ईमानदार Intravital माइक्रोस्कोपी के लिए Murine अवअधोहनुज लार ग्रंथि की तैयारी
Summary
हम शल्य चिकित्सा बेनकाब करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन और intravital इमेजिंग के लिए ईमानदार intravital माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर murine अवअधोहनुज लार ग्रंथि को स्थिर. यह प्रोटोकॉल चूहों और अन्य छोटे कुतर के सिर और गर्दन क्षेत्र की अन्य exocrine ग्रंथियों के लिए आसानी से अनुकूलनीय है ।
Abstract
अवअधोहनुज लार ग्रंथि (एके 47) तीन प्रमुख लार ग्रंथियों में से एक है, और सेल जीव विज्ञान, कैंसर विज्ञान, दंत चिकित्सा, और इम्यूनोलॉजी सहित जैविक अनुसंधान के कई विभिन्न क्षेत्रों के लिए ब्याज की है । एके 47 स्रावी उपकला कोशिकाओं, myofibroblasts, endothelial कोशिकाओं, नसों, और extracellular मैट्रिक्स के शामिल एक exocrine ग्रंथि है । चूहे और एके 47 में गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं पहले, ज्यादातर औंधा बहु फोटॉन माइक्रोस्कोप सिस्टम का उपयोग कर, imaged किया गया है । यहां, हम सर्जिकल तैयारी और anesthetized चूहों में murine 47 के स्थिरीकरण के लिए एक सीधा प्रोटोकॉल का वर्णन vivo इमेजिंग में के लिए ईमानदार बहु-फोटॉन माइक्रोस्कोप सिस्टम के साथ । हम अंतर्जात और adoptively के प्रतिनिधि intravital छवि सेट वर्तमान fibrillar कोलेजन कल्पना करने के लिए रक्त वाहिकाओं या लार नलिकाएं और दूसरी सुरीले पीढ़ी के लेबल सहित फ्लोरोसेंट कोशिकाओं का तबादला, । संक्षेप में, हमारे प्रोटोकॉल आमतौर पर इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में intravital इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जाता है, जो ईमानदार सूक्ष्म प्रणालियों, में माउस लार ग्रंथियों के सर्जिकल तैयारी के लिए अनुमति देता है ।
Introduction
लार भोजन को चिकना करने के लिए exocrine ग्रंथियों द्वारा स्रावित किया जाता है, मौखिक पथ की श्लैष्मिक सतहों की रक्षा, और पाचन एंजाइमों के साथ ही रोगाणुरोधी पदार्थ1,2उद्धार । मौखिक उप म्यूकोसा में interspersed मामूली लार ग्रंथियों के अलावा, उनके स्थान1,2के अनुसार, कर्णमूल, मांसल, और अवअधोहनुज के रूप में पहचान की प्रमुख ग्रंथियों के तीन द्विपक्षीय सेट कर रहे हैं । पिरामिड के आकार की उपकला कोशिकाओं, कुप्पी के आकार का sacs (acini) या demilunes है कि myoepithelial कोशिकाओं और एक तहखाने झिल्ली से घिरा हुआ है में आयोजित, लार के तरल और श्लेष्म घटकों स्रावित1. acini के संकीर्ण चमकीले अंतरिक्ष intercalated नलिकाओं में नालियों, जो धारीदार नलिकाओं में एकजुट जब तक वे अंत में एक एकल निकालनेवाला वाहिनी में शामिल होने के1। के मुख्य निकालनेवाला वाहिनी है व्हार्टन वाहिनी (WD) कहा जाता है और उपमांसल रसौली3,4में खुलता है । इस 47 उपकला डिब्बे इसलिए कई गुना टर्मिनल समापन के साथ एक उच्च arborized संरचना का प्रतिनिधित्व करता है, अंगूर1,5,6का एक बंडल जैसी । एके 47 interstitium रक्त और लसीका संयोजी ऊतक में एंबेडेड7 parasympathetic नसों8 और extracellular मैट्रिक्स5युक्त से बना है । सामान्य मानव और मूषक लार ग्रंथियों में भी टी कोशिकाओं, मैक्रोफेज, और वृक्ष कोशिकाओं9, साथ ही प्लाज्मा कोशिकाओं है कि Immunoglobulin एक (IgA) लार में9,10स्रावित होते हैं । स्वास्थ्य और रोग में अपनी बहुमुखी कार्यों के कारण, एके 47 दंत चिकित्सा4, इम्यूनोलॉजी11, कैंसर विज्ञान12, फिजियोलॉजी8, और कोशिका जीवविज्ञान सहित जैविक अनुसंधान के कई क्षेत्रों के लिए ब्याज का विषय है 3.
गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं और बातचीत की इमेजिंग जैविक अनुसंधान13,14में एक शक्तिशाली उपकरण है । गहरी ऊतक इमेजिंग और नवाचारों unरैखिक प्रकाशिकी (NLO), जो नमूना द्वारा कई फोटॉनों की कैटरिंग या अवशोषण पर निर्भर के आधार पर सूक्ष्मदर्शी का विकास, सीधे जटिल ऊतकों में सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए अनुमति दी गई है13 ,15. एकाधिक फोटॉनों के अवशोषण कम ऊर्जा फोटॉनों द्वारा कुल उत्तेजना ऊर्जा की डिलीवरी शामिल है, जो fluorophore उत्तेजना फोकल विमान को परिभाषित करता है और इस तरह ध्यान से बाहर से कम धूप और शोर के साथ गहरे ऊतक पैठ की अनुमति देता है उत्तेजना१३,१५. यह सिद्धांत दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी (2) द्वारा कार्यरत है और 1 मिमी15,16तक की गहराई में फ्लोरोसेंट नमूनों की इमेजिंग के लिए अनुमति देता है । जबकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 2 setups उपयोगकर्ता के अनुकूल और विश्वसनीय बन गए हैं, intravital इमेजिंग के लिए प्रमुख चुनौती को ध्यान से बेनकाब और anesthetized चूहों के लक्ष्य अंग स्थिर है, विशेष रूप से समय चूक श्रृंखला की इमेजिंग के लिए । डेटा अधिग्रहण के बाद डिजिटल बहाव सुधार के लिए कई तरीकों17,18 प्रकाशित किया गया है और हम हाल ही में विकसित “VivoFollow”, एक स्वचालित सुधार प्रणाली है, जो वास्तविक समय में धीमी ऊतक बहाव प्रतिक्रिया का उपयोग कर एक मधून स्टेज१९. हालांकि, यह अभी भी ऊतक गति को कम करने के लिए उच्च गुणवत्ता इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से तेजी से श्वास या दिल की धड़कन की वजह से आंदोलनों19. तैयारी और स्थिरीकरण प्रक्रियाओं रीढ़ की हड्डी20, जिगर21, त्वचा22, फेफड़े23, और लिम्फ नोड24सहित कई अंगों, के लिए प्रकाशित किया गया है । इसके अलावा, चूहे लार ग्रंथि इमेजिंग के लिए मॉडल3,25 विकसित किया गया है और आगे murine के उच्च संकल्प intravital इमेजिंग के लिए परिष्कृत एक औंधा माइक्रोस्कोप सेटअप26के अनुरूप है, 27 , 28.
यहां, हम murine के intravital इमेजिंग के लिए एक व्यावहारिक और अनुकूलनीय प्रोटोकॉल मौजूद ईमानदार रैखिक माइक्रोस्कोप, जो सामांयतः इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में intravital इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है का उपयोग कर । यह अंत करने के लिए, हम एक व्यापक रूप से नियोजित स्थिरीकरण जानुपृष्ठीय लिम्फ नोड की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया मंच संशोधित ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल अक्सर इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में इस्तेमाल किया ईमानदार गैर रेखीय माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर murine अवअधोहनुज और मांसल लार ग्रंथियों के vivo इमेजिंग में के लिए एक सीधा दृष्टिकोण प्रदान करता …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम स्विस नेशनल फाउंडेशन (SNF) परियोजना अनुदान 31003A_135649, 31003A_153457 और 31003A_172994 (JVS करने के लिए), और Leopoldina फैलोशिप LPDS 2011-16 (बी एस) द्वारा वित्त पोषित किया गया । यह काम बर्न् स विश्वविद्यालय के “माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सेंटर” (एमआईसी) के ऑप्टिकल setups से लाभांवित हुआ ।
Materials
| Narketan 10 % (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) | Vetoquinol | 3605877535982 | |
| Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) | Bayer | 680538150144 | |
| Saline NaCl 0.9% | B. Braun | 3535789 | |
| Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) | Fatro | 6805671900029 | |
| Electric shaver | Wahl | 9818L | or similar |
| Hair removal cream | Veet | 4002448090656 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-1 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-0 | |
| Super glue Ultra gel, instantaneous glue | Pattex, Henkel | 4015000415040 | |
| Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm | Menzel-Gläser | 631-1343/ 631-1344 | |
| Grease for laboratories 60 g glisseal N | Borer (VWR supplier) | DECO514215.00-CA15 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T ) | 14090-09 | or similar |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T ) | 11252-20 | or similar |
| Cotton swab | Migros | 617027988254 | or similar |
| Gauze Gazin 5 x 5 cm | Lohmann and Rauscher | 18500 | or similar |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | or similar |
| Texas Red dextran 70kDa | Molecular Probes | D1864 | |
| Cascade Blue dextran 10kDa | invitrogen | D1976 | |
| Two-photon system | LaVision Biotec | TrimScope I and II | or similar |
| XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective | Olympus | n/a | or other water immersion objective |
| Digital thermometer | Fluke | 95969077651 |
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