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Immunology and Infection

直立活体显微术制备小鼠颌下腺涎腺

doi: 10.3791/57283 Published: May 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

我们描述了一个协议, 以手术揭露和稳定的小鼠颌下腺腺活体成像使用直立活体显微镜。该协议很容易适应小鼠和其他小啮齿目动物头部和颈部区域外分泌腺体。

Abstract

颌下腺 (SMG) 是三大涎腺之一, 对许多不同领域的生物研究, 包括细胞生物学, 肿瘤学, 牙科和免疫学感兴趣。SMG 是由分泌上皮细胞、肌、内皮细胞、神经和细胞外基质组成的分泌腺。大鼠和小鼠的动态细胞过程以前已经被成像, 主要是使用倒置的多光子显微镜系统。在这里, 我们描述了一个简单的协议, 以手术准备和稳定麻醉小鼠在体内的在活体成像与直立多光子显微镜系统。我们提出了具有代表性的活体图像集内源性和过继转输转移荧光细胞, 包括标签的血管或唾液导管和第二次谐波生成, 以可视化纤维胶原。总之, 我们的协议允许手术制备小鼠涎腺在直立显微镜系统, 这是通常用于活体成像在免疫学领域。

Introduction

唾液由外分泌腺体分泌来润滑食物, 保护口腔粘膜表面, 并提供消化酶和抗菌物质1,2。除了在口腔黏膜下层散置的小涎腺外, 根据其位置12, 还有三个双侧的主要腺体被确定为腮腺、舌下和颌下腺。金字塔状上皮细胞, 组织成烧瓶状囊 (腺泡细胞) 或 demilunes 包围的上皮细胞和基底膜, 分泌的浆液和粘液成分的唾液1。腺泡细胞狭窄的腔内空间排水成夹层导管, 直到它们最终加入一个排泄管道1。SMG 的主要排泄管称为沃顿商学院的管道 (WD), 并打开到舌下阜3,4。因此, SMG 上皮隔间是一个高度 arborized 的结构, 具有流形终端端点, 类似于一束葡萄1,5,6。SMG 间质由血液和淋巴管组成, 内含于结缔组织7中, 内含副交感神经8和细胞外基质 5. 正常的人和啮齿动物的涎腺也含有 T 细胞, 巨噬细胞和树突状干细胞9, 以及分泌免疫球蛋白 A (IgA) 到唾液9,10的血浆细胞。由于其在健康和疾病方面的多方面作用, SMG 在许多生物研究领域都有兴趣, 包括牙科4、免疫学11、肿瘤学12、生理学8和细胞生物学3

动态细胞过程和交互的成像是生物学研究中的一个强有力的工具13,14。基于非线性光学 (NLO) 的深部组织成像和创新 inmicroscopes 的发展, 它依赖于通过样本对多个光子的散射或吸收, 从而可以直接检查复杂组织中的细胞过程13 ,15。多光子的吸收涉及用低能光子传递总励磁能量, 这限制了荧光对焦平面的激发, 从而允许更深层的组织穿透, 减少了光损伤和噪声。励磁13,15。这一原则采用双光子显微镜 (2PM), 并允许在高达1毫米15,16深度的荧光标本上进行成像。虽然商用2PM 设置已变得方便和可靠, 活体成像的主要挑战是仔细暴露和稳定麻醉小鼠的靶器官, 特别是对时间失效序列的成像。数据获取后数字漂移校正的几种方法已发布17,18和我们最近开发了 "VivoFollow", 一个自动校正系统, 它抵消缓慢的组织漂移实时使用计算机化阶段19。然而, 对于高质量的成像, 要尽量减少组织运动, 尤其是呼吸或心跳导致的快速运动, 这仍然是至关重要的19。为多个器官 (包括脊髓20、肝脏21、皮肤22、肺23和淋巴结24) 发布了准备和稳定程序。此外, 大鼠涎腺成像模型已经开发了3,25和进一步完善的高分辨率活体成像的小鼠 SMG 量身定做的倒置显微镜设置26,27,28

在这里, 我们提出了一个实用的和适应性的协议, 活体成像的小鼠的直立非线性显微镜, 这是普遍用于活体成像在免疫学领域。为此, 我们改良了一个广泛使用的固定化阶段用于腘淋巴结准备。

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Protocol

所有动物的工作都已得到州动物试验委员会的批准, 并根据联邦准则进行。

1. 麻醉鼠标

  1. 佩戴个人防护用品, 包括实验室外套和手套。
  2. 将氯胺酮、甲苯噻嗪和生理盐水混合在一起, 其工作浓度分别为20毫克/毫升和1毫克/毫升。将工作库存腹腔 (ip) 注入8-10 µL/克鼠标。把鼠标放回笼子里。
    注: 本协议已测试6至40周的男性和女性小鼠的 C57BL/6 背景。
  3. 准备乙酰丙嗪溶液在2.5 毫克/毫升, 并注入30µL, 15 分钟后, 氯胺酮-甲苯噻嗪注射 (75 µg/小鼠)。
  4. 5-15 分钟后, 检查是否有足够的麻醉和镇痛通过控制反射,例如, 撤回反射的爪子或角膜反射。
  5. 控制的反射大约每30分钟在整个实验期间。皮下注射氯胺酮/甲苯噻嗪在1.5 µL/克鼠, 每60分钟或更早, 如果反射是阳性的。
    注意: 由于老鼠的固定, 吸入性麻醉 (如异氟醚) 不能与此协议一起使用。

2. 从操作区取出毛皮

  1. 使用电动剃刀刮胡子的区域, 大致从5毫米的嘴尾向前腿, 伸展在颌骨对两个耳朵。
  2. 用棉签将脱毛膏涂抹在剃光区。经过3分钟的仔细和彻底清除,例如, 用湿纸巾擦拭。

3. 将鼠标固定在舞台上

注: 本协议使用自定义阶段 (图 1), 配备两个可自由调节的盖子滑动架 (一个附在舞台上的螺钉, 另一个固定在它上);可调节的立体定向耳棒;可以用螺钉拧紧的绳子;可自由调节的金属加热环;和一个凸起的区域, 指定放置鼠标的躯干。这一阶段是从腘淋巴结阶段修改, 增加了立体定向支架和支持下盖滑动持有形象化 SMG。本阶段的详细计划或报价可根据要求提供。

  1. 通过拆卸加热环和可拆卸盖滑动架的支架来准备舞台。拧松耳棒支架和固定护盖滑动架的螺钉。把一块纱布贴到舞台的中心区域, 充当老鼠的床上用品。
  2. 使用胶水 (请参阅材料表) 将20毫米直径的盖玻璃连接到圆柱形金属支架的顶部 (这将是下盖玻璃)。将25毫米的盖子玻璃粘附在扁金属架的底部 (这将是上盖玻璃)。确保盖眼镜与金属持有者重叠约2-3 毫米, 其余的玻璃仍然没有油脂和胶水。
  3. 将鼠标放回纱布上, 垂直于伸展的绳子, 头部居中在耳棒之间。
  4. 用手术胶带将鼠标的上肢固定在舞台上。
  5. 接下来, 把绳子钩到前门牙上, 收紧, 直到下巴达到水平位置。使用一个有角的弯曲钳稍微拉出舌头从嘴, 这有助于呼吸。
  6. 紧紧的, 但不是有力的, 拉尾巴和磁带到舞台上。
  7. 将耳条对齐, 以在条形和舞台边缘之间达到近似的30°角。为了确保这个角度, 使用三角形标尺在一张纸上绘制一个右和左的30°角, 并将透明的舞台放在纸张上以相应地对齐。
  8. 通过同时将左右杆向内移动, 直到下巴 immotile, 拧紧螺钉, 固定耳条之间的颚部。在固定下颚之前、期间和之后观察胸部运动。呼吸减少或缺席表明, 酒吧是固定在颈部, 而不是颚骨;在这种情况下, 请立即重复安装过程。
  9. 给鼠标加热,例如, 在舞台下面放置一盏暖气灯和/或加热垫。

4. 用显微镜手术暴露涎腺

注意: 以下步骤需要使用显微镜、细钳和手术剪刀。由于过程是终端, 没有必要保持无菌的操作条件。乙醇清洗仪器足够了。

  1. 找到右侧的 SMG 叶的近似位置, 寻找一个轻微的突起在皮肤大约15毫米尾骶部和5毫米内侧的颚线。抬起一个小的皮肤褶皱的中心隆起和削减它创造和开放约5毫米长度。
  2. 立即在伤口周围的皮肤上涂上4毫米高的真空油脂环。(使用真空油脂填充注射器与钝25克皮下针)。
  3. 用盐水填充油脂环, 以确保组织在手术过程中保持湿润。
  4. 在显微镜下, 使用以下程序扰乱结缔组织: 用一个细钳牢牢地握住直接附着在 SMG 上的结缔组织, 然后用第二个钳把远端结缔组织拉到破裂。确保某些结缔组织仍然附着在 SMG 上;这是可取的, 因为它允许处理。不要用镊子触摸腺体本身, 因为这会导致出血。
  5. 重复这种扰乱结缔组织的运动首先在腺体的顶端, 然后在内侧 (在 SMG 的右和左叶之间)。请勿将舌下与颌下腺分开。
  6. 继续逆时针移动外侧结缔组织 (内侧至尾部, 到远端, 延髓)。
  7. 确保血液供应, 传出淋巴管和涎腺导管, 这些都位于腺体的颅骨部位的捆绑, 没有破裂。
  8. 一旦外侧结缔组织被破坏, 使用镊子把连接到 smg 尾端的结缔组织向上提起, 以解除 smg 的尾端。从尾部开始, 并向延髓端移动, 扰乱了 SMG 叶下方的结缔组织。
  9. 继续, 直到所有的连接组织的所有地点的 SMG 被删除 (不包括延髓网站与主要喂养/排泄血管和 WD)。

5. 固定腺体

  1. 确认含生理盐水的润滑脂环至少有4毫米高且未泄漏 (见步骤 4.2)。
  2. 安装下盖玻璃 (见步骤 3.2), 通过附加金属棒到其高度可调的持有人。确保盖板滑动架调整到最高位置, 并在连接到舞台时不接触润滑脂环。将持有者从尾部方向定位到小鼠的角度, 其盖子滑动覆盖了露出的裂片的大约两个 (尾部和远端部分)。把盖子玻璃放低, 直到它与腺体接触。
  3. 完成盖玻璃顶部的润滑脂环, 形成新的盐水库。
  4. 小心地拉上的 SMG 瓣顶部的盖子滑与镊子, 只接触连接到它的结缔组织 (器官可以翻转与底部的网站面对向上)。
  5. 确保润滑脂环的均匀高度至少为4毫米, 不泄漏。如有必要, 用30克填充生理盐水的注射器重新填充盐水水库。
  6. 确保上盖玻璃的盖玻璃架处于其最高位置。使用螺钉将金属支架与 25 mm 上盖玻璃连接在支架上。使用可调节螺丝的持有人定位的封面玻璃, 使 SMG 在中间居中。
  7. 使用可调支架螺钉, 将顶盖玻璃降低至直接与 SMG 接触。在此步骤中观察腺体的形状和着色。如果腺体表面积较大, 或者着色改变 (例如从粉红色到白色), 立即将盖玻璃置于更高的位置, 以减轻 SMG 的压力。
  8. 在水库外寻找气泡和盐水, 检查盐水水库是否漏水。如果检测到泄漏或气泡, 请卸下盖板和所有油脂, 然后从步骤2重新启动。
  9. 螺丝关闭所有固定螺钉。

6. 固定加热环和温度探头

  1. 将温度探头插入储层并将其放置在靠近腺体的位置, 然后将探头导线贴到舞台上。
  2. 将润滑脂环应用到顶盖滑动上, 与在中心的 SMG (润滑脂环的直径应对应于加热环的直径)。将加热环放在盖子滑动顶部, 用油脂密封。将加热环的油管胶带放到舞台上。

7. 成像

注: 我们使用直立双光子显微镜系统, 配备可调谐 Ti: Sa 激光器和荧光显微镜与水浸泡20X 或25X 目标。通过使用自动阶段和 VivoFollow19, 可以实现在采集过程中对组织漂移进行实时校正。这提高了图像采集的稳定性, 但不是必需的。

  1. 使用显微镜制造商提供的适当软件打开直立显微镜系统。将 Ti: Sa 激光器调至 780-900 nm 的激发波长。
  2. 将加热管连接至加热环。蠕动式水泵循环热水 (通过在80°c 水浴中浸没部分油管加热) 通过环来温暖 SMG。
  3. 将温度探头连接到数字温度计。如果温度不介于摄氏35-39 摄氏度之间, 则调整蠕动泵的速度。泵的工作速度越快, 对象得到的温度越热, 反之亦然。
  4. 在开始图像采集之前, 对血液流速进行视觉控制。仔细检查白细胞通过薄毛细血管或荧光葡聚糖注射液。
    注: 静脉注射的荧光葡聚糖在血液流动是生理的时候, 会立即填满整个 SMG 的血管。这在这个过程中几乎总是如此。
  5. 为了遵循免疫细胞, 成像深度通常介于20-150 µm 的 2nd谐波生成信号所识别的 SMG 表面之下。记录图像栈150-300 µm 的视野, 像素分辨率约 512 x 512 或更高, z 深度20-60 µm 与间距2-4 µm 之间的图像。每20-30 秒重复一次堆栈捕获, 总工期为20-60 分钟。
  6. 使用数字温度计控制在获得一个图像序列后的最低和最高温度水平。如果最小或最大值不在37到2°c 的范围内, 则丢弃图像序列。在图像序列之间重新填充水以实现目标的浸入。
  7. 在成像会话结束时, 弄死在麻醉下通过 CO2窒息老鼠。
    注: 这是根据瑞士联邦动物实验指南;其他有关安乐死的准则可能适用于其他地方。

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Representative Results

该协议允许成像几乎所有的背部或腹侧的 SMG。视野通常也包括舌下涎腺, 这与在细胞成分中的 SMG 略有不同4。两个腺体由纤维胶原蛋白封装, 并细分成裂片。大多数2PM 系统可以通过测量 2nd谐波信号来产生纤维胶原的无标签图像, 但通常需要荧光分子来可视化细胞和亚型结构。例如, 绿色荧光蛋白 (GFP) 的无处不在的转基因表达与 2nd谐波信号结合, 足以识别腺泡细胞、导管和血管在 SMG 的形态学特征。该装置可用于观察具有细胞类型特异表达式的转基因荧光标记物, 以识别特定的细胞子集。图 2显示了一个网络 ofCOL1A1-GFP 的报告, 表达了结缔组织的成纤维细胞样胞。也显示血管, 标记的静脉注射荧光染料耦合到高分子量葡聚糖。当染料被注入 retrogradually 到 WD29中时, 管道的腔室也可以被标记 (图 3)。

Figure 1
图 1: 自定义阶段.(a 和 a *) 两个可自由调节的盖子滑动架;(b 和 b *) 可调节的立体定向耳棒;(c) 可以用螺钉拧紧的绳子;(d) 可自由调节的金属加热环;(e) 指定放置鼠标躯干的凸起区域。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 血管标记 (红色) 和 COL1A1-GFP 表示细胞的网络 (绿色)。用静脉注射的德州红葡聚糖共轭 (兆瓦 70 kDa) 标记的血管。纤维胶原在两个裂片之间被可视为 2nd谐波信号 (蓝色)。显示的是一个 z 投影的15堆积图像与47µm 深度。缩放条 = 40 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 在 WD 注入后标记的管腔导管.血管标记与 70 kDa 兆瓦德州红葡聚糖 (红色), 管腔的标记与层叠蓝葡聚糖 (白色; 10 kDa 兆瓦) 通过通过 WD 和过继转输转移的GFP +CD8 + T 细胞 (绿色) 在 SMG 的逆行注射。显示的是一个27堆叠图像的单 z 投影, 其深度为50µm. 缩放条 = 40 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

该协议提供了一个简单的方法,在体内成像的小鼠颌下腺和舌下涎腺使用直立非线性显微镜经常使用的免疫学领域。该方法可用于头颈区其他外分泌腺体的成像。例如, 我们的实验室以类似的方式对泪腺进行了成像 (不显示)。

除去在 SMG 周围的结缔组织是这个协议最关键的步骤, 因为意外的组织损伤可能发生。由于 smg 的组织会变得缺氧, 因此对 smg 的主要血液供应造成的损害必须立即终止实验。如果 SMG 组织本身受损, 出血通常会因凝固而自然停止。然而, 需要考虑的是, 损伤引发无菌炎症和促炎细胞因子释放30, 这可能影响实验读数。在显微外科手术中, 更常见的, 但不太重要的并发症是盐水水库的渗漏。要尽量减少漏油的发生, 总要将油脂涂抹在干燥、无毛的皮肤上。修补泄漏通常是徒劳的: 取而代之的是, 除去所有油脂, 用干棉签清洁皮肤, 从头开始重新应用。

在成像过程中, 必须保持与生理体温接近的温度 (大约37摄氏度的雄性和雌性 C567BL/6 小鼠31)。由于亚低温和热疗改变血流32,33, 在这些条件下, SMG 的生理功能不能假设。然而, 我们观察到在小 (2 摄氏度) 的血液流动和 T 细胞运动中没有差异, 瞬态 (< 5 分钟) 偏离最佳温度。

最小化组织运动对良好的影像质量至关重要。不同类型的不需要的组织运动可能发生, 并有典型的原因, 可以接受诊断。首先, 连续的 xyz 漂移通常是由 SMG 通过附着的结缔组织慢慢地漂回到原来的位置而引起的。如果下盖玻璃安装得太高, 或者在 SMG 周围的结缔组织没有彻底破坏, 就会发生这种情况。其次, 如果温度不稳定, 可能会发生缓慢和连续的 z 漂移。在这种情况下仔细调整加热, 等待温度稳定, 在成像前大约15分钟。最后, 当生理盐水室不紧密密封时, 脉动组织运动发生。压力在盐水室中随着每个呼吸周期而积聚和释放。与泄漏或气泡结合, 这导致脉动流体流动, 直接转化为 SMG 组织。在这种情况下, 重组的盖子玻璃和盐水室是最可靠的解决方案。

最大成像深度取决于使用的励磁波长和显影。正如在几乎所有的活体成像设置, 红色转移染料或荧光蛋白, 可以激发长波长 (900-1, 100 nm), 使更深层次的组织成像比绿色染料和较短的激发波长。

SMG 已被用作胞吐作用和膜重塑的模型器官3, 27, 28,感染34, 自身免疫11, 肿瘤生物学12。它进一步允许多种形式的操作: 染料, 药理化合物和抗体可以通过血流传递到腺体。另外, SMG 可以直接通过 WD 的插管来定向, 该方法已用于提供病毒11、dextrans3、DNA25、染料29或药理代理3

活体成像领域继续从不断增长的基因和生物化学荧光标记技术工具箱中获利。基因工程的进展提供了具有尖端荧光标记的鼠标线和细胞线。最近的示例包括标记特定的单元格子集 (CD11c+单元格35) 或动态骨架蛋白 (Lifeact36)、用于单元跟踪37的 photoconvertible 标记以及实时的核记者易位 (NFAT38) 或钙信号39。其他应用可能使用荧光生化探针, 突出特定的亚细胞间隔 (如 DNA 结合 4 ', 6-diamidino 2-苯基吲哚 (DAPI) 或亲脂膜染料)。现代 NLO 显微镜提供了许多可能的解决方案, 以最好的回答实验问题。例如, 已开发了复用双光子成像, 以强烈增加最大捕获速度40。其他技术提供无标签多光子成像, 可以通过生成第二或第三谐波信号15, 或者通过测量分子的特征共振振动 (相干反斯托克斯拉曼散射)41。因此, 在可行的组织暴露和稳定的过程中, 实验设计的极限主要由实验者的资源和创造力所确定。

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Disclosures

没有宣布利益冲突。

Acknowledgments

这项工作由瑞士国家基金会 (SNF) 项目赠款31003A_135649、31003A_153457 和 31003A_172994 (JVS) 提供资金, Leopoldina 2011-16 (至 BS)。这项工作得益于在伯尔尼大学的 "显微成像中心" (MIC) 的光学设置。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Narketan 10 %  (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) Vetoquinol 3605877535982
Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) Bayer 680538150144
Saline NaCl 0.9% B. Braun 3535789
Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) Fatro 6805671900029
Electric shaver Wahl 9818L or similar
Hair removal cream Veet 4002448090656
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-1
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-0
Super glue Ultra gel, instantaneous glue Pattex, Henkel 4015000415040
Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm Menzel-Gläser 631-1343/ 631-1344
Grease for laboratories 60 g glisseal N Borer (VWR supplier) DECO514215.00-CA15
Surgical scissors Fine Science Tools (F.S.T ) 14090-09 or similar
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T ) 11252-20 or similar
Cotton swab Migros 617027988254 or similar
Gauze Gazin 5 x 5 cm Lohmann and Rauscher 18500 or similar
Stereomicroscope Leica MZ16 or similar
Texas Red dextran 70kDa  Molecular Probes D1864
Cascade Blue dextran 10kDa invitrogen D1976
Two-photon system LaVision Biotec TrimScope I and II or similar
XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective Olympus n/a or other water immersion objective 
Digital thermometer Fluke 95969077651

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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直立活体显微术制备小鼠颌下腺涎腺
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Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).More

Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).

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