Gel-seq: En metod för samtidig sekvensering bibliotek beredning av DNA och RNA med hjälp av Hydrogel matriser

Summary

Gel-seq gör det möjligt för forskare att samtidigt förbereda bibliotek för både DNA - och RNA-seq försumbar extra kostnad från 100-1000 celler använder en enkel hydrogel-enhet. Detta dokument presenterar en detaljerad strategi för tillverkning av enheten samt biologiska protokollet att generera Parade bibliotek.

Abstract

Förmågan att förstärka och antingen DNA eller RNA-sekvens från små start prover har bara uppnåtts under de senaste fem åren. Tyvärr standardprotokollen för att skapa genomisk eller transcriptomic bibliotek är oförenliga och forskare måste välja om att sekvensera DNA eller RNA för ett visst urval. Gel-seq löser detta problem genom att möjliggöra för forskare att samtidigt förbereda bibliotek för både DNA och RNA börjar med 100-1000 celler använder en enkel hydrogel-enhet. Detta dokument presenterar en detaljerad strategi för tillverkning av enheten samt biologiska protokollet att generera Parade bibliotek. Vi utformade Gel-seq så att det enkelt kunde genomföras av andra forskare; många genetik labs har redan nödvändig utrustning för att reproducera Gel-seq enhet tillverkning. Våra protokoll sysselsätter vanliga kit för både hela-transcript amplifiering (WTA) och bibliotek förberedelse, som sannolikt också kan vara bekant för forskare redan insatt i generera genomisk och transcriptomic bibliotek. Vår strategi tillåter forskare att utöva kraften i både DNA och RNA-sekvensering på ett enda prov utan uppdelning och med obetydlig merkostnad.

Introduction

Nästa generation sequencing (NGS) har haft en djupgående inverkan på det sättet genetik forskning bedrivs. Där forskare en gång fokuserat på sekvensering genomet hos en hela arter, är det nu möjligt att sekvensera genomet hos en enda tumör eller ens en enda cell i ett experiment. ¹ NGS har också gjort det kostnadseffektivt att sekvensera RNA avskrifter finns inom en cell, en samling av data kallas transkriptom. Förmågan att förstärka och antingen DNA eller RNA-sekvens från små start prover har bara uppnåtts under de senaste fem åren. ^{2 , 3 , 4} tyvärr standardprotokollen är oförenliga och forskare måste välja om att sekvensera DNA eller RNA för ett givet prov. När ett start prov är tillräckligt stor, kan det delas i två halvor. På mindre skalor, men förlust av material på grund av uppdelning prover kan påverka bibliotek kvalitet och sammanslagning av prover kan i genomsnitt ut intressanta variationer mellan celler. ⁵ dessutom forskare är allt mer intresserade av att undersöka prover som inte kan delas, såsom enstaka celler eller små heterogena tumör biopsier. ⁶

För att lösa detta problem, tre protokollen har nyligen utvecklats för att både DNA och RNA-sekvens från samma start prov: Gel-seq⁷, G & T-seq⁸och DR-seq⁹. Denna artikel presenterar en detaljerad protokoll för Gel-seq, som kan användas samtidigt generera DNA och RNA bibliotek från så lite som 100 celler försumbar extra kostnad. Den nya aspekten av Gel-seq är förmågan att separera DNA och RNA baseras uteslutande på storlek med låg kostnad hydrogel matriser. Core innovation av Gel-Seq protokollet är den fysiska separationen av DNA från RNA. Denna separation uppnås electrophoretically med en kombination av polyakrylamid membran som drar nytta av storleksskillnaderna mellan dessa molekyler. För att sätta dessa storlek skillnader i sammanhang, överväga hur DNA och RNA är avbildade: medan DNA finns på micron-skalan och kan visas med traditionella Mikroskop, RNA finns på nanometerskalan och måste avbildas med komplexa tekniker såsom cryo-elektron mikroskopi. ¹⁰

Metoden att avskilja DNA och RNA i detta protokoll visas i figur 1. Den vänstra panelen visar DNA och RNA fri svävande i lösningen nära ett membran. När ett elektriskt fält appliceras, som visas i den högra panelen, uppleva DNA och RNA en elektrofores kraft som inducerar migration genom membranet. Genom att trimma membran egenskaper, har vi skapat ett halvgenomträngligt membran som skiljer DNA från RNA. DNA-molekylerna skjuts mot membranet, men fastnar på kanten på grund av deras storlek. Små RNA-molekyler, däremot, kan konfigurera om och väver sig igenom membranet. Denna process, som kallas reptation, är ungefär på samma sätt som en orm som rör sig genom gräset. Så småningom dessa RNA-molekyler stoppas av ett andra, hög densitet membran som är för svår för ännu mindre polymerer (> 200 baspar) slingra sig igenom. När fysiskt åtskilda, kan DNA och RNA återvinnas och behandlas för att generera information om både genomet och transkriptom. Medan vi kan separera DNA och RNA, har vi hittat bättre resultat erhålls om RNA är omvänd transkriberas till cDNA före separationen. CDNA/RNA hybrider är mer stabila än RNA ensam och kan fortfarande passera genom låg densitet membranet.

Figur 1 . Gel-seq operativa principen. Den underliggande principen används för att fysiskt skilja DNA och RNA. I en tillämpad elektriskt fält, små RNA-molekyler vandrar genom låg densitet membranet men stor DNA-molekyler är instängd på ytan. Denna siffra var återges från Ref. 7 med tillstånd från den Royal Society of Chemistry. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Detta dokument beskriver i detalj både tillverkning av Gel-seq enheten och biologiska protokollet att generera parat DNA och RNA bibliotek. En översikt av båda visas i figur 2. Enheten är tillverkad av skiktning tre olika densitet polyakrylamidgeler ovanpå varandra i en process som påminner om att skapa standard stapling geler. ¹¹ biologiska protokollet börjar med 100-1000 celler upphängd i PBS. Cellerna är lyserat och RNA omvandlas till cDNA innan enheten används för att separera genomisk DNA från cDNA/RNA hybrider. Efter separation och återhämtningen, genomisk och transcriptomic bibliotek är beredda med en process som noggrant följer protokollet helgenom-standardbiblioteket förberedelser kit. Ytterligare information om utveckling och validering av Gel-seq kan läsas i labbet på en Chip publikation ”Gel-seq: helgenom- och transkriptom sekvensering av samtidiga lågintensivt DNA och RNA tillredning bibliotek via ljusgenomsläppande hydrogel hinder ." ⁷

Figur 2 . Gel-seq protokollet. En översikt över stegen för att fabricera Gel-seq enheten och protokollet till genererade Parade DNA och RNA bibliotek. Delar av denna siffra reproducerades från Ref. 7 med tillstånd från den Royal Society of Chemistry. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att generera DNA och RNA bibliotek från enstaka celler, forskare bör överväga att använda antingen G & T-seq eller DR-följande punkter G & T-Seq, som Gel-seq, bygger på en fysisk separation av RNA från genomiskt DNA. Denna strategi bygger på messenger RNA (mRNA) 3′ polyadenylated svans som nedrullningsbara mål. MRNA fångas på en magnetisk pärla med en biotinylerade oligo-dT primer. När mRNA har fångats pärlor hålls på plats med en magnet och supernatanten innehållande genomisk DNA kan tas bort och överföras till en annan tube. Efter denna fysiska separation är komplett, kan separata bibliotek genereras från mRNA och DNA. ⁸ detta tillvägagångssätt fungerar bra om RNA av intresse är polyadenylated, men det kan inte användas att studera icke-polyadenylated avskrifter, såsom ribosomalt RNA, tRNA eller RNA från prokaryoter.

DR-seq åberopat ett före förstärkning steg där både DNA och cDNA härrör från RNA förstärks i samma rör. Provet är sedan uppdelad i två och bearbetas parallellt att förbereda DNA - och RNA-seq bibliotek. För att skilja mellan genomiskt DNA och det cDNA som härrör från RNA, tar DR-seq en computational förhållningssätt. Sekvenser där det förekommer endast exoner undertrycks beräkningsmässigt i det genomiska DNA-uppgifter, som de kunde ha sitt ursprung från antingen DNA eller RNA. ⁹ en fördel med denna metod är att den DNA och cDNA/RNA inte behöver vara fysiskt åtskilda som sker i Gel-seq och G & T-följande punkter Nackdelen, är dock att DR-seq kräver en priori kunskap av genomet och transkriptom (dvs, exoner och introner), och kanske inte idealisk för applikationer såsom sekvensering av atomkärnor, där många avskrifter inte är ännu helt skarvas och fortfarande innehåller introner. ¹²

Den nya aspekten av Gel-seq är förmågan att separera DNA och RNA i hundratals celler uteslutande utifrån storlek. Denna metod kräver ingen förhand kunskap av genomet eller transkriptom, är robust mot ofullständiga skarvning och är inte begränsat till poly-adenylated avskrifter. För applikationer där forskare kan börja med minst 100 celler, ger Gel-seq en enkel metod med billigt och allmänt tillgängliga material.

Protocol

1. kemisk lösning förberedelse

Obs: Följande steg är för att förbereda kemiska lösningar som krävs i senare steg. Dessa kan göras i bulk och lagras i flera månader.

1. Börja förbereda 50 mL renat, avjoniserat vatten genom sterilisering i 254 nm UV crosslinking ugn för 15 min (15 mJ/cm² totala exponering) att neutralisera eventuella kontaminerande DNA. Värm till 37 ° C för användning i följande steg.
2. Fyll 10 mL av 40% totalt (T) och 3,3% crosslinker (C) (29: 1) polyakrylamid föregångare lösning. Väga 3.867 g av akrylamid monomer och 0,133 g bis-akrylamid monomer. Kombinera och komma med volym upp till 10 mL med varma renat vatten och skaka tills upplöst. Förvaras skyddat från ljus vid rumstemperatur.
   Obs: Färdigblandad 40% T, 3,3% C (29: 1) polyakrylamid lösningar kan köpas kommersiellt.
3. Fyll 10mL 50% T, 5% C gel lösning. Väga 4.750 g av akrylamid monomer och 0.250 g bis-akrylamid monomer. Kombinera och komma med volym upp till 10 mL med varma renat vatten och skaka tills upplöst. Förvaras skyddat från ljus vid rumstemperatur.
4. Gör 10 mL av en lösning med 50% (w/v) i sackaros. Lägg 5 g sackaros till en graderad cylinder och varma renat vatten upp till en total volym på 10 mL. Vortex tills upplöst och förvara i rumstemperatur.
5. Fyll 10 mL 10% APS (w/v). Tillsätt 1 g ammonium persulfatoxidation (APS) till en graderad cylinder. Tillsätt kall (~ 4° C) renat vatten upp till en total volym på 10 mL och vortex tills upplöst. Genast frysa i alikvoter av 200 µL.

2. gel-seq kassett Fabrication

Obs: Gel-seq utvecklades ursprungligen med upprätt kassetter (se Tabell av material för mer information); Detta protokoll kan dock anpassas till arbeta med någon standard gelelektrofores kassett.

1. Förbereda gel prekursorer i tre separata plaströr genom att lägga till reagenser som visas nedan i tabell 1. Inte lägga till antingen APS eller Tetramethylethylenediamine (TEMED) tills regi i följande steg. Vortex ingredienser för att blanda.

Filler Gel föregångare		Hög densitet Gel föregångare		Låg densitet Gel föregångare
40 %T, 3.3%C akrylamid Bisacrylamide lösning	1,6 mL	50 %T, 5 %C akrylamid Bisacrylamide lösning	2,4 mL	40 %T, 3.3%C akrylamid Bisacrylamide lösning	0,6 mL
Avjoniserat vatten	10.2 mL	Avjoniserat vatten	1,0 mL	Avjoniserat vatten	4,8 mL
Sackaroslösning (50% w/v)	2,6 mL	Sackaroslösning (50% w/v)	0,6 mL
10 X Tris-Borat-EDTA	1,6 mL			10 X Tris-Borat-EDTA	0,6 mL
Ammonium persulfatoxidation (10% w/v)	104,0 ΜL	Ammonium persulfatoxidation (10% w/v)	50,0 ΜL	Ammonium persulfatoxidation (10% w/v)	39,0 ΜL
TEMED	6,0 ΜL	TEMED	1,0 ΜL	TEMED	2.2 ΜL
Totala volymen	16.1 mL	Totala volymen	4,1 mL	Totala volymen	6,0 mL

Tabell 1. Gel syntes reagenser. Polyakrylamidgelen föregångare reagenser tillräckligt för tillverkning av 2 kassetter.

2. Avinstallation gas gel monomer lösningar genom att sätta en nål genom locket på röret och ansluta denna nål till ett hus vakuum linje. Dränka denna församling i ett ultraljudsbad set till hög och vänta tills bubblor stoppa framväxande från vätskan innan du flyttar till nästa steg (~ 60 sekunder / tube).
   Obs: Kvaliteten på vakuum och kraften i ultraljudsbadet är inte kritisk så länge bubblor kan ses ur lösningen.
3. Lägg till TEMED och APS i filler gel föregångare och vortex kort. Tillsätt omedelbart 6 mL filler gel föregångaren till varje gel kassett av pipett lösningen till toppen av kassetten. Använda en 1 mL mikropipett för att lägga till föregångaren i sex steg till att undvika spill. Den totala tiden för det här steget bör vara mindre än 3 minuter.
4. Kontrollera vätskan är nivå genom att placera korgarna upprätt på en nivå tabell. Fyll resten av kassetten med avjoniserat, avgasade vatten. Pipettera vattnet, igen med 1 mL steg, långsamt in i mitten av kassett att minimera blandning. Tillåta polymeren till bota för minst en timme, upp för att övernatta.
5. Efter polymeren har härdat, Invertera gel korgarna över ett handfat ta bort överlägget vatten. En komprimerad luftpistol kan användas försiktigt torka gränssnittet genom att blåsa luft genom den övre öppningen av kassetten från ett avstånd av 6 inches.
6. Lägg till TEMED och APS i hög densitet gel föregångare och vortex kort. Tillsätt omedelbart 320 µL av högdensitets föregångaren i kassetten, igen med 1 mL pipett. Se till att vätskan jämnt rockar filler gel lagret genom att skaka kassetten och tillbaka omkring 3 gånger. Detta steg bör ta mindre än tre minuter.
7. Fyll resten av kassetten med avjoniserat, avgasade vatten. Pipettera långsamt med en 1 mL pipett i mitten av kassett att minimera blandning. Tillåta polymeren till bota för minst femton minuter, helst en timme.
8. Igen, Invertera gel korgarna för att ta bort vatten överlägget. Tryckluft kan användas för att försiktigt torka gränssnittet. Lägg till TEMED och APS i låg densitet gel föregångare och vortex kort. Omedelbart fylla resten av kassetten (~1.65 mL) med låg densitet gel föregångaren och infoga gel kammen.
9. Pipettera ett överskott av reserven föregångare överst på kammen som det kommer att absorberas under polymeriseringen. Tillåta polymeren att bota minst 4 timmar, helst över natten. Geler kan lagras i en vecka eller mer i en buffert av Tris-Borat-etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) (TBE buffert).

3. provberedning och omvänd Transkription

1. Börjar med en suspension av cellerna i intresse, och arbetar i ett polymeras-kedjereaktion (PCR) LAF, Använd en hemocytometer eller en automatisk cell räknare för att beräkna cellkoncentrationen. Späd cellerna till en koncentration på 100 till 1000 celler per µL i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
   Obs: Detta protokoll har validerats på ett cellområde som inklusive PC3, HeLa och mus levern celler.
2. Med reagens i WTA kit (se Tabell för material), mix 19 μl lyseringsbuffert och 1 µL RNase inhibitor att förbereda en 10 X stamlösning av reaktion buffert. Skapa en Lys master mix av tillräcklig volym innehållande 0,5 µL reaktion buffert och 2,75 µL nuclease gratis vatten för varje prov.
3. Pipettera cellsuspensionen upp och ner 5 gånger att åter stänga kvittade celler och sedan Pipettera 1 µL prov i en 200 µL nuclease gratis strip tube steriliseras genom UV. Upprepa vid behov beroende på antalet prover. Glöm inte att inkludera en negativ kontroll genom pipettering 1 µL nuclease gratis vatten i stället för celler för en reaktion. Nästa, tillsätt 3.25 µL lysis master mix i varje prov och blanda genom pipettering försiktigt upp och ned 5 gånger.
4. Värm en termocykel (med uppvärmd lock) till 72 ° C. Lägga till 1 µL RT primer och 1 µL 20 µM slumpmässiga hexamer med WTA adapter (5′-AAGCAGTGGTAT-CAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′) till varje prov. Reservera minst en tub som en positiv kontroll för gDNA bibliotek förberedelse och tillsätt 2 µL av vatten i stället för grundfärger.
   Obs: Random hexamer med WTA-adapter är valfri och har minimal påverkan på sekvensering resultat.
5. Inkubera prover vid 72 ° C i en förvärmd termocykel 3 minuter att lysera celler. Ta bort celler från termocykel och plats på is i 2 minuter. Lagra den positiva kontrollen vid 4 ° C fram till steg 5.
6. Medan cellerna lyseringslösning, skapa en tillräcklig volym av omvänd Transkription master mix för alla RNA-prover som innehåller följande reagens nyckeltalen: 2 µL av första strand buffert, 0,5 µL av mallen switch oligonukleotiden (TSO), 0,25 µL av RNase inhibitor och 1 µL omvänt transkriptas (100 U/µL).
7. Förvärma termocykel till 42 ° C. Tillsätt 3,75 µL av omvänd Transkription huvudmixen återstående prov att föra den totala provvolymen till 10 µL. Mix av pipettering upp och ner 5 gånger.
8. Utföra omvänd Transkription genom att omedelbart placera prover i en förvärmd termocykel. Kör följande program: 42 ° C i 90 min, 70 ° C i 10 min, 4 ° C för evigt. Detta är en säker stoppunkten.

4. gel Separation och prova Recovery

1. Ren försiktigt en gelelektrofores kammare med en DNA borttagning produkt. Applicera flera mL av det flytande rengöringsmedlet till en disponibel ludd gratis torka och torka över alla ytor av kammaren, och sedan fylla kammaren med ren 0,5 x TBE. För optimalt resultat, placera hela apparaten i 254 nm UV crosslinking ugn och sterilisera i 15 minuter (15 mJ/cm²).
2. Sätt i Gel-seq kassetten i gelelektrofores kammaren och lås den på plats. Ta långsamt bort gel kammen genom att dra rakt upp. Flytta långsamt att undvika sönder gelen eller rippning någon av armarna.
3. Att hålla proverna från steg 3 på is, reservera minst ett prov som en positiv kontroll för cDNA bibliotek generation. Lagra denna kontroll vid 4 ° C fram till steg 6. Tillsätt 2 µL av 6 X laddar dye återstående prov, föra den totala volymen till ~ 12 µL. grundligt Blanda proverna genom pipettering upp och ner 5 gånger.
4. Kombinera 1 µL av en DNA-stege med 2 µL av 6 x laddar färgämne och 7 µL av vatten. Pipettera över denna blandning till lane 1 av Gel-seq kassetten som elektrofores kontroll. Pipettera proverna från föregående steg i separata körfält av Gel-seq kassetten. Var noga med att förhindra kontaminering mellan brunnar genom att infoga pipetten fullt i varje brunn och ta bort det med bara en vertikal rörelse.
5. Använder en standard gelelektrofores strömförsörjning, applicera ett elektriskt fält av 250 V över Gel-seq kassetten i 30 minuter för att separera gDNA från cDNA/RNA hybrider. När separerade, ta bort Gel-seq kassetten från gelelektrofores kammaren och öppna de två halvorna av kassetten genom att bända kanterna med en skrapning verktyg.
6. Med en skalpell, halvera gelen bara under hög densitet lagret. Kassera den halvan som innehåller filler gel genom att plocka upp det med din behandskade hand. Dra försiktigt den kvarvarande gel off av kassetten genom att skrapa den med en måla skrapa eller andra liknande verktyg. Placera detta avsnitt av gelen i en maträtt som innehåller ~ 30 mL 0,5 x TBE med 3 µL av gel fläcken.
7. Täcka behållaren för att minimera fotoblekning och njut gelen medan försiktigt skaka behållaren i 5 minuter. Placera gelen på plastfolie och ta en UV-avbildning med en geldokumentationssystem (för ytterligare information se Ref. 13). En 30 andra exponering vanligtvis producerar tydliga bilder. Verifiera att separation har inträffat.
8. Flytta gelen till ett UV-transilluminator att underlätta visualisering av nukleinsyror. Bär lämpliga UV Glasögon, bekräfta resultaten från geldokumentationssystem. GDNA ska placeras i början av låg densitet gel och cDNA på gränssnittet för regionerna låg densitet och hög densitet.
9. Använd en skalpell, klipp ut regionerna av gel som innehåller gDNA och cDNA. Prover återvinns bäst genom att skära en 4 mm av 10 mm rektangulär sektion gel. men, den exakta geometrin beror på det gel electrophoresis system som används. Kom ihåg att även skära körfältet laddad med den negativa kontrollen.
10. Placera varje exciderad avsnitt gel i en remsa röret med hjälp av ett par trubbiga änden pincett. Var noga med att inte applicera för mycket kraft eller gelen kommer delas upp i flera bitar. Detta bör hända, helt enkelt plocka upp varje bit och Lägg till röret.
11. Mala gelen i varje rör med spetsen på en pipett (200 µL pipett tips fungerar bra) genom att flytta pipettspetsen i en cirkulär mode mot botten av röret. Tillsätt nuclease gratis vatten (40 µL till gDNA proverna och 80 µL till cDNA proverna) i varje rör innan du tar bort pipettspetsen används för att slipa gelen för att minimera prov förlust.
12. Placera remsan rören till en vortex mixer inuti en 37 ° C inkubator och skaka för 8-12 timmar. Detta tillåter nukleinsyror till diffus ur gelen och stoppas en naturlig punkt för detta multi dag protokoll.
13. Pipettera proverna i en µm 8 mesh filterplatta och snurra plattan vid 2600 x g i 5 minuter till stam ut gel fragment. Lyft maska filtret plattan från bostäder plattan och Pipettera gel-gratis vattenprover till en ny 200 µL strip tub.
14. Tillsätt 1 µL proteas (0.9 AU/mL) i varje prov som innehåller gDNA, blanda väl genom pipettering upp och ner, och inkubera vid 50 ° C under 15 minuter följt av en Värmeinaktivering vid 70 ° C i 15 min. Detta steg är avgörande för ozonnedbrytande nucleosomes och gör gDNA tillgänglig för efterföljande reaktionen kliver.
15. Med hjälp av en 18 gauge nål, peta hål i mössor av alla provrör. Placera proverna i en vacufuge att minska vätskemängden. gDNA prover bör minskas till 5 µL och cDNA prover minskas till 10 µL.
16. Beroende på vacufuge och antalet prover varierar den totala avdunstning tid mellan 30 och 60 minuter. Om provvolymen understiger målvolymen, Lägg nuclease fritt vatten för att öka provvolymen.

5. gDNA bibliotek förberedelse

1. Använder en fluorometer eller liknande teknik, kvantifiera den DNA-koncentrationen i varje gDNA prov från steg 4 samt den positiva kontrollen från steg 3. För en detaljerad protokollet se fluorometer referensmanualen. ¹⁴
2. Späd ut proverna till 0,2 ng/µL av DNA. Beroende på Start celltyp och kvalitet av resultat krävs, kan lägre koncentrationer fortfarande producera livskraftig bibliotek. Vissa experiment kommer att krävas; men hade författarna framgång med bibliotek så låg som 0,1 ng/µL.
3. Slutför gDNA bibliotek förberedelse genom att följa protokollet bibliotek förberedelserna halv reaktion volym i steg 7.

6. cDNA bibliotek förberedelse

1. Börjar med 10 μl cDNA proverna och positiv kontroll från steg 4, tillsätt 12,5 µL av 2 X qPCR mix, 0,5 μl cDNA PCR primer och 2 µL nuclease-gratis vatten.
2. Utföra PCR i en realtid termocykler använder följande protokoll: hot-start vid 95 ° C i 3 min, följt av 20-30 cykler av 98 ° C för 10 s, 65 ° C för 30 s och 72 ° C för 3 min. Total provvolymen är 25 µL. övervaka reaktion kurvorna och stoppa förstärkningen före th e reaktioner lämna den exponentiella fasen (linjär signal ökning jämfört med cykel nummer) för att undvika PCR artefakter på grund av overamplification. För mer information om att undvika overamplification, se diskussionsavsnittet av detta papper samt Ref. 15.
3. Efter förstärkning, ren produkten med fasta fasen reversibel immobilisering (SPRI) pärlor efter protokollet i steg 8. När klar, Fortsätt till nästa steg.
4. Använder en fluorometer eller liknande teknik, kvantifiera den DNA-koncentrationen i varje cDNA-prov samt den positiva kontrollen från steg 4. Späd ut proverna vid behov innehålla cirka 0,2 ng/µL av DNA. Något lägre koncentrationer fortfarande producera livskraftig bibliotek. Vissa experiment kommer att krävas, men författarna hade framgång med bibliotek så låg som 0,1 ng/µL.
5. Valfritt steg: utföra en standardgel polyakrylamid elektrofores separation på 1-2 µL av varje qPCR produkten att validera bibliotek generation reaktionen fungerat. En exempelbild av lyckat resultat visas i figur 4. För en detaljerad protokollet om hur man genomför polyakrylamid gelelektrofores, se Ref. 16.
6. Slutför cDNA bibliotek förberedelse genom att följa bibliotek förberedelser kit halv volym reaktion protokollet i steg 7.

7. bibliotek förberedelser med halv volym reaktioner

1. Bibliotek förberedelser följer biblioteket förberedelser kit protokollet använder halva volymen reaktioner. ¹⁷ alla reagenser som refereras i detta avsnitt av protokollet är från biblioteket förberedelse kit (se Tabell för material). Börja med UV sterilisering ett tillräckligt antal remsan rör för antalet prover som skall bearbetas.
2. Utföra transposase reaktionen genom att lägga till 5 µL transposase buffert varje remsa rör som ska användas i analysen. Lägg sedan till 2,5 µL ingång DNA på 0,2 ng/µL (0,5 ng totalt) följt av 2,5 µL transposase. Blanda genom pipettering upp och ner 5 gånger.
3. Inkubera vid 55 ° C i 5 minuter, sedan hålla på 10 ° C. Efter provet når 10 ° C, ta bort den från termocyklern och omedelbart lägga till 2,5 µL transposase stop buffert till varje prov. Förvara proverna i rumstemperatur i 5 minuter.
4. Förbered PCR-reaktionen att förstärka transponera behandlas provet genom att lägga till 7,5 µL bibliotek prep PCR-mix, 2,5 µL av en index 1 primer och 2,5 µL av en index 2 primer. Dessa primers är patentskyddade och levereras av tillverkaren av bibliotek förberedelser kit. Blanda väl genom pipettering upp och ner 5 gånger.
   Obs: Se till att unika primer kombinationer används för varje prov. Det finns 12 olika index 1 grundfärger och 8 olika index 2 primers, gör det möjligt att unikt märka upp till 96 olika prover. Välj en unik kombination av primers för varje prov.
5. Utför PCR använder följande program på en termocykler. Provvolymen är 25 µL.
   72 ° C i 3 minuter
   95 ° C i 30 sekunder
   12 behandlingscykler om:
   95 ° C i 10 sekunder
   72 ° C under 30 sekunder
   55 ° C i 30 sekunder
   72 ° C i 5 minuter
   Håll vid 10 ° C
6. Ren de beredda bibliotek med hjälp av SPRI pärlor efter protokollet i steg 8. Biblioteken ska valideras med hjälp av gelelektrofores eller en liknande analys. Se bibliotek förberedelser kit handbok för information om hur du validerar bibliotek. ¹⁷

8. fast fas reversibel immobilisering pärla bibliotek rengöring

1. Fast fas reversibel immobilisering (SPRI) pärlor bör förvaras i 1,5 mL alikvoter och bör kommas med till rumstemperatur före varje användning. Det rekommenderas också att förbereda färska 80% etanol för varje experiment. Följande steg är baserade protokollet SPRI pärla i WTA kit manual. ¹⁸
2. Tillsätt 1 µl av den WTA kit lyseringsbuffert till varje PCR-produkten. Vortex SPRI pärlorna tills jämnt blandade, tillsätt sedan 50 µl av SPRI pärlor till varje prov. Blanda genom pipettering provet upp och ner 10 gånger och sedan Inkubera proverna i rumstemperatur i 8 minuter.
3. Kort snurra proverna för att samla in vätskan från sidan av rören. Placera proverna på en magnetisk separering enhet för ~ 5 minuter tills vätskan visas helt klart.
4. Medan proverna är på magnetisk separering enheten, långsamt Pipettera bort supernatanten och släng - vara noga med att inte störa ringen av pärlor på tuben. Nästa tillsätt 200 µL av 80% etanol till varje prov utan att störa pärlorna. Vänta i 30 sekunder och sedan noggrant Pipettera av supernatanten. Upprepa detta steg (etanol wash) en gång.
5. Tillåta proverna torka i 30 s - 1 min. Över torka inte proverna som stora fragment kommer att bli permanent bunden till pärlorna.
   Obs: En kort torktid rekommenderas att se till att alla spår av etanol tas bort. Bör förbli spårmängder av etanol bakom kan de något hämmar nedströms reaktioner.
6. Ta bort proverna från magnetisk separering enheten och Lägg till 15 µL vatten varje prov till eluera DNA från pärlorna. Pipettera upp och ner och pärlorna är bort från sidorna av rören. Odla i rumstemperatur i 2 minuter. Kort snurra proverna och placera dem sedan på magnetisk separering enheten för ~ 1 minut tills lösningen visas tydligt.
7. Proverna är på magnetisk separering enheten, långsamt Pipettera upp supernatanten och överföra det till rena rör. Var noga med att inte störa ringen av pärlor på tuben. Kassera rören med pärlor.

Representative Results

Den fysiska separationen gDNA och cDNA/RNA hybrider i Gel-seq enheten kan visualiseras genom fluorescerande gel imaging; representativa resultat visas i figur 3. Panel A visar den fabricerade Gel-seq-enheten; falsk färg har lagts till att skilja de olika gel regionerna. Panel B visar en nära upp av fyra olika separationerna används för verifiering. Den tredje lanen, en negativ kontroll, utgör bakgrunden och visar att det finns ingen autoflourescence av gel vid gränssnitten. Vi lastade de första och andra körfält med DNA stegar. Dessa körfält visar bara ett mörkt band i gränssnittet mellan låg - och hög - density membranen, avslöjar att små fragment kan passera genom den låg densitet gel. Det fjärde körfältet visar uppförandet av ett biologiskt prov av intresse: 500 PC3 celler. Vi lastade lane fyra som beskrivs i steg 3 i protokollet. Bilden visar separering av genomisk DNA och cDNA/RNA hybrider. Ett mörkt band överst på låg densitet membranet är megabase-skala genomiskt DNA medan de cDNA/RNA hybrider är staplade på gränssnittet för regionerna låg och hög densitet. Till skillnad från de köer som laddad med stege, finns det också flera band inom regionen hög densitet av gelen. Dessa fragment, mindre än 100 bp, är ej åsyftade produkter genereras från primer oligonukleotider under omvänd Transkription. Panel C visar en representativ bild av hela Gel-seq enheten från ett lyckat experiment. Lanes märkt RNA/cDNA bearbetades med Gel-seq-protokollet medan körfält märkt RNA visar en separation av bara gDNA och RNA. Panelen D visar ett misslyckat experiment med svarta band på toppen av varje lane av låg densitet membranet. Detta orsakades av elektrofores buffert förorenade med fragmenterade DNA. I detta steg, ska forskare leta både rent negativa kontroller och två distinkta svarta band som indikerar förekomsten av separerade gDNA och RNA/cDNA hybrider.

Figur 3 . Gel-Seq Separation resultat. Gel-seq enheten (A) och en fluorescerande bild visar separering av DNA och RNA/cDNA hybrider (B). Falsk färg har lagts till att enkelt skilja mellan de olika regionerna av täthet inom gelen. (C och D) Representativa fluorescerande bilder av hela Gel-seq enheten från en framgångsrik (C) och misslyckat (D) experiment. NTC = ingen mall kontroll. Delar av denna siffra reproducerades från Ref. 7 med tillstånd från den Royal Society of Chemistry. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

När de DNA och RNA/cDNA hybrider har separerats och resten av Gel-seq protokollet avslutas, är det möjligt att generera sekvensering bibliotek. För att validera de förberedda bibliotek, kör vi antingen en standard gelelektrofores experiment (figur 4) eller en bioanalyzer. Resultaten i figur 4 visar bibliotek genereras från 500 PC3 och 750 HeLa celler. Figuren visar fragment fördelningarna för matchade bibliotek genereras från Gel-seq (märkt 'Gel') jämfört med oöverträffad prover genereras med standardprotokoll (märkt 'Rör'). Fragmentet storlekarna för Gel-seq visas mellan 200 och 800 basepairs som förväntat när du förbereder bibliotek med hjälp av helgenom-standardbiblioteket förberedelser kit. Om biblioteket fragment inte visas i intervallet rätt storlek i det här steget, har bibliotek förberedelse misslyckats.

Figur 4 . Bibliotek Fragment Storleksjämförelse. En fluorescerande gelelektrofores bild jämföra bibliotek storleksfördelningen mellan Gel-seq (Gel) och standard kontroller (tub). Vänster körfält innehåller en låg massa DNA stege med fragment storlekarna 100, 200, 400, 800, 1200 och 2000 basepairs. Fragmentet storlekar för alla bibliotek hamnar mellan 200 och 800 basepairs, som förväntat för bibliotek beredd med detta kit. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Den ultimata valideringen av Gel-seq protokollet baseras på analys av sekvensering resultat. Vi valt PC3 celler för våra validering experiment, som dessa celler har homogen uttrycket profiler som gör prover vara delad och bearbetas med både Gel-seq och traditionella metoder. Se figur 5. En jämförelse mellan genomiskt DNA för PC3 celler visas i diagram 5A och 5B. Figur 5 A visar en jämförelse av genome-wide kopia nummer variation (CNV) profiler genereras från PC3 med Gel-seq eller en helgenom-standardbiblioteket prep reaktion (tube control). Varje punkt är en genomsnittlig normaliserad bin räkna; lagerplatser definieras från genomet referensdata sådan att varje fack har lika förväntade greven i en frisk diploid cell, dvs, en platt linje, som representerar lika kopior för varje region av alla autosomalt (exklusive X och Y) kromosomer. PC3 innehåller flera kopior av samma regioner som Visa som spikar ovanför en bakgrunden kopia nummer två. Gel-seq ger en kvalitativt liknande CNV profil som standard tube reaktion. Avtalet mellan de två tomterna kan bedömas kvantitativt genom linjär regression, som visas i panelen B. En Pearson korrelation på R = 0,90 indikerar att genomisk data insamlade från endera metoden är funktionellt likvärdiga.

Figur 5 . Bibliotek validering. Gel-seq validering för den genomiska (A och B) och transcriptomic (C, D och E) data som genereras från PC3 och Hela celler. Panel A visar en jämförelse av genome-wide CNV profiler genereras från PC3 med Gel-seq (Gel-seq) eller en vanlig reaktion (tub). MAPD = Median absoluta parvisa skillnaden. Panel B är en linjär regression mellan de två samplingarna i Panel A, med R = 0,90 indikerar genomisk data är funktionellt likvärdiga. Axlarna Visa log2 normaliserade lagerplatsen räknas. Paneler C och D jämför transcriptomic data från PC3 celler, med varje punkt visar en räkna i avskrifter per kilobase per miljon (TPM). Axlarna visar jämförelsen mellan två prover som log2 normaliserade avskrift räknas. Panel C visar en jämförelse av tekniska replikat genereras med Gel-seq och Panel D visar en jämförelse mellan Gel-seq och traditionella RNA-följande punkter Panel E visar att Gel-seq kan lösa celltyp baserat på RNA-uttryck med en principalkomponentanalys. X-axeln visar att den första principalkomponent konton för 91,6% av variationen mellan proven medan y-axeln visar att den andra huvudkomponenten konton för endast 6,5% av variansen. Delar av denna siffra reproducerades från Ref. 7 med tillstånd från den Royal Society of Chemistry. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Likaså jämfört vi transcriptomic data från vår Gel-seq-protokollet i slang Smart-Seq standardprotokoll. Figur 5 visar sambandet mellan båda Gel-seq tekniska replikat (bild 5C) och mellan Gel-seq och standardmetoden (figur 5D). Varje punkt är en räkna i avskrifter per kilobase per miljon (TPM) för varje gen som upptäckts på TPM > 5 i båda datamängder. De Linjära regressioner visas som röda linjer och Pearsons korrelationskoefficient visas i det övre vänstra hörnet. Tekniska replikat från Gel-seq håller (R ∼ 0.8), men korrelerar sämre med standardmetoden (R < 0,7). Detta tyder på att Gel-seq introducerar en bias i genen räknas. Lyckligtvis denna bias är systematisk och, som kan ses av principalkomponentanalys i figur 5E, meningsfulla slutsatser fortfarande kan dras mellan olika biologiska prover.

Discussion

I området i närheten finns det flera kritiska steg som är associerad med Gel-seq enhet tillverkning samt själva protokollet. Under tillverkning rekommenderar vi att du börjar med de föreskrivna skikttjocklekar för de olika regionerna av gelen. Vi tillbringade betydande tid testa olika fabrication alternativ och protokollet beskrivs här producerar de bästa enheterna för de kassetter som anges i tabell av material och reagens. Om forskare använder en alternativ kassettsystem, kan de finner det nödvändigt att justera de volymer som används när du skapar enheterna. Den stora utmaningen i fabrication är att om regionen hög densitet gel är för stor kan delaminate från kanterna på kassetten och skapa luftfickor på insidan av kassetten som kommer att störa elektrofores. Genom casting flera kassetter med flera olika lager volymer, bör forskare kunna snabbt avgöra optimal konfiguration för deras specifika maskinvara.

Gel-seq protokollet har också flera kritiska steg som kan valideras innan protokollet är klar. En är potentiell misslyckande avskiljandet av gDNA och RNA/cDNA hybrider. Detta kan verifieras av imaging Gel-seq enheten efter separation (se figur 3B). I en uppsättning av experiment, fann vi att vårt lab leverans av buffert hade blivit förorenat med DNA och orsakade betydande autoflourescence i vår enhet (se figur 3D). Detta gjorde det svårt att avgöra om separationen hade ägt rum. Fluorescerande imaging hjälpt oss att identifiera och korrigera problemet innan du använder reagensmedel kostsamma för att generera sekvensering bibliotek.

En annan kritisk punkt är steg 6,2, qPCR förstärkning av cDNA efter separation. Forskare bör var uppmärksam att inte overamplify i det här steget eftersom det kommer att minska kvaliteten på RNA-seq data. Detta övervägande är inte unikt för Gel-seq, men är en gemensam aspekt av lågintensivt RNA-seq bibliotek förberedelse. PCR-amplifiering under sekvensering bibliotek förberedelse krävs ofta, men det kan införa sekvens fel och fördomar. Erforderligt antal cykler för PCR beror på prov kvantitet och komplexitet. Det är allmänt tillrådligt att begränsa PCR cykel nummer till det minimum som krävs för att ge tillräcklig kluster när biblioteken är sekvenserade. I teorin kan ett protokoll optimeras för att avgöra det exakta cykel nummer som ger tillräcklig kopienumret utan att införa överdrivna artefakter. I praktiken dock inkonsekvenser i provet kvalitet, lastning, eller hantering tidigt i protokollet kan dramatiskt påverka fördelningen av molekylär mallar som är tillgängliga för bibliotek prep PCR, som i sin tur påverkar den optimala PCR cykel nummer. Den mest allmänna lösningen vi har funnit för att övervaka förloppet för amplifiering reaktionerna med ett fluorescerande färgämne, kör reaktionerna på en realtids PCR termocykler och stoppa reaktionerna i den exponentiella (linjär kontra cykel nummer) fas. Vår erfarenhet är realtidsövervakning särskilt relevant när utveckla, anpassa eller att anta ett nytt protokoll.

Det sista viktiga steget genererar genomisk och transcriptomic bibliotek. Nyckeln till detta steg är att ange start prov koncentrationen för DNA bibliotek prep reaktionen så nära 0,2 ng/µL (0,5 ng totalt) som möjligt. Detta är relativt enkelt för qPCR förstärks cDNA som vanligtvis finns det ett överskott av cDNA, men det kan vara mer utmanande för gDNA prover. Vi hittade noggrann uppmärksamhet till vacufuge steg krävdes medan proverna var att vara koncentrerade. Som förväntat, i experiment med 1000 celler, det vacufuge steget kunde stoppas mycket tidigare än experiment med 100 celler. Antalet prover i vacufuge påverkades också avdunstningen i våra experiment. Vi hittade som använder en flourometer för att validera DNA innehåll halvvägs genom steget koncentration kan vara till hjälp när du utför protokollet med okända prover. Lyckligtvis, om forskare över koncentrat per prov, nuclease gratis vatten kan läggas till späd provet. Teoretiskt, är det möjligt att använda vacufuge torka DNA och sedan blandas det i önskad volym; Vi föreslår dock att undvika komplett avdunstning.

Vi Visa de tre nuvarande metoderna för att generera samtidig DNA och RNA bibliotek, Gel-seq⁷, G & T-seq⁸och DR-seq⁹, som avgiftsfritt. Gel-seq är idealisk för prover i cellintervallet 100-1000 och kräver ingen nedrullningsbara mål eller en priori kunskap av genomet. De andra två metoderna är bättre lämpade för enstaka cell program. Ett av våra mål i att utveckla Gel-seq var att skapa ett protokoll som enkelt kunde genomföras av andra forskare. Vi beslutade därför att fabricera enheter inom standarden formfaktor av en polyakrylamidgel kassett. Medan tekniken vi används för att definiera våra olika membran är roman, har de flesta genetik labs redan all nödvändig utrustning för att tillverka Gel-seq enheten. Dessutom kostnaden för enheten är trivial - bara $5,25 för en enhet som kan bearbeta 12 prover. Som sagt, som med alla bibliotek förberedelse protokoll använder kommersiella reagenser, den totala kostnaden för att generera bibliotek är fortsatt hög. Våra reagens kostnaden per prov var $50 för hela-transcript förstärkning och $28 för biblioteket inför både DNA och RNA. Lyckligtvis, själva Gel-seq är protokollet agnostiker. Exempelvis under utveckling testat vi enheten med celler från kultur och en äldre RNA bibliotek förstärkning protokoll¹⁹, även om vi hittade inte den är lämplig för vävnadsprover från möss. Blicken mot framtiden, som billigare alternativ för bibliotek förberedelse utvecklas, kan vårt protokoll anpassas att arbeta med dessa nya tekniker. Vi tror att forskare finner det okomplicerat att genomföra Gel-seq i sina egna labb. Vi hoppas att detta kommer att underlätta ett snabbt antagande av tekniken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acrylamide Monomer	Sigma Aldrich	A8887-100G
Ammonium Persulfate	Sigma Aldrich	A3678-25G
Ampure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	Referred to in the text as solid phase reversible immobilization (SPRI) beads
DNA Gel Loading Dye (6x)	ThermoFisher Scientific	R0611	Referred to in the text as 6X loading dye
Ethyl alcohol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits	Kapa BioSystems	7959613001	Referred to in the text as 2X qPCR mix
N,N′-Methylenebis(acrylamide)	Sigma Aldrich	146072-100G	Also known as bis-acrylamide
NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referred to in the text as library preparation kit)	Illumina	FC-131-1024	Includes: TD (referred to in the text as transposase buffer), ATM (referred to in the text as transposase), NT (referred to in the text as transposase stop buffer), and NPM (Referred to in the text as library prep PCR mix)
Nuclease Free Water	Millipore	3098
Protease	Qiagen	19155
SMART-Seq v4 Kit (referred to in the text as whole-transcript amplification (WTA) kit)	Takara/Clontech	634888	Includes: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3’ SMART-Seq CDS Primer II A (referred to in the text as RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referred to in the text as first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referred to in the text as template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referred to in the text as reverse transcriptase), and PCR Primer II A (referred to in the text as cDNA PCR primer)
Random hexamer with WTA adapter	IDT	n/a	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G
TEMED	Sigma Aldrich	T9281-25ML
DNA AWAY Surface Decontaminant	ThermoFisher Scientific	7010PK	Referred to in the text as DNA removal product
Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentration)	Sigma Aldrich	T4415-1L
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)	ThermoFisher Scientific	S11494	Referred to in the text as gel stain
Equipment
BD Precisionglide syringe needles, gauge 18	Sigma Aldrich	Z192554	Any equivalent hardware is acceptable
Branson CPX series ultrasonic bath	Sigma Aldrich	Z769363	Any equivalent hardware is acceptable
Empty Gel Cassettes, mini, 1.0 mm	ThermoFisher Scientific	NC2010	Any equivalent hardware is acceptable
Mesh Filter Plate - Corning HTS Transwell 96 well permeable supports - 8.0 µm pore size	Sigma Aldrich	CLS3374	Referred to in the text as 8 um mesh filter plate
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052	Any equivalent hardware is acceptable
Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216	Any equivalent hardware is acceptable
Vacufuge Concentrator	Eppendorf	22822993	Any equivalent hardware is acceptable
XCell SureLock Mini-Cell system	ThermoFisher Scientific	EI0001	Any equivalent hardware is acceptable
Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855195	Any equivalent hardware is acceptable
Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker	GE Healthcare Life Sciences	UVC500-115V	Discontinued, any equivalent hardware is acceptable
Gel Doc XR+ Gel Documentation System	Bio-Rad	1708195	Referred to in the text as gel imager
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	DR89	Referred to in the text as UV transilluminator
Ultrasonic Bath	Bransonic	1207K35	Any equivalent ultrasonic bath is acceptable.