Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Dik Intravital mikroskopi için fare Submandibular Tükürük bezi hazırlanması

doi: 10.3791/57283 Published: May 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Biz cerrahi olarak ortaya çıkarmak ve fare submandibular Tükürük bezi dik intravital mikroskobu kullanılarak intravital görüntüleme için stabilize etmek için bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı diğer ekzokrin bezleri için baş ve boyun bölgesinin fareler ve diğer küçük kemirgen kolayca uyarlanabilir.

Abstract

Submandibular Tükürük bezi (SMG) üç büyük tükürük bezleri biridir ve biyolojik araştırma, hücre biyolojisi, Onkoloji, diş hekimliği ve İmmünoloji dahil olmak üzere birçok farklı alanlar için ilgi olduğunu. SMG salgı epitel hücreleri, myofibroblasts, endotel hücreleri, sinirler ve hücre dışı matriks ekzokrin bir bezdir. Fare ve fare SMG dinamik hücresel süreçler daha önce görüntüsü, çoğunlukla kullanarak çoklu foton mikroskop sistemleri ters. Burada, cerrahi hazırlanması ve istikrar için in vivo düşsel dik çok foton mikroskop sistemleri ile imzalat farelerde fare SMG için basit bir protokol açıklayın. Endojen temsilcisi intravital görüntü kümesi sunmak ve adoptively floresan hücreleri, kan damarları veya tükürük kanalları ve fibriler kollajen görselleştirmek için ikinci harmonik üretimi etiketleme de dahil olmak üzere aktarılır. Özetle, bizim iletişim kuralı İmmünoloji alanında intravital görüntüleme için yaygın olarak kullanılan dik mikroskobu sistemlerindeki fare tükürük bezleri cerrahi hazırlanması için izin verir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tükürük gıda yağlamak, ağız yolu Mukozal yüzeylerin korumak ve sindirim enzimleri gibi antibakteriyel maddeler1,2teslim ekzokrin bezleri tarafından salgılanan. Sözlü submukoza içinde serpiştirilmiş küçük tükürük bezleri yanı sıra göre onların konumu1,2büyük bezleri parotid, dil ve çene, tanımlanan üç ikili kümesi vardır. Epitel hücreleri, Piramit şeklinde düzenlenen şişesi şeklindeki kesesi (acini) veya myoepithelial hücreleri ve bir membran, çevrili demilunes tükürük1seröz ve müköz bileşenleri salgılar. Acini akmak içine onlar sonunda bir tek boşaltım kanalı1' e katılmak kadar hangi çizgili kanalları birleştirmek ara kanalları dar luminal space. SMG ana boşaltım kanalı Wharton'ın kanal (WD) denir ve sublingual caruncle3,4açılır. SMG epitel yuvası bu nedenle son derece arborized bir yapı a bohça-in üzüm1,5,6benzeyen manifold terminal bitiş noktaları ile temsil eder. SMG interstitium kan ve lenf damarları parasempatik sinirler8 ve hücre dışı matriks5içeren bağ dokusu7 içinde gömülü oluşur. Normal insan ve kemirgen tükürük bezleri de T hücreler, makrofajlar ve dendritik hücreler9immünglobulin salgılar plazma hücreleri tükürük9içine,10(IgA) yanı sıra, içerir. Sağlığı ve hastalıkları çok yönlü işlevleri nedeniyle, SMG Biyolojik araştırma diş hekimliği4, İmmünoloji11, Onkoloji12, fizyoloji8ve hücre biyolojisi dahil olmak üzere, birçok alan için ilgi bir konudur 3.

Görüntüleme dinamik hücresel süreçler ve etkileşimleri, Biyolojik araştırma13,-14güçlü bir araçtır. Saçılma veya birden çok fotonlar emilimini örnek tarafından güvenen, doğrusal olmayan optik (NLO), temel derin doku görüntüleme ve yenilikler inmicroscopes gelişimini doğrudan hücresel süreçler karmaşık doku13 incelemek için izin verdi ,15. Birden çok fotonlar emilimini düşük enerji fotonlar, hangi sınırları fluorophore uyarma için odak düzlem tarafından teslim toplam uyarma enerji gerektirir ve böylece daha derin doku penetrasyonu düşük duyarlilik ve odak dışından gürültü ile sağlar uyarma13,15. Bu ilke İki fotonlu mikroskobu (2 PM) tarafından istihdam ve floresan örneklerin en fazla 1 mm15,16derinliklerinde görüntüleme sağlar. Kurulumları kullanıcı dostu ve güvenilir hale gelmiştir piyasada bulunan 2 de dikkatli bir şekilde ortaya çıkarmak ve imzalat fareler, hedef organ özellikle görüntüleme serisi zaman sukut için stabilize etmek üzere intravital görüntüleme için büyük sorun olduğunu. Veri toplama olmuştur sonra dijital drift düzeltme için birkaç yöntem17,18 yayınlandı ve "VivoFollow", gerçek zamanlı kullanarak yavaş doku drift zıt bir otomatik düzeltme sistemi en son geliştirdiğimiz bir Bilgisayarlı sahne19. Bu seçenek ancak, yüksek kaliteli doku hareket, özellikle hızlı hareketler nefes ya da kalp atışı19neden en aza indirmek için görüntüleme için hala önemlidir. Hazırlık ve stabilization yordamlar omurilik20, karaciğer21, Cilt22, akciğer23ve lenf nodu24de dahil olmak üzere birden fazla organ için yayınlanmıştır. Ayrıca, fare Tükürük bezi görüntüleme modellerinde gelişmiş3,25 edilmiş ve daha yüksek çözünürlüklü bir ters mikroskop Kur-26, SMG uyarlanmış antikorundan intravital görüntüleme için rafine 27 , 28.

Burada, İmmünoloji alanında intravital görüntüleme için yaygın olarak kullanılır dik doğrusal olmayan mikroskobu kullanarak fare SMG intravital görüntüleme için pratik ve uyarlanabilir iletişim kuralı mevcut. Bu amaçla, popliteal lenf nodu hazırlıkları kullanılan yaygın istihdam immobilizasyon sahne değiştiren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm hayvan iş hayvan deney için Kanton Komitesi tarafından onaylanmış ve federal kurallarına göre yapılır.

1. anestezi fare

  1. Önlük ve eldiven dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman giymek.
  2. Ketamin, xylazine ve serum 20 mg/mL ve 1 mg/mL, bir çalışma konsantrasyonu sırasıyla karıştırın. Çalışan hisse senedi intraperitoneally enjekte (IP) 8-10 µL/g fare de. Fare kafesin içine yerleştirin.
    Not: Bu protokol ile bir C57BL/6 arka plan 6 - için 40-hafta-yaşlı erkek ve dişi fareler için test edilmiştir.
  3. Acepromazine çözüm 2.5 mg/mL, hazırlamak ve 30 µL ı.p., 15 dk sonra ketamin-xylazine enjeksiyon (75 µg/fare) enjekte.
  4. 5-15 dakika sonra yeterli anestezi ve analjezi için kontrol ederek refleksleri, örneğin, para çekme refleks pençe veya Korneal refleks için kontrol edin.
  5. Refleksleri için yaklaşık her 30 dakika deneme süresi sırasında kontrol. Subkutan ketamin/xylazine enjekte 1,5 µL/g fare, her 60 dk veya önceki Eğer refleksleri olumludur.
    Not: İnhalasyon anestezi isoflurane gibi fare fiksasyonu nedeniyle bu protokolü ile kullanılamaz.

2. çalışma alanından kürk kaldırma

  1. Tıraş kabaca üzerinden 5 mm Kaudal ağız çene doğru her iki kulak üzerinde uzanan ön ayakları doğru genişleyen bir alan tıraş için kullanın.
  2. Traş alana bir pamuklu çubukla ile saç dökücü krem uygulayın. Dikkatle ve iyice 3 dakika sonra örneğin, ıslak mendil ile silerek kaldırın.

3. Sahne Alanı'nda Mouse fix

Not: Bu protokol için kapak paket fişi (bir sahne bir vida ile bağlı, diğer kalıcı olarak üzerine Sabit); iki serbestçe ayarlanabilir sahipleri ile donatılmış özel bir sahne (şekil 1) kullanır. ayarlanabilir stereotaksik kulak çubuklarını; bir vida ile sıkılır bir dize; serbestçe ayarlanabilir bir metal halka Isıtma; ve fare gövde yerleştirmek için yükseltilmiş içilir. Bu aşamada, eklenen bir stereotaktik sahibi ve exteriorized SMG tutan alt kapak SLIP desteği ile popliteal lenf nodu aşamasından değiştirilir. Ayrıntılı planlar veya Sahne Alanı'nın tırnak talep üzerine temin edilmektedir.

  1. Sahne Isıtma ring için sahipleri ve çıkarılabilir kapak fişi tutucu kaldırarak hazırlayın. Kulak çubuğu sahipleri ve sabit kapak fişi tutucu vidayı gevşetin. Bir parçası olarak kullanılan odada fare için Sahne Alanı'nın merkezi alanına gazlı bez bant.
  2. Yapıştırıcı ((Bu alt kapak cam olacak) bir silindirik metal tutucu tepesine bir 20 mm çapında cam takmak için Malzemeler tablobkz:). Bir 25 mm cam (Bu üst kapak cam olacaktır) düz metal tutucu altına tutkallayın. Kapak gözlük yaklaşık 2-3 mm metal sahipleri ile örtüşme ve cam kalan yağ ve tutkal serbest kalmasını sağlamak.
  3. Fareyi üzerine gazlı bez, gergin dizeye dikey sırtında kulak barlar arasında ortalanmış kafa yerleştirin.
  4. Üst ekstremite cerrahi bant ile sahne alanı'na fare düzeltmek.
  5. Ardından, dize üst ön kesici kanca ve çene bir yatay konuma ulaşana kadar sıkın. Açılı bir eğri forseps biraz dil nefes kolaylaştırır ağzından dışarı çıkarmak için kullanın.
  6. Sıkı bir şekilde, ama zorla değil, kuyruk çekin ve Sahne Alanı'na teyp.
  7. Yaklaşık 30 ° açı bar ve Sahne Alanı'nın kenar arasında elde etmek için kulak çubuklarını hizalayın. Bu açı emin olmak için sağ ve sol 30 derecelik açıyla bir yaprak kağıda çizmek için bir üçgen cetvel kullanın ve şeffaf sahne alanı sahipleri buna göre hizalamak için kağıt üzerinde yerleştirin.
  8. Çene çene immotile kadar içe doğru hareket ettirerek aynı anda sol ve sağ bar kulak çubuklar arasındaki düzeltmek ve vidayı sıkın. Göğüs hareketi öncesinde, sırasında ve çene sabitleme sonra gözlemlemek. Azaltılmış veya barlar boyun, çene kemiği değil; giderilen nefes yok gösterir Bu durumda, hemen sabitleme yordamı yineleyin.
  9. Isıtma fareyi örneğin, yakın bir Isıtma lambası ve/veya sahne alanı altında bir Isıtma yastığı yerleştirerek sağlar.

4. cerrahi maruz kalma bir Stereomicroscope kullanarak Tükürük bezi

Not: Aşağıdaki adımları stereomicroscope, fine forseps ve Cerrahi makas kullanılmasını gerektirir. Yordamı terminal olduğundan, steril çalışma koşulları sağlamak gerekli değildir. Etanol temizlik aletleri yeterli.

  1. Yaklaşık 15 mm Kaudal ağız ve çene hattı 5 mm medial deride hafif bir çıkıntı yaşar sağ SMG LOB yaklaşık konumunu bulun. Çıkıntı ortasında küçük cilt kapağı kaldırın ve oluşturmak için ve açılış yaklaşık 5 mm uzunlukta kesip.
  2. Hemen bir 4 mm-yüksek halka vakum yağ kesme çevreleyen cilt üzerinde uygulayın. (Bir vakum şırınga yağ dolu bir körelmenin 25 G Hipodermik İğne ile kullanın).
  3. Yağ halka doku operasyon sırasında nemli kalır emin olmak için serum fizyolojik ile doldurun.
  4. Stereomicroscope altında aşağıdaki yordamı kullanarak bağ dokusu bozabilir: bir iyi forseps bağ dokusu SMG için doğrudan bağlı bir parça sıkıca tutun ve bu Yırtığı kadar distal bağ dokusu çekmek için ikinci bir forseps kullanır. Bazı bağ dokusu SMG için bağlı kalmasını sağlamak; işleme sağlar beri bu arzu edilir. Bu kanama neden olur bu yana Forseps ile bezi kendisi dokunmayın.
  5. Tekrarlayın bağ dokusu ilk bezinin üstüne sonra (arasında SMG sağ ve sol LOB) medial tarafında dağıtmak, bu hareket. Hapı submandibular bezi ayırmayın.
  6. Lateral bağ dokusu çevresinde SMG (Kaudal, distal rostral için için için medial) saat yönünün tersine kaldırmak devam edin.
  7. Kan akımı, efferent Lenfleribile ve tükürük kanalı, tek bir pakette bezinin kafatası sitesinde bulunan bulunan, değil yırtıldı emin olun.
  8. Bir kez lateral bağ dokusu bozulur, forseps Kaudal SMG Kaudal sonu yukarı kaldırmaya SMG sonuna kadar bağlı bağ dokusu çekmek için kullanın. Aşağıda SMG LOB bağ dokusu bozabilir Kaudal başlayan ve rostral sonuna doğru hareket.
  9. SMG tüm sitelere bağ dokusu (büyük besleme/boşaltma kan damarları ve WD rostral sitesiyle hariç) kaldırılana kadar devam edin.

5. sabitleme bezi

  1. Tuz tutan yağ halka en az 4 mm (bkz. Adım 4.2) yüksek ve değil sızıntı olduğunu doğrulayın.
  2. Yükleme alt kapak cam (bkz. Adım 3.2) metal çubuk yüksekliği ayarlanabilir onun sahibine ekleme tarafından. Kapak notu sahibi olduğunu konuma ayarlanır ve Sahne Alanı'na bağlı yağ halka dokunmaz emin olun. Kaudal yön sahibinden fare, yaklaşık 60 ° açılı kapak kabaca üçte kapsayan kayma ile (Kaudal ve distal parça) maruz LOB getirin. Cam kadar alt bezi ile temas.
  3. Yeni tuzlu su deposu oluşturmak için kapak cam üstüne yağ halka tamamlayın.
  4. Dikkatle üstüne kapak notu SMG LOB Forseps ile ona bağlı bağ dokusu dokunmadan sadece çek (org yukarı bakacak şekilde alt site ile çevrilmiş).
  5. Yağ yüzük bile bir yüksekliği en az 4 mm ve kaçak değil emin olun. Gerekirse, şırınga 30 G kullanarak tuzlu su deposu dolum salin ile dolu.
  6. Üst kapak cam için cam tutucu olduğunu konumunda olduğundan emin olun. Vida ile 25 mm üst kapak cam metal sahibi sahibine bağlamak için kullanın. Ayarlanabilir vida yuvasının kapağı cam SMG ortada ortalanacak şekilde konumlandırmak için kullanın.
  7. Doğrudan SMG kişiler kadar üst kapak cam düşürmek için ayarlanabilir tutucu vidaları kullanın. Şekli ve bu adımı sırasında bezinin boyama gözlemlemek. Bezi yüzey alanı büyük görünür veya boyama (örneğin pembe beyaz), hemen değiştirir kapak cam SMG basıncı azaltmak için daha yüksek bir konuma koymak.
  8. Kaçakları için tuzlu su deposu hava kabarcıkları ve/veya damla serum havzanın dışında bakarak kontrol edin. Bir sızıntı veya hava kabarcık algılanırsa, kaldırmak kapak fişleri ve tüm yağ ve--dan adım 2 yeniden başlatın.
  9. Vida tüm fiksasyon vidaları kapatın.

6. Isıtma yüzük ve sıcaklık probu sabitleme

  1. Göle bir sıcaklık probu takın ve yakın bezi getirin, daha sonra sahneye sonda tel bant.
  2. Bir yağ yüzük (yağ yüzük çapı Isıtma yüzük çapı için karşılık gelmelidir) Merkezi SMG ile üst kapak notu uygulanır. Isıtma yüzük kapak notu üstüne getirin ve yağ ile kapatın. Isıtma yüzük sahneye boru bant.

7. görüntüleme

Not: Bir akort Ti:Sa lazer ve su-daldırma 20 X veya 25 X hedefleri ile floresan mikroskop ile donatılmış bir dik iki fotonlu mikroskop sistemi kullanıyoruz. Doku drift düzeltilmesi gerçek zamanlı satın alma sırasında bir otomatik sahne ve VivoFollow19kullanarak uygulanabilir. Bu resim alma kararlılığını geliştirir, ancak gerekli değildir.

  1. Dik mikroskobu sistemi mikroskop üreticisi tarafından sağlanan bir uygun yazılımı kullanarak açın. Ti:Sa lazer 780-900 nm uyarma dalga boyları için ayarlayın.
  2. Isıtma boru Isıtma Yüzük'e bağlanın. Peristaltik su pompası SMG ısıtmak için halka aracılığıyla sıcak su (80 ° C su banyosu içinde boru parçası batış tarafından ısıtmalı) dolaşır.
  3. Bir dijital termometre sıcaklık probu takın. Sıcaklık değil 35-39 ° c arasında ise Peristaltik pompa hızını ayarlayın Ne kadar hızlı pompa çalışır, sıcak nesne alır ve ahlak bozukluğu çok yönlü.
  4. Resim alma işlemine geçmeden önce kan akım hızları görsel bir denetimi gerçekleştirin. Dikkatle lökosit geçit ince kılcal damarlar yoluyla veya floresan dextran enjeksiyon kontrol edin.
    Not: kan akımı fizyolojik olduğunda intravenöz enjekte floresan dextran hemen tüm SMG damarlara doldurur. Bu hemen hemen her zaman bu yordamdaki durumdur.
  5. Bağışıklık hücreleri, görüntüleme derinliği genellikle 2nd harmonik üretimi sinyal ile tanımlanan SMG yüzeyinin altında 20-150 µm arasında uygulamaktır. 150-300 µm görüş alanı kayıt görüntü yığınları ile yaklaşık 512 x 512 veya daha yüksek pixel kararlılık ve z-derinliklerine 20-60 µm ile 2-4 µm görüntüler arasında aralığını. Yığın edinme her 20-30 s 20-60 dk toplam süresi için yineleyin.
  6. Minimum ve maksimum sıcaklık düzeyleri bir görüntü sırası edinimi sonra kontrol etmek için dijital termometre kullanın. Minimum veya maksimum 37 ± aralığı içinde değilseniz görüntü sırası atmak 2 ° C. Amaç görüntü dizileri arasında daldırma için su dolum.
  7. Görüntüleme oturumun sonunda, CO2 boğulma anestezi altında tarafından fareler ötenazi.
    Not: Bu hayvan deney İsviçre federal yönergelere uygun olarak. diğer kurallar ötenazi için başka bir yerde geçerli olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu iletişim kuralı neredeyse tüm dorsal veya ventral yan SMG görüntüleme sağlar. Görüş alanı genellikle biraz SMG hücresel kompozisyon4farklıdır sublingual Tükürük bezi de içerir. Her iki bezleri tarafından fibriler kollajen kapsüllenir ve loblar bölünmüştür. Çoğu 2 de fibriler kollajen etiket içermeyen bir görüntüsünü 2nd harmonik sinyali ölçerek sistemleri oluşturabilir ancak genellikle floresan moleküller hücre ve hücre altı yapıları görselleştirme için ihtiyaç vardır. Örneğin, yeşil flüoresan protein (GFP) 2nd harmonik sinyali ile birlikte her yerde transgenik ifade acini, oluklar ve kan damarlarının SMG tarafından Morfolojik özellikleri tanımlamak yeterlidir. Bu kurulum transgenik floresan işaretleri belirli hücre alt kümeleri tanımlamak için hücre türü belirli ifadesi ile gözlemlemek için kullanılabilir. Şekil 2 bir ağ ofCOL1A1-GFP muhabir ifade fibroblast benzeri hücreleri bir bag doku gösterir. Ayrıca kan damarları, yüksek molekül ağırlıklı dextran birleştiğinde bir floresan boya intravenöz enjeksiyonla etiketli gösterilmiştir. Boya WD29retrogradually enjekte edildiğinde luminal yuvası olarak kanallarının da (şekil 3) etiketli.

Figure 1
Resim 1 : Sahne özelleştirilmiş. (a ve a *) iki serbestçe ayarlanabilir sahipleri için kapak paket fişi; (b ve b *) ayarlanabilir stereotaksik kulak çubuğu; (c) bir vida ile sıkılır bir dize; (d) bir serbestçe ayarlanabilir metal halka Isıtma; (e) fare gövde yerleştirmek için özel alan kaldırdı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Damarlara marker (kırmızı) ve ağ COL1A1-GFP ifade hücre (yeşil). Damarlara Texas kırmızı-dextran eşlenik (MW 70 kDa) intravenöz enjeksiyon tarafından etiketli. İki LOB arasında fibriler kollajen 2nd harmonik sinyali (mavi) olarak görüntülenir. Tek bir z-projeksiyon 47 µm derinliği 15 yığılmış resim gösterilir. Ölçek çubuğu 40 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : WD enjeksiyon sonra etiketli luminal koli. Kan damarları 70 kDa MW Texas kırmızı-dextran ile (kırmızı), kanal Lümen etiketli art arda sıralı mavi-dextran (beyaz; 10 kDa MW) retrograd sızdırma yoluyla WD ve adoptively transfer edilen GFP+ CD8+ T üzerinden hücrelerde SMG (yeşil) etiketlenir. Gösterildi tek bir z-projeksiyon 50 µm derinlikli 27 yığılmış görüntüleri olduğunu. Ölçek çubuğu 40 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu iletişim kuralı için in vivo düşsel bezlerinin fare çene ve sublingual tükürük kez İmmünoloji alanında kullanılan dik doğrusal olmayan mikroskobu kullanarak basit bir yaklaşım sunmaktadır. Yöntem diğer ekzokrin bezleri baş ve boyun bölgesinde görüntüleme için adapte edilebilir. Örneğin, laboratuarımıza gözyaşı bezinin görüntüleme (gösterilmez) benzer bir şekilde sahne aldı.

Kaza sonucu doku hasarı oluşabilir SMG etrafında bağ dokusunu bu Protokolü'nün en önemli adım olduğu için. SMG doku hipoksik olacak bu yana hasar SMG ana kan temini için deneme, derhal iptal gerektirir. SMG doku bozuksa, genellikle kanama pıhtılaşma tarafından doğal durur. Ancak, bu yaralanma steril iltihap tetikler ve deneysel okuma etkileyen30, proinflamatuar sitokinler yayın dikkate alınması gerekir. Tuzlu su sızıntıları mikrocerrahi sırasında daha yaygın, ama daha az önemli komplikasyon var. Sızıntıları oluşumunu en aza indirmek için her zaman yağ kuru, tüysüz kaplamasına uygulamak. Bir sızıntı yama genellikle beyhude: Bunun yerine, tüm yağ kaldırmak, bir kuru pamuklu bez ile cilt temizlemek ve sıfırdan yeniden uygulayın.

Görüntüleme sırasında fizyolojik vücut ısısını yakın bir sıcaklık (yaklaşık 37 ° C için erkek ve kadın C567BL/6 fareler31) muhafaza edilmelidir. Hipo - hem Hipertermi kan akışı32,33alter beri SMG fizyolojik fonksiyonu bu koşullar altında kabul edemiyor. Ancak, kan akımı veya T hücre hareketliliği küçük (± 2 ° C) sırasında geçici hiçbir fark görülmektedir (< 5 dk) en uygun sıcaklık sapmalar.

Doku hareketi minimize iyi görüntü kalitesi için önemlidir. İstenmeyen doku hareket çeşitleri ortaya ve sorun giderme geçirmek için tipik nedenleri vardır. İlk olarak, sürekli xyz-drift genellikle yavaş yavaş geri içine orijinal konumuna bağlı bağ dokusu ile sürüklenen SMG tarafından kaynaklanır. Bu alt kapak cam çok yüksek yüklendiği veya bağ dokusu SMG çevresinde değil iyice kesilmiş olur. İkinci olarak, sıcaklık kararsız ise yavaş ve sürekli z-drift oluşabilir. Bu durumda dikkatle Isıtma ayarlamak ve istikrarlı, sıcaklık görüntüleme önce yaklaşık 15 dk bekleyin. Son olarak, zonklayan doku hareket tuz odası değil sıkı kapalı oluşur. Baskı kurar ve her nefes döngüsü ile serum fizyolojik odasında serbest bırakır. Sızıntıları veya hava kabarcıkları ile birlikte bu doğrudan SMG doku çevirmek zonklayan sıvı akışı yol açar. Bu durumda, kapak gözlük ve tuz odası yeniden birleştirilmesinden en güvenilir bir çözümdür.

En fazla derinliği Imaging kullanılan uyarma dalga boyu ve istihdam fluorophores bağlıdır. Hemen hemen tüm intravital görüntüleme kurulumları, kırmızı kaymıştır boyalar veya uzun dalga boylarında (900-1100 nm) ile heyecanlı floresan proteinler gibi dalga boylarında düşsel yeşil boyalar ve daha kısa uyarma daha derin doku için izin verir.

SMG modeli organ endo - ve ekzositozu ve3,27,28, enfeksiyon34, otoimmüniteye11ve tümör Biyoloji12remodeling membran için kullanılmıştır. Daha da birçok formları işleme izin verir: Boyalar, farmakolojik bileşikler ve antikorlar teslim edilecektir bezinin kan akışı ile için. Alternatif olarak, SMG doğrudan virüs11, dextrans3, DNA25, boyalar29veya farmakolojik3teslim etmek için kullanılan WD cannulation yönlendirilebilir.

İntravital görüntüleme alanı teknikleri etiketleme genetik ve biyokimyasal floresan bir büyüyen araç kutusundan kar devam ediyor. Genetik mühendisliği gelişmeler fare hücre satırları ve sofistike floresan işaretleri ile sağlar. Son örnekler belirli hücre alt kümelerine etiketleme (CD11c+ hücreleri35) veya dinamik hücre iskeleti proteinleri (Lifeact36), photoconvertible işaretleri 37ve nükleer gerçek zamanlı gazetecilere izleme hücre için translocation (NFAT38) veya39sinyal kalsiyum. Diğer uygulamalar (örneğin, 4', 6-diamidino-2-phenylindole bağlama DNA (DAPI) veya lipofilik membran boyalar) belirli hücre altı bölmeleri vurgulamak floresan biyokimyasal probları kullanabilir. Modern NLO mikroskobu en iyi deneysel soruları cevaplamak için birçok olası çözümler sunar. Örneğin, çoğaltılmış iki fotonlu görüntüleme güçlü maksimum edinme hızını40artırmak için geliştirilmiştir. Etiket içermeyen multiphoton görüntüleme, üreten ikinci ya da üçüncü harmonik sinyalleri15tarafından ya da moleküllerin karakteristik rezonans titreşim ölçüm diğer teknikleri teklif (tutarlı Anti-Stokes Raman saçılması)41. Böylece, doku pozlama ve istikrar için uygulanabilir prosedürleri çıktığında, deneysel tasarım sınırlarını çoğunlukla deneyci'nın kaynakları ve yaratıcılık tarafından ayarlanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.

Acknowledgments

Bu eser İsviçre Ulusal Vakfı (SNF) projesi hibe 31003A_135649, 31003A_153457 ve 31003A_172994 (için JVS) ve Leopoldina dostluk LPDS 2011-16 (için BS) tarafından finanse edildi. Bu eser "Mikroskobu görüntüleme Merkezi" (MIC) Bern Üniversitesi optik kurulumları benefitted.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Narketan 10 %  (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) Vetoquinol 3605877535982
Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) Bayer 680538150144
Saline NaCl 0.9% B. Braun 3535789
Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) Fatro 6805671900029
Electric shaver Wahl 9818L or similar
Hair removal cream Veet 4002448090656
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-1
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-0
Super glue Ultra gel, instantaneous glue Pattex, Henkel 4015000415040
Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm Menzel-Gläser 631-1343/ 631-1344
Grease for laboratories 60 g glisseal N Borer (VWR supplier) DECO514215.00-CA15
Surgical scissors Fine Science Tools (F.S.T ) 14090-09 or similar
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T ) 11252-20 or similar
Cotton swab Migros 617027988254 or similar
Gauze Gazin 5 x 5 cm Lohmann and Rauscher 18500 or similar
Stereomicroscope Leica MZ16 or similar
Texas Red dextran 70kDa  Molecular Probes D1864
Cascade Blue dextran 10kDa invitrogen D1976
Two-photon system LaVision Biotec TrimScope I and II or similar
XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective Olympus n/a or other water immersion objective 
Digital thermometer Fluke 95969077651

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. Digestive System. Digital Histology. John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. 101-121 (2005).
  2. Carpenter, G. Role of Saliva in the Oral Processing of Food. Food Oral Processing. Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 45-60 (2012).
  3. Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9, (10), 1801-1810 (2008).
  4. Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands. Acta Histochem Cytochem. 45, (5), 241-250 (2012).
  5. Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Front Oral Biol. 14, 48-77 (2010).
  6. Takeyama, A., Yoshikawa, Y., Ikeo, T., Morita, S., Hieda, Y. Expression patterns of CD66a and CD117 in the mouse submandibular gland. Acta Histochem. 117, (1), 76-82 (2015).
  7. Hata, M., Ueki, T., Sato, A., Kojima, H., Sawa, Y. Expression of podoplanin in the mouse salivary glands. Arch Oral Biol. 53, (9), 835-841 (2008).
  8. Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neurosci. 133, (1), 3-18 (2007).
  9. Le, A., Saverin, M., Hand, A. R. Distribution of Dendritic Cells in Normal Human Salivary Glands. Acta Histochem Cytochem. 44, (4), 165-173 (2011).
  10. Hofmann, M., Pircher, H. E-cadherin promotes accumulation of a unique memory CD8 T-cell population in murine salivary glands. Proc Natl Acad Sci. 108, (40), 16741-16746 (2011).
  11. Bombardieri, M., Barone, F., Lucchesi, D., et al. Inducible tertiary lymphoid structures, autoimmunity, and exocrine dysfunction in a novel model of salivary gland inflammation in C57BL/6 mice. J Immunol. 189, (7), 3767-3776 (2012).
  12. Szwarc, M. M., Kommagani, R., Jacob, A. P., Dougall, W. C., Ittmann, M. M., Lydon, J. P. Aberrant activation of the RANK signaling receptor induces murine salivary gland tumors. PLoS One. 10, (6), e0128467 (2015).
  13. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: A novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, (5), 481-491 (2010).
  14. Masedunskas, A., Milberg, O., Porat-Shliom, N., et al. Intravital microscopy. Bioarchitecture. 2, (5), 143-157 (2012).
  15. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21, (11), 1369-1377 (2003).
  16. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 µm in living brains by use of a Ti:Al_2O_3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28, (12), 1022 (2003).
  17. Gomez-Conde, I., Caetano, S. S., Tadokoro, C. E., Olivieri, D. N. Stabilizing 3D in vivo intravital microscopy images with an iteratively refined soft-tissue model for immunology experiments. Comput Biol Med. 64, 246-260 (2015).
  18. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
  19. Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. J Immunol Methods. 438, 35-41 (2016).
  20. Haghayegh Jahromi, N., Tardent, H., Enzmann, G., et al. A novel cervical spinal cord window preparation allows for two-photon imaging of T-Cell interactions with the cervical spinal cord microvasculature during experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 8, 406 (2017).
  21. Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), e52607 (2015).
  22. Gaylo, A., Overstreet, M. G., Fowell, D. J. Imaging CD4 T cell interstitial migration in the inflamed dermis. J Vis Exp. (109), e53585 (2016).
  23. Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8, (8), 91-96 (2011).
  24. Liou, H. L. R., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. J Vis Exp. (60), e3720 (2012).
  25. Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am J Physiol Cell Physiol. 297, (6), C1347-C1357 (2009).
  26. Masedunskas, A., Porat-shliom, N., Tora, M., Milberg, O., Weigert, R. Intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins. J Vis Exp. (79), e50558 (2013).
  27. Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc Natl Acad Sci. 108, (33), 13552-13557 (2011).
  28. Milberg, O., Shitara, A., Ebrahim, S., et al. Concerted actions of distinct nonmuscle myosin II isoforms drive intracellular membrane remodeling in live animals. J Cell Biol. 216, (7), 1925-1936 (2017).
  29. Kuriki, Y., Liu, Y., Xia, D., et al. Cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct. J Vis Exp. (51), e3074 (2011).
  30. Chen, G. Y., Nuñez, G. Sterile inflammation: Sensing and reacting to damage. Nat Rev Immunol. 10, (12), 826-837 (2010).
  31. McLaren, A. Some causes of variation of body temperature in mice. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 46, (1), 38-45 (1961).
  32. Baumgart, K., Wagner, F., Gröger, M., et al. Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled hydrogen sulfide in anesthetized and ventilated mice. Crit Care Med. 38, (2), Accessed November 21, 2017 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20095069 588-595 (2010).
  33. Crouch, A. C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature. Int J Hyperth. 1-13 (2017).
  34. Smith, C. J., Caldeira-Dantas, S., Turula, H., Snyder, C. M. Murine CMV infection induces the continuous production of mucosal resident T cells. Cell Rep. 13, (6), 1137-1148 (2015).
  35. Lindquist, R. L., Shakhar, G., Dudziak, D., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat Immunol. 5, (12), 1243-1250 (2004).
  36. Riedl, J., Flynn, K. C., Raducanu, A., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, (3), 168-169 (2010).
  37. Chtanova, T., Hampton, H. R., Waterhouse, L. A., et al. Real-time interactive two-photon photoconversion of recirculating lymphocytes for discontinuous cell tracking in live adult mice. J Biophotonics. 7, (6), 425-433 (2014).
  38. Kyratsous, N. I., Bauer, I. J., Zhang, G., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, (31), E6381-E6389 (2017).
  39. Mank, M., Reiff, D. F., Heim, N., Friedrich, M. W., Borst, A., Griesbeck, O. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys J. 90, (5), 1790-1796 (2006).
  40. Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging. Opt Express. 25, (8), 9435 (2017).
  41. Potma, E. O., Xie, X. S. Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. J Raman Spectrosc. 34, (9), 642-650 (2003).
Dik Intravital mikroskopi için fare Submandibular Tükürük bezi hazırlanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).More

Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter