية. تعطيل النسيج الضام أسفل الفص SMG، بدءاً والذيلية، وتتجه نحو نهاية روسترال.
  9. تابع حتى تتم إزالة النسيج الضام إلى جميع المواقع في إس أم جي (باستثناء الموقع روسترال مع الأوعية الدموية الرئيسية تغذية/تجفيف ويسترن ديجيتال).

5-تحديد الغدة

  1. التأكد من أن الحلبة الشحوم عقد المياه المالحة على الأقل 4 ملم عالية وعدم تسريب (راجع الخطوة 4، 2).
  2. تركيب زجاج الغطاء السفلي (راجع الخطوة رقم 3.2) عن طريق إرفاق شريط معدني حامل قابل لضبط الارتفاع. ضمان أن صاحب كشف الغطاء يعدل بموقف ضيوفنا ولا تلمس الحلبة الشحوم عند إرفاق إلى المرحلة. موقف صاحب من اتجاه والذيلية بزاوية مقدارها حوالي 60° للماوس، مع تغطية زلة تغطي ما يقرب من ثلثي (أجزاء والذيلية والقاصي) من الفص المكشوفة. انخفاض الزجاج غطاء حتى أنه يجعل الاتصال مع الغدة.
  3. إكمال الطوق الشحوم فوق الزجاج غطاء لتشكيل خزان جديد مالحة.
  4. سحب الفص SMG على رأس بكشف الغطاء بعناية مع الملقط، فقط لمس النسيج الضام المرتبطة به (يمكن منعكسة الجهاز مع موقع أسفل تواجه صعودا).
  5. ضمان أن الحلبة الشحوم ارتفاع حتى 4 مم على الأقل ولا تسرب. إذا لزم الأمر، إعادة ملء الخزان المالحة ز 30 باستخدام المحاقن مليئة بالمياه المالحة.
  6. ضمان أن صاحب الزجاج غطاء للزجاج الغطاء العلوي في موقفها ضيوفنا. استخدام المسمار إرفاق حامل معدني مع زجاج الغطاء العلوي 25 مم لحاملها. استخدام مسامير قابلة للتعديل حامل لوضع زجاج الغطاء بحيث يتم توسيط في SMG في الوسط.
  7. استخدام المسامير لحامل قابل للتعديل إلى انخفاض زجاج الغطاء العلوي حتى أنها تجري اتصالات مباشرة إس أم جي. التقيد بالشكل والتلوين الغدة أثناء هذه الخطوة. إذا لم تظهر الغدة مساحة أكبر أو التلوين التغييرات (على سبيل المثال من اللون الوردي إلى اللون الأبيض)، على الفور وضع الزجاج غطاء إلى منصب أعلى لتخفيف الضغط على إس أم جي.
  8. فحص الخزان المالحة للتسريبات التي تبحث عن فقاعات الهواء أو قطرات من المحلول الملحي خارج الخزان. إذا تم الكشف عن تسرب أو الهواء فقاعة، قم بإزالة غطاء كشوف وجميع الشحوم وإعادة تشغيل من الخطوة 2.
  9. برغي إغلاق جميع مسامير التثبيت.

6-تحديد خاتم تدفئة ومسبار درجة الحرارة

  1. إدراج مسبار درجة حرارة في الخزان ووضعه بالقرب من الغدة، ثم الشريط السلك التحقيق إلى المرحلة.
  2. تطبيق عصابة الشحوم بكشف الغطاء العلوي، مع إس أم جي في المركز (ينبغي أن تتوافق مع قطر الطوق الشحوم إلى قطر الطوق تدفئة). ضع الطوق التدفئة أعلى بكشف الغطاء وختم مع الشحوم. الشريط أنابيب الطوق التدفئة إلى المرحلة.

7-التصوير

ملاحظة: نستخدم نظام تستقيم اثنين-فوتون مجهر مزودة بالليزر Ti:Sa الانضباطي ومجهر فلوري مع أهداف غمر المياه 20 X أو 25 X. يمكن تنفيذ تصحيح الوقت الحقيقي من الانجراف الأنسجة أثناء اقتناء باستخدام المرحلة الآلي وفيفوفولوو19. وهذا يحسن استقرار الحصول على الصور، ولكن ليس مطلوباً.

  1. قم بتشغيل النظام تستقيم مجهرية باستخدام برامج مناسبة التي توفرها الشركة المصنعة للمجهر. لحن الليزر Ti:Sa على طول موجي 780-900 نانومتر إثارة.
  2. قم بتوصيل أنابيب التدفئة إلى الحلبة التدفئة. مضخة مياه تحوي يدور الماء الساخن (تسخين بواسطة غمر جزء من الأنبوب في حمام الماء 80 درجة مئوية) من خلال حلقة الحارة إس أم جي.
  3. الاتصال مسبار درجة الحرارة بمقياس حرارة رقمي. ضبط سرعة مضخة تمعجية إذا كانت درجة الحرارة لا بين 35-39 درجة مئوية. أسرع تعمل المضخة، أكثر دفئا يحصل على الكائن، والعكس بالعكس.
  4. قبل البدء في الحصول على الصور، أداء عنصر تحكم visual لسرعات تدفق الدم. فحص دقيق لمرور الكريات البيض من خلال الشعيرات الدموية رقيقة أو بواسطة حقن ديكستران الفلورسنت.
    ملاحظة: ديكستران نيون حقن الوريد سوف فورا بملء المفرج إس أم جي كامل عندما يكون تدفق الدم الفسيولوجية. هذا هو الحال في هذا الإجراء عمليا دائماً.
  5. لمتابعة الخلايا المناعية، وعمق التصوير عادة ما بين 20-150 ميكرومتر تحت السطح من إس أم جي حددها إشارة 2nd جيل التوافقي. رصات الصور سجل من 150-300 ميكرون مجال الرؤية بكسل حوالي 512 × 512 أو أعلى، وأعماق ض من 20-60 ميكرومتر مع تباعد من 2-4 ميكرون بين الصور. تكرار الحصول على المكدس كل 20-30 ثانية لمجموع مدة 20-60 دقيقة.
  6. استخدام ميزان الحرارة الرقمي للتحكم في مستويات درجة الحرارة الدنيا والقصوى بعد الحصول على تسلسل صورة واحدة. تجاهل تسلسل الصورة إذا كان الحد الأدنى أو الأقصى ليست في نطاق 37 ± 2 درجة مئوية. تعبئة الماء لغمر الهدف بين تسلسل الصور.
  7. في نهاية الدورة التصوير، euthanize الفئران بأول أكسيد الكربون2 اختناقاً تحت التخدير.
    ملاحظة: هذا وفقا للمبادئ التوجيهية الاتحادية السويسرية للتجارب الحيوانية؛ يمكن تطبيق مبادئ توجيهية أخرى للقتل الرحيم في أماكن أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويسمح هذا البروتوكول تصوير تقريبا كامل الظهرية أو البطني في الجانب إس أم جي. عادة ما يتضمن مجال الرؤية أيضا الغدة اللعابية تحت اللسان، الذي يختلف بشكل طفيف من SMG في تركيبة الخلوي4. كلا الغدد مغلفة بالكولاجين فيبريلار ومقسمة إلى فصوص. نظم معظم 02:00 م يمكن إنتاج صورة خالية من تسمية الكولاجين فيبريلار بقياس الإشارات متناسق 2nd ، ولكن عادة ما تكون الجزيئات الفلورسنت مطلوبة للتصور الهياكل الخلوية وسوبسيلولار. على سبيل المثال، التعبير المحورة وراثيا في كل مكان من البروتين الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) في تركيبة مع إشارة متناسق 2nd كافية لتحديد أسيني والقنوات والأوعية الدموية في إس أم جي حسب خصائصها المورفولوجية. يمكن استخدام هذا الإعداد لمراقبة علامات نيون المحورة وراثيا مع الخلية نوع التعبير محددة لتحديد مجموعات فرعية خلية معينة. ويبين الشكل 2 شبكة ofCOL1A1-بروتينات فلورية خضراء معربا عن مراسل تنتجها الخلايا الليفية مثل الخلايا في النسيج الضام. كما هو موضح بالأوعية الدموية، والمسماة بالحقن الوريدي بصبغة الفلورسنت بالإضافة إلى ديكستران عالية الوزن الجزيئي. كما يمكن أن يكون المسمى حجرة لومينال من القنوات (الشكل 3) على عندما يتم حقن الصبغة ريتروجرادوالي في WD29.

Figure 1
الشكل 1 : تخصيص المرحلة. (و *) هما أصحاب بحرية قابل للتعديل لكشوف الغلاف؛ أشرطة الإذن المناظير باستخدام الأشعة للتعديل (ب وب *)؛ (ج) سلسلة، التي يمكن أن تشديد مع المسمار؛ (د) معدن قابل لتعديل بحرية تدفئة الدائري؛ (ه) آثار منطقة مخصصة لوضع الجذع الماوس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : علامة المفرج (أحمر) وشبكة من الخلايا وإذ تعرب عن COL1A1-التجارة والنقل (الأخضر). المفرج المسماة بالحقن الوريدي من تكساس الأحمر-ديكستران المتقارن (كاتشين 70 ميغاواط). هو تصور الكولاجين فيبريلار بين الفصوص اثنين كإشارة متناسق 2nd (أزرق). يظهر إسقاطاً z واحدة من 15 صور مكدسة مع 47 ميكرومتر العمق. شريط المقياس = 40 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : لومينال لاصق المسمى بعد حقن WD. الأوعية الدموية التي وصفت مع 70 ميغاواط كاتشين تكساس الأحمر-ديكستران (أحمر)، لاصق التجويف المسمى مع تتالي الأزرق-ديكستران (الأبيض؛ كاتشين 10 ميغاواط) عن طريق حقن رجعية عن طريق التجارة والنقل أدوبتيفيلي المنقولة+ CD8 ويسترن ديجيتال+ تي الخلايا (الأخضر) في إس أم جي. الموضح z-إسقاط 27 صور مكدسة مع 50 ميكرومتر عمق واحد. شريط المقياس = 40 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويوفر هذا البروتوكول نهجاً مباشرا للتصوير في فيفو مورين الغدد اللعابية تحت اللسان واللهاة باستخدام تستقيم مجهرية غير الخطية التي غالباً ما تستخدم في مجال علم المناعة. الأسلوب يمكن تكييفها لتصوير الغدد إفرازات أخرى في منطقة الرأس والرقبة. على سبيل المثال، قد يقوم لدينا مختبر تصوير الغدة الدمعية بطريقة مماثلة (غير معروضة).

إزالة النسيج الضام حول إس أم جي هو الخطوة الأكثر أهمية من هذا البروتوكول، حيث يمكن أن يحدث تلف الأنسجة العرضي. الأضرار بإمدادات الدم الرئيسي SMG يتطلب الإنهاء الفوري لهذه التجربة، حيث تصبح الأنسجة SMG التاكسج. إذا تلف أنسجة SMG نفسها، النزيف عادة يتوقف بطبيعة الحال بتجلط الدم. بيد أنه يلزم النظر فيها أن الضرر الذي يتسبب التهاب عقيم وإطلاق السيتوكينات proinflammatory30، التي يمكن أن تؤثر قراءات تجريبية. أكثر شيوعاً، ولكن أقل تعقيد حرجة أثناء الجراحة تسرب في خزان المالحة. لتقليل حدوث تسرب، دائماً تطبيق الشحوم للجلد الجاف، أصلع. تصحيح تسرب عادة عقيمة: بدلاً من ذلك، إزالة جميع الشحوم وتنظيف الجلد بمسحه القطن جافة، وإعادة تطبيق من الصفر.

أثناء التصوير، يجب الاحتفاظ بدرجة حرارة قريبة من درجة حرارة الجسم الفسيولوجية (حوالي 37 درجة مئوية لذكور وإناث الفئران C567BL/631). وبما أن كلا هيبو-و hyperthermia تغير تدفق الدم32،33، لا يمكن افتراض الوظيفة الفسيولوجية لاس أم جي تلك الظروف. ومع ذلك، لاحظ أننا لا فرق في تدفق الدم أو حركية خلية T خلال الصغيرة (± 2 درجة مئوية)، عابرة (< 5 دقيقة) الانحرافات عن درجة الحرارة المثلى.

تقليل حركة الأنسجة ضروري لجودة التصوير جيدة. أنواع مختلفة من الأنسجة غير المرغوب فيها الحركة يمكن أن تحدث، والأسباب المعتادة التي يمكن أن تخضع لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. أولاً، xyz-الانجراف المستمر هو عادة ما يكون سببها إس أم جي الانجراف ببطء مرة أخرى إلى موضعه الأصلي من خلال النسيج الضام المرفقة. يحدث هذا إذا تم تركيب زجاج الغطاء السفلي مرتفعة جداً، أو لا تعطلت النسيج الضام حول إس أم جي دقة. وثانيا، قد تحدث z-الانجراف البطيء والمستمر إذا كانت درجة الحرارة غير مستقرة. وفي هذه الحالة بعناية ضبط التدفئة والانتظار لدرجة حرارة مستقرة، حوالي 15 دقيقة قبل التصوير. وأخيراً، عند النابض الأنسجة الحركة قاعة المالحة لا مختومة محكم. الضغط يتراكم والنشرات في قاعة المالحة مع كل دورة التنفس. في تركيبة مع وجود تسرب أو فقاعات الهواء وهذا يؤدي إلى تدفقات السوائل النابض، التي تترجم مباشرة إلى الأنسجة SMG. وفي هذه الحالة، إعادة التجميع تغطية النظارات والدائرة المالحة على السواء هو الحل الأكثر موثوقية.

الحد الأقصى لعمق التصوير يعتمد على الطول الموجي الإثارة المستخدمة و fluorophores المستخدمة. كما هو الحال في تقريبا جميع الأجهزة التصوير إينترافيتال، وتحول الأحمر الأصباغ أو البروتينات الفلورية التي يمكن متحمس مع أطوال موجية طويلة (900 1,100 نانومتر) تسمح للأنسجة الأعمق التصوير من الأصباغ الخضراء والإثارة أقصر الأطوال الموجية.

إس أم جي استخدمت كطراز الجهاز إندو-والرقابة والغشاء يعيد البناء3،،من2728وإصابة34والمناعة الذاتية11والورم البيولوجيا12. ويسمح كذلك العديد من أشكال التلاعب: يمكن تسليم الأصباغ والمركبات الدوائية، والأجسام المضادة للغدة عبر مجرى الدم. وبدلاً من ذلك، يمكن أن تكون مستهدفة في إس أم جي مباشرة عن طريق كانوليشن يسترن ديجيتال، التي استخدمت لتسليم الفيروسات11، ديكسترانس3،25من الحمض النووي، والأصباغ29، أو وكلاء الدوائية3.

ولا تزال مجال التصوير إينترافيتال الربح من أدوات المتزايدة من الفلورسنت الوراثية والبيوكيميائية وسم تقنيات. التقدم في مجال الهندسة الوراثية توفير خطوط الماوس وخطوط الخلية مع علامات نيون متطورة. تشمل الأمثلة الأخيرة وسم من خلية معينة مجموعات فرعية (CD11c+ الخلايا35) أو بروتينات cytoskeletal الديناميكي (ليفيكت36)، وعلامات فوتوكونفيرتيبلي لخلية تتبع 37، والصحفيين في الوقت الحقيقي للنووي إزفاء (نفات38) أو الكالسيوم مما يشير إلى39. قد تستخدم تطبيقات أخرى تحقيقات البيوكيميائية نيون، التي تسلط الضوء على المقصورات سوبسيلولار محددة (مثل الحمض النووي ملزم 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) أو أصباغ الغشاء محبتين). الحديثة نلو المجهري يوفر العديد من الحلول الممكنة لأفضل الإجابة على الأسئلة التجريبية. على سبيل المثال، وضعت متعدد اثنين-فوتون التصوير بشدة زيادة اكتساب أقصى سرعة40. توفر تقنيات أخرى تصوير خالية من التسمية مولتيفوتون، أما الثانية وتوليد أو إشارات التوافقي الثالث15، أو قياس الاهتزاز الرنين المميز للجزيئات (متماسكة لمكافحة ستوكس رامان نثر)41. وهكذا، عندما تتوفر إجراءات عمليا للتعرض للأنسجة وتحقيق الاستقرار، معظمها يتم تعيين حدود التصميم التجريبي بالموارد المجرب والإبداع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وأعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية السويسرية (الجبهة الوطنية الصومالية) المشروع منحة 31003A_135649 و 31003A_153457 و 31003A_172994 (إلى JVS) وزمالة ليوبولدينا لبدس 2011-16 (للبكالوريوس). هذا العمل قد استفادت من الأجهزة البصرية "الفحص المجهري التصوير مركز" (هيئة التصنيع العسكري) بجامعة برن.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Narketan 10 %  (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) Vetoquinol 3605877535982
Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) Bayer 680538150144
Saline NaCl 0.9% B. Braun 3535789
Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) Fatro 6805671900029
Electric shaver Wahl 9818L or similar
Hair removal cream Veet 4002448090656
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-1
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-0
Super glue Ultra gel, instantaneous glue Pattex, Henkel 4015000415040
Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm Menzel-Gläser 631-1343/ 631-1344
Grease for laboratories 60 g glisseal N Borer (VWR supplier) DECO514215.00-CA15
Surgical scissors Fine Science Tools (F.S.T ) 14090-09 or similar
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T ) 11252-20 or similar
Cotton swab Migros 617027988254 or similar
Gauze Gazin 5 x 5 cm Lohmann and Rauscher 18500 or similar
Stereomicroscope Leica MZ16 or similar
Texas Red dextran 70kDa  Molecular Probes D1864
Cascade Blue dextran 10kDa invitrogen D1976
Two-photon system LaVision Biotec TrimScope I and II or similar
XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective Olympus n/a or other water immersion objective 
Digital thermometer Fluke 95969077651

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. Digestive System. Digital Histology. John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. 101-121 (2005).
  2. Carpenter, G. Role of Saliva in the Oral Processing of Food. Food Oral Processing. Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 45-60 (2012).
  3. Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9, (10), 1801-1810 (2008).
  4. Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands. Acta Histochem Cytochem. 45, (5), 241-250 (2012).
  5. Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Front Oral Biol. 14, 48-77 (2010).
  6. Takeyama, A., Yoshikawa, Y., Ikeo, T., Morita, S., Hieda, Y. Expression patterns of CD66a and CD117 in the mouse submandibular gland. Acta Histochem. 117, (1), 76-82 (2015).
  7. Hata, M., Ueki, T., Sato, A., Kojima, H., Sawa, Y. Expression of podoplanin in the mouse salivary glands. Arch Oral Biol. 53, (9), 835-841 (2008).
  8. Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neurosci. 133, (1), 3-18 (2007).
  9. Le, A., Saverin, M., Hand, A. R. Distribution of Dendritic Cells in Normal Human Salivary Glands. Acta Histochem Cytochem. 44, (4), 165-173 (2011).
  10. Hofmann, M., Pircher, H. E-cadherin promotes accumulation of a unique memory CD8 T-cell population in murine salivary glands. Proc Natl Acad Sci. 108, (40), 16741-16746 (2011).
  11. Bombardieri, M., Barone, F., Lucchesi, D., et al. Inducible tertiary lymphoid structures, autoimmunity, and exocrine dysfunction in a novel model of salivary gland inflammation in C57BL/6 mice. J Immunol. 189, (7), 3767-3776 (2012).
  12. Szwarc, M. M., Kommagani, R., Jacob, A. P., Dougall, W. C., Ittmann, M. M., Lydon, J. P. Aberrant activation of the RANK signaling receptor induces murine salivary gland tumors. PLoS One. 10, (6), e0128467 (2015).
  13. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: A novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, (5), 481-491 (2010).
  14. Masedunskas, A., Milberg, O., Porat-Shliom, N., et al. Intravital microscopy. Bioarchitecture. 2, (5), 143-157 (2012).
  15. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21, (11), 1369-1377 (2003).
  16. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 µm in living brains by use of a Ti:Al_2O_3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28, (12), 1022 (2003).
  17. Gomez-Conde, I., Caetano, S. S., Tadokoro, C. E., Olivieri, D. N. Stabilizing 3D in vivo intravital microscopy images with an iteratively refined soft-tissue model for immunology experiments. Comput Biol Med. 64, 246-260 (2015).
  18. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
  19. Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. J Immunol Methods. 438, 35-41 (2016).
  20. Haghayegh Jahromi, N., Tardent, H., Enzmann, G., et al. A novel cervical spinal cord window preparation allows for two-photon imaging of T-Cell interactions with the cervical spinal cord microvasculature during experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 8, 406 (2017).
  21. Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), e52607 (2015).
  22. Gaylo, A., Overstreet, M. G., Fowell, D. J. Imaging CD4 T cell interstitial migration in the inflamed dermis. J Vis Exp. (109), e53585 (2016).
  23. Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8, (8), 91-96 (2011).
  24. Liou, H. L. R., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. J Vis Exp. (60), e3720 (2012).
  25. Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am J Physiol Cell Physiol. 297, (6), C1347-C1357 (2009).
  26. Masedunskas, A., Porat-shliom, N., Tora, M., Milberg, O., Weigert, R. Intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins. J Vis Exp. (79), e50558 (2013).
  27. Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc Natl Acad Sci. 108, (33), 13552-13557 (2011).
  28. Milberg, O., Shitara, A., Ebrahim, S., et al. Concerted actions of distinct nonmuscle myosin II isoforms drive intracellular membrane remodeling in live animals. J Cell Biol. 216, (7), 1925-1936 (2017).
  29. Kuriki, Y., Liu, Y., Xia, D., et al. Cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct. J Vis Exp. (51), e3074 (2011).
  30. Chen, G. Y., Nuñez, G. Sterile inflammation: Sensing and reacting to damage. Nat Rev Immunol. 10, (12), 826-837 (2010).
  31. McLaren, A. Some causes of variation of body temperature in mice. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 46, (1), 38-45 (1961).
  32. Baumgart, K., Wagner, F., Gröger, M., et al. Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled hydrogen sulfide in anesthetized and ventilated mice. Crit Care Med. 38, (2), Accessed November 21, 2017 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20095069 588-595 (2010).
  33. Crouch, A. C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature. Int J Hyperth. 1-13 (2017).
  34. Smith, C. J., Caldeira-Dantas, S., Turula, H., Snyder, C. M. Murine CMV infection induces the continuous production of mucosal resident T cells. Cell Rep. 13, (6), 1137-1148 (2015).
  35. Lindquist, R. L., Shakhar, G., Dudziak, D., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat Immunol. 5, (12), 1243-1250 (2004).
  36. Riedl, J., Flynn, K. C., Raducanu, A., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, (3), 168-169 (2010).
  37. Chtanova, T., Hampton, H. R., Waterhouse, L. A., et al. Real-time interactive two-photon photoconversion of recirculating lymphocytes for discontinuous cell tracking in live adult mice. J Biophotonics. 7, (6), 425-433 (2014).
  38. Kyratsous, N. I., Bauer, I. J., Zhang, G., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, (31), E6381-E6389 (2017).
  39. Mank, M., Reiff, D. F., Heim, N., Friedrich, M. W., Borst, A., Griesbeck, O. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys J. 90, (5), 1790-1796 (2006).
  40. Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging. Opt Express. 25, (8), 9435 (2017).
  41. Potma, E. O., Xie, X. S. Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. J Raman Spectrosc. 34, (9), 642-650 (2003).
إعداد موريني الغدة اللعابية اللهاة تستقيم مجهرية إينترافيتال
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).More

Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter