Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Beredning av murina Submandibular spottkörteln för upprätt Intravital mikroskopi

doi: 10.3791/57283 Published: May 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver ett protokoll för att kirurgiskt exponera och stabilisera den murina submandibular spottkörteln vid intravital bildåtergivning med upprätt intravital mikroskopi. Detta protokoll är lätt att anpassa till andra exokrina körtlar av huvudet och halsen regionen av möss och andra små gnagare.

Abstract

Den submandibular spottkörteln (SMG) är en av tre stora spottkörtlarna, och är av intresse för många olika fält av biologisk forskning, inklusive cellbiologi, onkologi, tandvård och immunologi. SMG är en exokrin körtel består av sekretoriska epitelceller, myofibroblaster, endotelceller, nerver och extracellulära matrix. Dynamiska cellulära processer hos råtta och mus SMG har tidigare varit avbildas, mestadels med hjälp av inverterad multi photon Mikroskop system. Här beskriver vi ett enkelt protokoll för kirurgisk beredning och stabilisering av murina SMG hos sövda möss för i vivo imaging med upprätt multi photon Mikroskop system. Vi presenterar representativ intravital bild uppsättningar av endogena och överförs adoptively fluorescerande celler, inklusive märkning av blodkärl eller saliv kanaler och andra harmoniska generation att visualisera fibrillar kollagen. Sammanfattningsvis möjliggör våra protokoll kirurgisk beredning av mus spottkörtlar i upprätt mikroskopi system som vanligen används för intravital imaging i immunologi.

Introduction

Saliv utsöndras av exokrina körtlar att smörja mat, skydda slemhinnorna av muntliga tarmkanalen, och till leverera matsmältningsenzymer samt antimikrobiella ämnen1,2. Förutom mindre spottkörtlarna som interspersed i muntliga submucosa, finns det tre bilaterala uppsättningar av stora körtlar identifierats som parotis, sublinguala och submandibular, enligt deras läge1,2. Pyramidformade epitelceller, organiserade i kolv-formade säckar (acini) eller demilunes som omges av myoepithelial celler och en basalmembranet, utsöndrar de serösa och slemhinnor komponenterna i saliv1. Smala luminala loppet av acini avloppet till ortodoxas kanaler, som förenas i tvärstrimmig kanaler tills de slutligen går med i en enda utsöndringsorganen kanal1. De viktigaste utsöndringsorganen kanalen av SMG kallas Wharton's duct (WD) och öppnar till den sublinguala karbunkel3,4. SMG epitelial facket utgör därför en mycket arborized struktur med grenrör terminal slutpunkter, som liknar en bunt av druvor1,5,6. Den SMG interstitium består av blodet och fartyg inbäddade i bindväv7 innehåller parasympatiska nerver8 och extracellulär matrix5. Normal människa och gnagare saliv-körtlar innehåller också T-celler, makrofager och dendritiska celler9, samt plasma celler som utsöndrar immunglobulin A (IgA) i saliv9,10. På grund av dess mångsidiga funktioner i hälsa och sjukdom är SMG ett ämne av intresse för många fält av biologisk forskning, inklusive tandvård4, immunologi11, onkologi12, fysiologi8och cellbiologi 3.

Avbildning av dynamiska cellulära processer och interaktioner är ett kraftfullt verktyg i biologisk forskning13,14. Utvecklingen av djup vävnad imaging och innovationer inmicroscopes baserat på ickelinjär optik (NLO), som förlitar sig på spridning eller flera fotoner absorberas av provet, är tillåtet att direkt undersöka cellulära processer i komplexa vävnader13 ,15. Absorptionen av flera fotoner innebär leverans av den totala exciteringsenergi av låg energi fotoner, som inskränker fluorophore magnetiseringen till fokalplanet och därmed tillåter djupare vävnad penetration med reducerad photodamage och buller från av fokus magnetiseringen13,15. Denna princip är anställd av 2-foton mikroskopi (2 PM) och möjliggör avbildning av fluorescerande prover i djup upp till 1 mm15,16. Samtidigt kommersiellt tillgängliga 2 PM uppställningar har blivit användarvänliga och driftsäkra, är den stora utmaningen för intravital imaging att noggrant exponera och stabilisera målorganet sövda möss, speciellt för avbildning av time lapse-serien. Flera metoder för digital drift korrigering efter datainsamling har varit publicerad17,18 och vi nyligen utvecklat ”VivoFollow”, ett korrigeringssystem för automatisk, vilket motverkar långsam vävnad drift i realtid med en datoriserade etapp19. Det är dock fortfarande kritiskt för högkvalitativa imaging för att minimera vävnad rörelse, särskilt snabba rörelser orsakas av andning eller hjärtslag19. Förberedelse och stabilisering förfaranden har publicerats för flera organ, inklusive ryggmärgen20, lever21, hud22, lung23och lymfkörtel24. Dessutom har modeller för råtta spottkörtel imaging utvecklat3,25 och förfinas ytterligare för högupplösta intravital avbildning av det murint SMG skräddarsys en inverterade mikroskopet setup26, 27 , 28.

Här presenterar vi ett praktisk och anpassningsbar protokoll för intravital avbildning av murina SMG med upprätt ickelinjära mikroskopi, som vanligtvis används för intravital imaging i immunologi. I detta syfte ändrade vi ett allmänt sysselsatta immobilisering skede används för Poplietallymfknutor lymfkörtel preparat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djur arbete har godkänts av utskottet kantonala för djur experiment och utfört enligt federala riktlinjer.

1. söva musen

  1. Använd personlig skyddsutrustning, inklusive labbrock och handskar.
  2. Blanda ketamin, xylazin och saltlösning en arbetande koncentration på 20 mg/mL och 1 mg/mL, respektive. Injicera arbetar beståndet intraperitonealt (i.p.) vid 8-10 µL/g av mus. Placera musen tillbaka i buren.
    Obs: Detta protokoll har testats för 6 - till 40-vecka-gammal manliga och kvinnliga möss med C57BL/6 bakgrund.
  3. Bereda Acepromazin lösning 2,5 mg/ml och injicera 30 µL i.p., 15 min efter ketamin-xylazin injektionen (75 µg/mus).
  4. Efter 5-15 min, kolla för adekvat anestesi och analgesi genom att kontrollera för reflexer, t.ex., tillbakadragande reflexen av tass eller hornhinnan reflex.
  5. Kontroll för reflexer ungefär varje 30 min under hela experimentet. Subkutant injicerar ketamin/xylazin på 1,5 µL/g mus, varje 60 min eller tidigare om reflexer är positiva.
    Obs: Inandning anestesi såsom isofluran kan inte användas med detta protokoll, på grund av fixering av musen.

2. ta bort pälsen från det operativa området

  1. Använda en rakapparat för att raka ett område som expanderar ungefär från 5 mm kaudalt mynningen mot frambenen, sträcker sig över käftar mot båda öronen.
  2. Gälla den rakade området med en bomullspinne hårborttagningskräm. Noggrant och grundligt bort efter 3 min, t.ex., genom att torka med våtservetter.

3. Fäst musen på scenen

Obs: Detta protokoll använder en anpassad scen (figur 1) utrustad med två fritt justerbar hållare för täckglas (ett knutna till scenen med en skruv, den andra fast permanent på den); Justerbar stereotaktisk öra barer; en sträng, som kan dras åt med en skruv; en fritt justerbar metall värme ring; och ett upphöjt område som utsetts att placera torsoen av musen. Detta skede ändras från ett Poplietallymfknutor lymfkörtel skede, med en extra stereotaktisk hållare och ett stöd för den lägre täckglas holding exteriorized SMG. Detaljerade planer eller citat av scenen finns tillgängliga på begäran.

  1. Förbereda scenen genom att ta bort innehavare för uppvärmning ringen och flyttbara täckglasets rättsinnehavaren. Lossa skruvarna på örat bar innehavare och fasta täckglasets rättsinnehavaren. Tejpa en bit gasbinda till området centrum av scenen, tjänstgör som sängkläder för musen.
  2. Använda lim (se Tabell för material) för att fästa en 20 mm diameter täckglaset överst i en cylindrisk metall hållare (detta kommer att vara lägre täckglaset). Limma en 25 mm ljusöppningen till botten av hållaren platt metall (detta kommer att det övre luckan glaset). Se till att täcka glasen överlappar cirka 2-3 mm med metall innehavare och att resten av glaset förblir fri från fett och limmet.
  3. Placera musen på ryggen på gasväv, vinkelrätt mot sträckt strängen, med huvudet centrerad mellan örat barer.
  4. Fixa de övre extremiteterna av musen på scenen med kirurgisk tejp.
  5. Därefter koppla strängen in på övre främre framtänderna och dra åt tills käken når horisontalt. Använd en vinklad böjd pincett något dra ut tungan ur munnen, vilket underlättar andningen.
  6. Tätt, men inte kraftfullt, dra i svansen och Tejpa fast den på scenen.
  7. Justera fälten öra för att uppnå en vinkel på ca 30° mellan baren och kanten av scenen. För att säkerställa denna vinkel, Använd en triangel linjal för att rita en höger och vänster 30° vinkel på ett pappersark och placera transparent scenen på papperet att anpassa innehavare med detta.
  8. Fixa käken mellan örat stängerna genom att samtidigt flytta vänster och höger baren inåt tills käken är orörliga och dra åt skruvarna. Iaktta bröstet rörelse före, under och efter fastställande av käken. Minskad eller frånvarande andning indikerar att barerna är fasta i nacken, inte käkbenet; i detta fall upprepa förfarandet för fastställande omedelbart.
  9. Ge värme till musen, t.ex., genom att placera en värme lampa i närheten eller en värmedyna under scenen.

4. kirurgisk exponering av saliv körteln använder ett stereomikroskop

Obs: Följande steg kräver användning av ett stereomikroskop, fin pincett och kirurgisk sax. Eftersom förfarandet är terminal, är det inte nödvändigt att upprätthålla sterila förhållanden. Etanol-rengöras instrument räcker.

  1. Lokalisera den ungefärliga positionen för höger SMG LOB av letar efter en liten utbuktning i huden cirka 15 mm kaudalt av munnen och 5 mm mediala av käklinjen. Lyft ett litet hudveck i mitten av bula och skär den skapa och öppning ca 5 mm lång.
  2. Applicera omedelbart en 4 mm-hög ring av vakuum fett på huden runt snittet. (Använd en vakuum fettfyllda spruta med trubbiga 25 G injektionsnål).
  3. Fylla fett ringen med koksaltlösning att säkerställa vävnaden förblir fuktig under operationen.
  4. Under stereomikroskopet, störa det connective silkespappret med hjälp av följande procedur: använda en fin pincett att stadigt hålla en bit av bindväv som direktansluten till SMG och använda en andra pincett för att dra distala bindväv tills den spricker. Säkerställa att vissa bindväv förblir knutna till SMG; Detta är önskvärt eftersom det tillåter hantering. Vid inte körteln själv med hjälp av tången, eftersom detta kommer att orsaka blödning.
  5. Upprepa denna rörelse störa bindväv först ovanpå körteln, sedan på den mediala sidan (mellan den högra och vänstra loben av SMG). Inte att separera sublinguala från submandibular körteln.
  6. Fortsätta att ta bort den laterala bindväven moturs runt SMG (mediala till stjärtfenan, att distalt, rostralt).
  7. Säkerställa att blodtillförseln, efferent lymfkärlen, och saliv kanal, som är belägna i en bunt på webbplatsen kraniala körtel, inte är spruckit.
  8. När den laterala bindväven är störd, använda pincett för att dra den bindväv som bifogas i kaudala slutet av SMG uppåt för att lyfta det kaudala slutet av SMG. Störa det connective silkespappret nedanför den SMG loben, start från den kaudala och flytta i rostralt slutet.
  9. Fortsätt tills det connective silkespappret till alla platser i SMG avlägsnas (exklusive rostralt platsen med större utfodring/tömning blodkärl och WD).

5. fastställande av körteln

  1. Bekräfta att fett ringen håller saltlösning är minst 4 mm hög och inte läcker (se punkt 4.2).
  2. Installera den nedersta luckan glas (se steg 3,2) genom att fästa metallregeln till innehavaren justerbart. Säkerställa att innehavaren täckglas justeras till yttersta position och inte röra fett ringen när ansluten till scenen. Placera innehavaren från kaudala riktning i cirka 60° vinkel till musen, med cover slip som täcker ungefär två tredjedelar (kaudala och distala delar) av exponerade LOB. Lägre täckglaset tills den kommer i kontakt med körteln.
  3. Fylla fett ringen ovanpå täckglaset att bilda en ny saltlösning reservoar.
  4. Dra försiktigt på SMG LOB ovanpå täckglaset med pincett, bara röra det connective silkespappret bifogas (orgeln kan vändas med webbplatsen botten uppåt).
  5. Säkerställa att fett ringen har en jämn höjd av minst 4 mm och inte läcker. Om det behövs fylld påfyllning saltlösning behållaren med hjälp av en 30 G spruta med koksaltlösning.
  6. Se till att innehavaren skyddsglaset för övre täckglaset i sitt yttersta läge. Använd skruven för att fästa metallhållare med 25 mm övre luckan glas till innehavaren. Använd de justerbara skruvarna av innehavaren för att placera täckglaset så att SMG är centrerad i mitten.
  7. Använd skruvarna på justerbar hållare till lägre översta täckglaset tills det kontakter direkt SMG. Observera den form och färg av körteln under detta steg. Om körteln yta visas större eller färg ändras (till exempel från rosa till vitt), omedelbart sätta täckglaset till en högre position att minska trycket på SMG.
  8. Kontrollera saltlösning reservoaren för läckage genom letar luftbubblor och eller droppar koksaltlösning utanför behållaren. Om en läcka eller luft bubbla upptäcks, ta bort både täckglas och allt fett och starta om från steg 2.
  9. Skruv stänga alla fixering skruvar.

6. fastställande av värme Ring och temperatursond

  1. Infoga en temperatursond in i reservoaren och placera den nära körteln och sedan tejpa sonden tråd till scenen.
  2. Tillämpa en fett-ring till det översta täckglaset, med SMG i mitten (diametern av fett ringen bör motsvara diameter av värme ring). Placera värme ringen ovanpå täckglaset och försegla med fett. Tejpa slangen av värme ring till scenen.

7. imaging

Obs: Vi använder en upprätt två-foton Mikroskop system utrustade med en avstämbara Ti:Sa Laser och fluorescerande Mikroskop med vatten-immersion 20 X eller 25 X mål. Realtid korrigering av vävnad drift under förvärv kan implementeras med hjälp av en automatiserad scen och VivoFollow19. Detta förbättrar stabiliteten för bild förvärv, men krävs inte.

  1. Slå på upprätt mikroskopi systemet med hjälp av en lämplig programvara som tillhandahålls av tillverkaren mikroskopet. Trimma en 780-900 nm excitation våglängd Ti:Sa Laser.
  2. Anslut slangen värme till uppvärmning ringen. En Peristaltisk pump cirkulerar varmvatten (uppvärmd av dränka en del av slangen i en 80° C vattenbad) genom ringen att värma SMG.
  3. Anslut den temperatur sonden till en digital termometer. Justera hastigheten på den peristaltiska pumpen om temperaturen är inte mellan 35-39 ° C. Ju snabbare pumpen fungerar, desto varmare objektet blir, och vice versa.
  4. Innan du börjar bild förvärvandet, utföra en visuell kontroll av de blod flödeshastigheter. Kontrollera noga leukocyt passage genom de tunna kapillärerna eller fluorescerande dextran injektion.
    Obs: Intravenöst injicerad fluorescerande dextran kommer att omedelbart fylla den hela SMG vaskulatur när blodflödet är fysiologiska. Detta är praktiskt taget alltid är fallet i detta förfarande.
  5. För att följa immunceller, är imaging djup vanligtvis mellan 20-150 µm under ytan av SMG identifieras av 2nd harmoniska generation signalen. Spela in bildstaplar av 150-300 µm synfält med PIXELupplösning på ungefär 512 x 512 eller högre, och z-djupet av 20-60 µm med mellanrum på 2-4 µm mellan bilderna. Upprepa stack förvärv varje 20-30 s för sammanlagt 20-60 min.
  6. Använd digitala termometern för att styra de lägsta och högsta temperatur nivåerna efter förvärvet av en bildsekvens. Kassera bildsekvens om de minimi- och maximumvärden inte är i spänna av 37 ± 2 ° C. Fyll på vatten för nedsänkning av mål mellan bildsekvenser.
  7. I slutet av bildsession, eutanasi möss av CO2 kvävning under narkos.
    Obs: Detta är i enlighet med schweiziska federala riktlinjer av djurförsök; andra riktlinjer för dödshjälp tillkomma någon annanstans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll tillåter avbildning av nästan hela dorsala eller ventrala sidan av SMG. Synfältet innehåller vanligtvis också en sublingual spottkörtel, som skiljer sig något från SMG i cellulära sammansättningen4. Båda körtlar är inkapslat av fibrillar kollagen och indelas i lober. De flesta 2 PM system kan producera en etikett-gratis bild av fibrillar kollagen genom att mäta 2nd harmoniska signalen, men vanligtvis fluorescerande molekyler behövs för visualisering av cellulär och subcellulär strukturer. Exempelvis är allestädes närvarande transgena uttrycket av grönt fluorescerande protein (GFP) i kombination med 2nd harmoniska signalen tillräcklig för att identifiera acini, kanaler och blodkärlen i SMG av deras morfologiska egenskaper. Denna inställning kan användas att iaktta transgena fluorescerande markörer med cell typ specifika uttryck att identifiera specifika cellen delmängder. Figur 2 visar ett nätverk ofCOL1A1-GFP reporter-uttryckande fibroblast-liknande celler i bindväv. Också visat är blodkärl, märkt av intravenös injektion av ett fluorescerande färgämne kopplat till hög molekylvikt dextran. Luminala facket av trummorna kan också märkas (figur 3) när färgämnen injiceras retrogradually i WD29.

Figure 1
Figur 1 : Anpassade scenen. (a och a *) två fritt justerbar hållare för täckglas; (b och b *) justerbar stereotaktisk öra barer; (c) en sträng, som kan dras åt med en skruv; (d) en fritt justerbar metall värme ring; (e) upphöjt område som utsetts att placera torsoen av musen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Vaskulatur markör (röd) och nätverk av COL1A1-GFP uttrycker celler (grön). Vaskulatur märkt av intravenös injektion av Texas röd-dextran konjugat (MW 70 kDa). Fibrillar kollagen mellan två loberna är visualiseras som 2nd harmoniska signal (blå). Visas är en enda z-projektion av 15 staplade bilder med 47 µm djup. Skalstapeln = 40 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Luminala kanal märkt efter WD injektion. Blodkärl som märkt med 70 kDa-MW Texas röd-dextran (röd), kanal lumen märkt med cascade blå-dextran (vit; 10 kDa MW) via retrograd injektion genom WD och adoptively överförda GFP+ CD8+ T celler (grön) i SMG. Visas är en enda z-projektion av 27 staplade bilder med 50 µm djup. Skalstapeln = 40 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll erbjuder en okomplicerad metod för in-vivo imaging av murina submandibular och sublinguala spottkörtlar med upprätt icke-linjära mikroskopi används ofta i immunologi. Metoden kan anpassas för bildtagning av andra exokrina körtlar i regionen huvud och hals. Exempelvis utfört vårt lab avbildning av lacrimal körtel på ett liknande sätt (visas inte).

Ta bort bindväv runt SMG är det mest kritiska steget av detta protokoll, eftersom oavsiktlig vävnadsskada kan förekomma. Skador på de viktigaste blodtillförseln av SMG kräver omedelbar uppsägning av experimentet, eftersom SMG vävnaden blir hypoxisk. Om SMG vävnaden själv är skadad, blödning vanligtvis stannar naturligtvis genom koagulering. Det måste dock beaktas att skadan som utlöser steril inflammation och proinflammatoriska cytokiner släppa30, vilket skulle kunna påverka den experimentella avläsningen. En vanligare, men mindre kritiska komplikation under microsurgery finns läckor i reservoaren saltlösning. För att minimera förekomsten av läckor, alltid gälla fett torr, hårlös hud. Patchning en läcka är oftast meningslöst: istället bort alla i Grease, rengör huden med en torr bomullstuss och återapplicera från grunden.

Under imaging upprätthållas en temperatur nära den fysiologiska kroppstemperaturen (cirka 37 ° C för manliga och kvinnliga C567BL/6 möss31). Eftersom både hypo- och hypertermi alter blod flöde32,33, antas fysiologisk funktion av SMG inte under dessa villkor. Vi konstaterade dock ingen skillnad i blodflödet eller T cell motilitet under små (± 2 ° C), övergående (< 5 min) avvikelser från optimal temperatur.

Minimera vävnad rörelse är viktigt för bra bildåtergivning kvalitet. Olika typer av oönskade vävnaden rörelse kan uppstå, och har typiska orsaker som kan genomgå felsökning. För det första, kontinuerlig xyz-drift orsakas oftast av SMG långsamt drivande tillbaka till dess ursprungliga position genom bifogade bindväv. Detta händer om lägre täckglaset installerades för hög, eller bindväv runt SMG stördes inte grundligt. För det andra, långsam och kontinuerlig z-drift kan uppstå om temperaturen är instabil. I detta fall noggrant justera uppvärmningen och vänta tills temperaturen stabil, cirka 15 min innan imaging. Slutligen, pulserande vävnad rörelse uppstår när saltlösning kammaren inte är tätt förseglad. Trycket byggs upp och frigör i saltlösning kammaren med varje andning cykel. I kombination med läckage eller luftbubblor leder detta till pulserande flytande flöden som översätter direkt till SMG vävnaden. I detta fall, är ihopsättning av både locket glasögon och saltlösning kammare den mest pålitliga lösningen.

Den maximala imaging djup beror på excitation våglängden används och den fluorophores som anställd. Som i praktiskt taget alla intravital imaging uppställningar möjliggör röd-skiftat färgämnen eller fluorescerande proteiner som kan vara upphetsad med långa våglängder (900-1100 nm) djupare vävnad imaging än gröna färgämnen och kortare excitation våglängder.

SMG har använts som modell organ för endo - och exocytos och membran remodeling3,27,28, infektion34, autoimmunitet11och tumör biologi12. Det tillåter ytterligare många former av manipulation: färgämnen, farmakologiska föreningar och antikroppar kan levereras till körtel via blodomloppet. Alternativt kan SMG riktas direkt via kanylering av WD, som har använts för att leverera virus11, dextrans3, DNA25, färgämnen29eller farmakologiska medel3.

Intravital imaging fältet fortsätter att dra nytta av en växande verktygslåda av genetiska och biokemiska fluorescerande märkning tekniker. Framsteg inom genteknik ger mus linjer och cellinjer med sofistikerade fluorescerande markörer. Aktuella exempel är märkning av viss cell undergrupper (CD11c+ celler35) eller dynamiska cytoskeletal proteiner (Lifeact36), photoconvertible markörer för cell tracking 37och realtid reportrar av kärn translokation (NFAT38) eller kalcium signalering39. Andra program kan använda fluorescerande biokemiska sonder, som belysa specifika subcellulär fack (såsom DNA bindande 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) eller lipofila membran färgämnen). Moderna NLO mikroskopi erbjuder många möjliga lösningar för att bäst besvara de experimentella frågorna. Exempelvis har multiplexade två-photon imaging utvecklats för att starkt öka högsta förvärv hastighet40. Andra tekniker erbjuda etikett-fri multiphoton imaging, antingen genom att generera andra eller tredje harmoniska signaler15, eller genom att mäta karakteristiska resonans vibrationer av molekyler (sammanhängande anti Stokes Raman scattering)41. Således, när det finns genomförbara procedurer för vävnad exponering och stabilisering, gränserna för experimentell design ställs mestadels av experimenter's resurser och kreativitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter förklarade.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av schweiziska nationella stiftelsen (SNF) projektet grant 31003A_135649, 31003A_153457 och 31003A_172994 (till JVS) och Leopoldina gemenskap LPDS 2011-16 (till BS). Detta arbete benefitted från optiska uppställningar i ”mikroskopi Imaging Center” (MIC) vid universitetet i Bern.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Narketan 10 %  (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) Vetoquinol 3605877535982
Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) Bayer 680538150144
Saline NaCl 0.9% B. Braun 3535789
Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) Fatro 6805671900029
Electric shaver Wahl 9818L or similar
Hair removal cream Veet 4002448090656
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-1
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-0
Super glue Ultra gel, instantaneous glue Pattex, Henkel 4015000415040
Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm Menzel-Gläser 631-1343/ 631-1344
Grease for laboratories 60 g glisseal N Borer (VWR supplier) DECO514215.00-CA15
Surgical scissors Fine Science Tools (F.S.T ) 14090-09 or similar
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T ) 11252-20 or similar
Cotton swab Migros 617027988254 or similar
Gauze Gazin 5 x 5 cm Lohmann and Rauscher 18500 or similar
Stereomicroscope Leica MZ16 or similar
Texas Red dextran 70kDa  Molecular Probes D1864
Cascade Blue dextran 10kDa invitrogen D1976
Two-photon system LaVision Biotec TrimScope I and II or similar
XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective Olympus n/a or other water immersion objective 
Digital thermometer Fluke 95969077651

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. Digestive System. Digital Histology. John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. 101-121 (2005).
  2. Carpenter, G. Role of Saliva in the Oral Processing of Food. Food Oral Processing. Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 45-60 (2012).
  3. Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9, (10), 1801-1810 (2008).
  4. Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands. Acta Histochem Cytochem. 45, (5), 241-250 (2012).
  5. Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Front Oral Biol. 14, 48-77 (2010).
  6. Takeyama, A., Yoshikawa, Y., Ikeo, T., Morita, S., Hieda, Y. Expression patterns of CD66a and CD117 in the mouse submandibular gland. Acta Histochem. 117, (1), 76-82 (2015).
  7. Hata, M., Ueki, T., Sato, A., Kojima, H., Sawa, Y. Expression of podoplanin in the mouse salivary glands. Arch Oral Biol. 53, (9), 835-841 (2008).
  8. Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neurosci. 133, (1), 3-18 (2007).
  9. Le, A., Saverin, M., Hand, A. R. Distribution of Dendritic Cells in Normal Human Salivary Glands. Acta Histochem Cytochem. 44, (4), 165-173 (2011).
  10. Hofmann, M., Pircher, H. E-cadherin promotes accumulation of a unique memory CD8 T-cell population in murine salivary glands. Proc Natl Acad Sci. 108, (40), 16741-16746 (2011).
  11. Bombardieri, M., Barone, F., Lucchesi, D., et al. Inducible tertiary lymphoid structures, autoimmunity, and exocrine dysfunction in a novel model of salivary gland inflammation in C57BL/6 mice. J Immunol. 189, (7), 3767-3776 (2012).
  12. Szwarc, M. M., Kommagani, R., Jacob, A. P., Dougall, W. C., Ittmann, M. M., Lydon, J. P. Aberrant activation of the RANK signaling receptor induces murine salivary gland tumors. PLoS One. 10, (6), e0128467 (2015).
  13. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: A novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, (5), 481-491 (2010).
  14. Masedunskas, A., Milberg, O., Porat-Shliom, N., et al. Intravital microscopy. Bioarchitecture. 2, (5), 143-157 (2012).
  15. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21, (11), 1369-1377 (2003).
  16. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 µm in living brains by use of a Ti:Al_2O_3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28, (12), 1022 (2003).
  17. Gomez-Conde, I., Caetano, S. S., Tadokoro, C. E., Olivieri, D. N. Stabilizing 3D in vivo intravital microscopy images with an iteratively refined soft-tissue model for immunology experiments. Comput Biol Med. 64, 246-260 (2015).
  18. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
  19. Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. J Immunol Methods. 438, 35-41 (2016).
  20. Haghayegh Jahromi, N., Tardent, H., Enzmann, G., et al. A novel cervical spinal cord window preparation allows for two-photon imaging of T-Cell interactions with the cervical spinal cord microvasculature during experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 8, 406 (2017).
  21. Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), e52607 (2015).
  22. Gaylo, A., Overstreet, M. G., Fowell, D. J. Imaging CD4 T cell interstitial migration in the inflamed dermis. J Vis Exp. (109), e53585 (2016).
  23. Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8, (8), 91-96 (2011).
  24. Liou, H. L. R., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. J Vis Exp. (60), e3720 (2012).
  25. Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am J Physiol Cell Physiol. 297, (6), C1347-C1357 (2009).
  26. Masedunskas, A., Porat-shliom, N., Tora, M., Milberg, O., Weigert, R. Intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins. J Vis Exp. (79), e50558 (2013).
  27. Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc Natl Acad Sci. 108, (33), 13552-13557 (2011).
  28. Milberg, O., Shitara, A., Ebrahim, S., et al. Concerted actions of distinct nonmuscle myosin II isoforms drive intracellular membrane remodeling in live animals. J Cell Biol. 216, (7), 1925-1936 (2017).
  29. Kuriki, Y., Liu, Y., Xia, D., et al. Cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct. J Vis Exp. (51), e3074 (2011).
  30. Chen, G. Y., Nuñez, G. Sterile inflammation: Sensing and reacting to damage. Nat Rev Immunol. 10, (12), 826-837 (2010).
  31. McLaren, A. Some causes of variation of body temperature in mice. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 46, (1), 38-45 (1961).
  32. Baumgart, K., Wagner, F., Gröger, M., et al. Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled hydrogen sulfide in anesthetized and ventilated mice. Crit Care Med. 38, (2), Accessed November 21, 2017 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20095069 588-595 (2010).
  33. Crouch, A. C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature. Int J Hyperth. 1-13 (2017).
  34. Smith, C. J., Caldeira-Dantas, S., Turula, H., Snyder, C. M. Murine CMV infection induces the continuous production of mucosal resident T cells. Cell Rep. 13, (6), 1137-1148 (2015).
  35. Lindquist, R. L., Shakhar, G., Dudziak, D., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat Immunol. 5, (12), 1243-1250 (2004).
  36. Riedl, J., Flynn, K. C., Raducanu, A., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, (3), 168-169 (2010).
  37. Chtanova, T., Hampton, H. R., Waterhouse, L. A., et al. Real-time interactive two-photon photoconversion of recirculating lymphocytes for discontinuous cell tracking in live adult mice. J Biophotonics. 7, (6), 425-433 (2014).
  38. Kyratsous, N. I., Bauer, I. J., Zhang, G., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, (31), E6381-E6389 (2017).
  39. Mank, M., Reiff, D. F., Heim, N., Friedrich, M. W., Borst, A., Griesbeck, O. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys J. 90, (5), 1790-1796 (2006).
  40. Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging. Opt Express. 25, (8), 9435 (2017).
  41. Potma, E. O., Xie, X. S. Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. J Raman Spectrosc. 34, (9), 642-650 (2003).
Beredning av murina Submandibular spottkörteln för upprätt Intravital mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).More

Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter