Gel-seq: En metode til samtidige sekventering bibliotek forberedelse af DNA og RNA bruger Hydrogel matricer

Summary

Gel-seq gør det muligt for forskere at samtidig forberede biblioteker til både DNA - og RNA-seq ubetydelige ekstra omkostninger fra 100-1000 celler ved hjælp af en simpel hydrogel enhed. Dette paper præsenterer en detaljeret tilgang til fabrikation af enheden samt den biologiske protokol til at generere parrede biblioteker.

Abstract

Evnen til at forstærke og enten DNA eller RNA-sekvens fra små start prøver er kun opnået i de sidste fem år. Desværre standardprotokoller til generering af genomisk eller transkriptom biblioteker er inkompatibel og forskere skal vælge om du vil DNA eller RNA-sekvens for en særlig prøve. Gel-seq løser dette problem ved at aktivere forskere at samtidig forberede biblioteker til både DNA og RNA starter med 100-1000 celler ved hjælp af en simpel hydrogel enhed. Dette paper præsenterer en detaljeret tilgang til fabrikation af enheden samt den biologiske protokol til at generere parrede biblioteker. Vi designet Gel-FF., så det let kunne gennemføres af andre forskere; mange genetik labs har allerede det nødvendige udstyr til at reproducere Gel-seq enhed fabrikation. Vores protokollen beskæftiger almindeligt anvendte kits til både hele-udskrift forstærkning (WTA) og bibliotek forberedelse, som også vil kunne være bekendt at forskere allerede bevandret i generering af genomisk og transkriptom biblioteker. Vores tilgang gør det muligt for forskerne at lægge både DNA og RNA sekventering magt på en enkelt prøve uden opdeling og med ubetydelige ekstra omkostninger.

Introduction

Næste generation sequencing (NGS) har haft en dybtgående indvirkning på den måde genetik forskes. Hvor forskere en gang fokuseret på sekvensering genomet af et hele arter, er det nu muligt at sekvens genomet af et enkelt tumor eller endda en enkelt celle i et eksperiment. ¹ NGS har også gjort det omkostningseffektivt at sekvens RNA afskrifter findes i en celle, en samling af data er kendt som transkriptom. Evnen til at forstærke og enten DNA eller RNA-sekvens fra små start prøver er kun opnået i de sidste fem år. ^{2 , 3 , 4} desværre standardprotokoller er inkompatibel og forskere skal vælge om du vil DNA eller RNA-sekvens for en given prøve. Når en start prøve er tilstrækkelig stor, kan det være delt i halve. I mindre målestok, men tab af materiale på grund af opdelingen prøver kan påvirke bibliotek kvalitet, og pooling af prøver kan gennemsnit ud interessante variationer mellem celler. ⁵ endvidere forskere er mere og mere interesseret i at undersøge prøver, der ikke kan opdeles, som enkelt celler eller små heterogene tumor biopsier. ⁶

For at løse dette problem, tre protokoller har for nylig blevet udviklet sekvens både DNA og RNA fra det samme udgangspunkt prøve: Gel-FF.⁷, G & T-FF.⁸og DR-seq⁹. Denne artikel præsenterer en detaljeret protokol for Gel-FF., hvilke kan bruges hen til samtidig generere DNA og RNA biblioteker fra så lidt som 100 celler på ubetydelige ekstra omkostninger. Det nye aspekt af Gel-seq er evnen til at adskille DNA og RNA baseret udelukkende på størrelse ved hjælp af lave omkostninger hydrogel matricer. Core innovation af Gel-Seq-protokollen er den fysiske adskillelse af DNA fra RNA. Denne adskillelse er opnået electrophoretically ved hjælp af en kombination af polyacrylamid membraner, at udnytte size forskelle mellem disse molekyler. For at sætte disse størrelse forskelle i sammenhæng, overveje hvordan DNA og RNA er afbildet: mens DNA findes på mikro-skalaen og kan ses ved hjælp af traditionelle mikroskoper, RNA findes på nanometer skala og må være afbildet ved hjælp af komplekse teknikker såsom cryo-elektron mikroskopi. ¹⁰

Tilgang til adskiller DNA og RNA i denne protokol er vist i figur 1. Panelet til venstre viser DNA og RNA gratis flyder i løsning i nærheden af en membran. Når et elektrisk felt anvendes, som vist i højre panel, opleve DNA og RNA en elektroforese kraft, der inducerer migration gennem membranen. Ved tuning membran egenskaber, har vi lavet en semipermeabel membran, der adskiller DNA fra RNA. DNA-molekyler er skubbet mod membranen, men bliver viklet ind i kanten på grund af deres store størrelse. Små RNA molekyler, på den anden side kan omkonfigurere og væver deres vej gennem membranen. Denne proces, som kaldes reptation, er lig den måde en slange bevæger sig gennem græsset. I sidste ende disse RNA molekyler er stoppet af en anden, high-density membran, der er for svært for selv mindre polymerer (> 200 basepar) at slippe gennem. Når fysisk adskilt, kan DNA og RNA inddrives og behandles for at generere oplysninger om både genom og transkriptom. Mens vi kan adskille DNA og RNA, har vi fundet der opnås bedre resultater, hvis RNA er omvendt transskriberet til cDNA før adskillelse. CDNA/RNA hybrider er mere stabile end RNA alene og kan stadig passere gennem low-density membranen.

Figur 1 . Gel-seq opererer princippet. Det underliggende princip bruges til fysisk separat DNA og RNA. I en anvendt elektrisk felt, små RNA molekyler vandrer gennem den low-density membran men store DNA molekyler er fanget på overfladen. Dette tal blev gengivet fra Ref. 7 med tilladelse fra Royal Society of Chemistry. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Dette papir beskriver i detaljer både fabrikation af Gel-seq-enheden og den biologiske protokol til at generere parret DNA og RNA biblioteker. En oversigt over både er vist i figur 2. Enheden er fremstillet af lagdeling tre forskellige tæthed polyacrylamidgeler oven på hinanden i en proces svarende til at skabe standard stabling geler. ¹¹ den biologiske protokol starter med 100-1000 celler suspenderet i PBS. Cellerne er mængden og RNA er omdannet til cDNA, før enheden bruges til at adskille genomisk DNA fra cDNA/RNA hybrider. Efter adskillelse og genvinding, genomisk og transkriptom er biblioteker udarbejdet ved hjælp af en proces, der nøje følger standard hele-genom bibliotek forberedelse kit protokol. Yderligere detaljer om udvikling og validering af Gel-seq kan læses i laboratoriet på en Chip publikation "Gel-seq: hele-genom og transkriptom sekventering af samtidige pesticidanvendelse DNA og RNA bibliotek forberedelse ved hjælp af semi-gennemtrængelige hydrogel barrierer ." ⁷

Figur 2 . Gel-seq protokol. En oversigt over trinene til at fabrikere Gel-seq enhed og protokollen til genereret parret DNA og RNA biblioteker. Dele af dette tal var gengivet fra Ref. 7 med tilladelse fra Royal Society of Chemistry. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

For at generere DNA og RNA biblioteker fra enkelt celler, forskere bør overveje at bruge enten G & T-seq eller DR-FF. G & T-FF., ligesom Gel-FF., er baseret på en fysisk adskillelse af RNA fra genomisk DNA. Denne tilgang er baseret på messenger RNA (mRNA) 3′ polyadenylated hale som en pull-down mål. MRNA er fanget på en magnetisk bead ved hjælp af en biotinylated oligo-dT primer. Når mRNA er blevet fanget perlerne er holdt på plads med en magnet, og supernatanten indeholdende genomisk DNA kan fjernet og overført til et andet rør. Efter denne fysiske adskillelse er komplet, kan separate biblioteker genereres fra mRNA og DNA. ⁸ denne fremgangsmåde fungerer godt, hvis RNA af interesse er polyadenylated, men det kan ikke bruges til at studere ikke-polyadenylated udskrifter, såsom ribosomale RNA, tRNA, eller RNA fra prokaryoter.

DR-seq bygger på et før forstærkning skridt hvor både DNA og cDNA afledt af RNA forstærkes i det samme rør. Prøven er derefter delt i to og behandles sideløbende at forberede DNA - og RNA-seq biblioteker. For at skelne mellem genomisk DNA og cDNA afledt af RNA, tager DR-seq en beregningsmæssige tilgang. Sekvenser, hvor kun exons er til stede er beregningsmæssigt undertrykt i genomisk DNA-data, som de kunne stamme fra enten DNA eller RNA. ⁹ en fordel ved denne tilgang er at DNA og cDNA/RNA ikke behøver være fysisk adskilt som er gjort i Gel-FF. og G & T-FF. Ulempen, er imidlertid at DR-seq kræver en forudgående viden om genomet og transkriptom (dvs., exons versus introner), og kan ikke være ideel til applikationer såsom sekventering af kerner, hvor mange udskrifter ikke er endnu fuldt splejset og stadig indeholde introns. ¹²

Det nye aspekt af Gel-seq er evnen til at adskille DNA og RNA i hundredvis af celler baseret udelukkende på størrelse. Denne metode kræver ingen apriori viden om genomet eller transkriptom, er robuste mod ufuldstændige splejsning, og er ikke begrænset til poly-adenylated udskrifter. Til applikationer, hvor en forsker kan begynde med mindst 100 celler, giver Gel-seq en ligetil tilgang ved hjælp af billige og bredt tilgængelige materialer.

Protocol

1. kemiske løsning forberedelse

Bemærk: Følgende trin er for at forberede kemiske løsninger kræves i senere trin. Disse kan være lavet i bulk og opbevares i flere måneder.

1. Til at begynde, skal du forberede 50 mL renset, deioniseret vand af sterilisering i 254 nm UV crosslinking ovn i 15 min. (15 mJ/cm² samlede eksponering) til at neutralisere enhver kontaminerende DNA. Opvarmning til 37 ° C til brug i følgende trin.
2. Gøre 10 mL af en 40% total (T) og 3,3% crosslinker (C) (29: 1) polyacrylamid forløber løsning. Vej 3.867 g af acrylamid monomere og 0.133 g af bis-acrylamid monomer. Kombinere og bringe volumen op til 10 mL med varmt renset vand og vortex indtil opløst. Opbevares beskyttet mod lys ved stuetemperatur.
   Bemærk: Forblandet 40% T, 3,3% C (29: 1) polyacrylamid løsninger kan købes kommercielt.
3. Gøre 10mL 50% T, 5% C gelopløsning. Vej 4.750 g af acrylamid monomere og 0.250 g af bis-acrylamid monomer. Kombinere og bringe volumen op til 10 mL med varmt renset vand og vortex indtil opløst. Opbevares beskyttet mod lys ved stuetemperatur.
4. Gøre 10 mL i en 50% (w/v) rørsukkeropløsning. 5 g saccharose tilføjes i et måleglas og tilføje varmt renset vand op til en samlet maengde paa 10 mL. Vortex indtil opløst og opbevares ved stuetemperatur.
5. Gøre 10 mL 10% APS (w/v). Tilsættes 1 g ammonium persulfat (APS) til et måleglas. Tilføje kolde (~ 4° C) renset vand op til en samlet maengde paa 10 mL og vortex indtil opløst. Straks fryse i delprøver af 200 µL.

2. gel-seq kassette fabrikation

Bemærk: Gel-seq blev oprindeligt udviklet med oprejst kassetter (Se Tabel af materialer for mere information); dog kan denne protokol tilpasses til at arbejde med enhver standard gel elektroforese kassette.

1. Forbered gel prækursorer i tre separate plasticrør ved at tilføje reagenser, som vist nedenfor i tabel 1. Ikke tilføje enten APS eller Tetramethylethylenediamine (TEMED) indtil instrueret i følgende trin. Vortex ingredienser blandes grundigt.

Filler Gel forløber		Høj densitet Gel forløber		Low Density Gel forløber
40 %T, 3.3%C acrylamid Bisacrylamide løsning	1,6 mL	50 %T, 5 %C acrylamid Bisacrylamide løsning	2,4 mL	40 %T, 3.3%C acrylamid Bisacrylamide løsning	0,6 mL
Ionbyttet vand	10.2 mL	Ionbyttet vand	1,0 mL	Ionbyttet vand	4.8 mL
Rørsukkeropløsning (50% w/v)	2.6 mL	Rørsukkeropløsning (50% w/v)	0,6 mL
10 X Tris-Borat-EDTA	1,6 mL			10 X Tris-Borat-EDTA	0,6 mL
Ammonium persulfat (10% w/v)	104.0 ΜL	Ammonium persulfat (10% w/v)	50,0 ΜL	Ammonium persulfat (10% w/v)	39.0 ΜL
TEMED	6,0 ΜL	TEMED	1,0 ΜL	TEMED	2.2 ΜL
Samlede volumen	16,1 mL	Samlede volumen	4.1 mL	Samlede volumen	6,0 mL

Tabel 1. Gel syntese reagenser. Polyacrylamiden forløber reagenser tilstrækkeligt for fabrikation af 2 kassetter.

2. Nedtrapning gas gel monomer løsninger ved at indsætte en nål gennem fælles landbrugspolitik af røret og forbinder dette nål til et hus vakuum linje. Dykke denne forsamling i et ultralydsbad sæt til høj og vente indtil boblerne stoppe nye fra væske før du flytter til næste trin (~ 60 sekunder / tube).
   Bemærk: Kvaliteten af vakuum og magt i ultralydsbad er ikke kritisk så længe bobler kan ses fra løsningen.
3. Tilføje TEMED og APS til fyldstof gel forløber og vortex kort. Straks tilføje 6 mL af fyldstof gel forstadie til hver gel kassette af pipettering løsningen ind i toppen af kassetten. Bruge en 1 mL mikropipette til at tilføje en forløber i seks trin til at undgå at spilde. Den samlede tid til dette trin bør være mindre end 3 minutter.
4. Sikre, at væsken er niveau ved at placere kassetter oprejst på en plan bord. Fyld resten af kassetten med deioniseret vand, afgassede vand. Tilsæt vand, igen med 1 mL intervaller, langsomt ind i midten af kassetten for at minimere blanding. Tillad polymer hærde i mindst en time, op for at overnatte.
5. Efter polymeren har helbredt, invertere gel kasetter over en vask til at fjerne vand overlay. En komprimeret luftpistol kan bruges til at forsigtigt tørre grænsefladen ved at blæse luft gennem den øverste åbning af kassetten fra en afstand af 6 inches.
6. Tilføje TEMED og APS til high-density gel forløber og vortex kort. Straks tilføje 320 µL af high-density forløberen til kassette, igen ved hjælp af 1 mL pipette. Sikre væsken jævnt frakker fyldstof gel lag af vuggende kassetten frem og tilbage omkring 3 gange. Dette skridt bør tage mindre end tre minutter.
7. Fyld resten af kassetten med deioniseret vand, afgassede vand. Afpipetteres langsomt med 1 mL pipette i midten af kassetten for at minimere blanding. Tillad polymer hærde i mindst 15 minutter, helst en time.
8. Igen, vend gel kassetter for at fjerne vand overlay. Trykluft kan bruges til at forsigtigt tørre grænsefladen. Tilføje TEMED og APS til lav bebyggelsestæthed gel forløber og vortex kort. Straks fylde resten af kassette (~1.65 mL) med lav densitet gel forløber og indsætte gel kam.
9. Tilsæt et overskud af reserve forløber på toppen af kammen, som det vil blive absorberet under polymerisation. Tillad polymer til at helbrede i mindst 4 timer, helst natten over. Gels kan opbevares i en uge eller mere i en buffer af Tris-Borat-ethylendiamintetra syre (EDTA) (TBE buffer).

3. Prøvetilberedning og Reverse transkription

1. Startende med en suspension af celler af interesse, og arbejder i en polymerase kædereaktion (PCR) laminar flow hætte, bruge en hemocytometer eller en automatisk celle counter til at beregne den celle koncentration. Fortynd celler til en koncentration på 100 til 1000 celler / µL i fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
   Bemærk: Denne protokol er blevet valideret på et celleområde, herunder PC3, HeLa, og musen leveren celler.
2. Reagenser leveres i WTA kit (Se Tabel af materialer), mix 19 µL af lysisbuffer og 1 µL af RNase-hæmmer til at forberede en 10 X lager løsning af reaktion buffer. Oprette en lysis master mix af tilstrækkelig volumen indeholdende 0,5 µL af reaktion buffer og 2,75 µL nukleasen gratis vand til hver prøve.
3. Der afpipetteres cellesuspension op og ned 5 gange til genopslæmmes udlignede celler og derefter afpipetteres 1 µL af prøven i en 200 µL nukleasen gratis strip tube steriliseret ved UV. Gentag som nødvendigt, afhængigt af antallet af prøver. Sørg for at medtage en negativ kontrol af pipettering 1 µL nukleasen gratis vand i stedet for celler for en reaktion. Dernæst tilføje 3.25 µL af lysis master mix til hver prøve og blandes forsigtigt pipettering op og ned 5 gange.
4. Forvarm en termisk cycler (med opvarmet låg) til 72 ° C. Tilføje 1 µL af RT primer og 1 µL af 20 µM tilfældige hexamer med WTA adapter (5 '-AAGCAGTGGTAT-CAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′) til hver prøve. Reserve mindst ét rør som positiv kontrol for gDNA bibliotek forberedelse og tilføje 2 µL vand i stedet for primere.
   Bemærk: Tilfældig hexamer med WTA adapter er valgfri og har minimal indvirkning på sekventering resultater.
5. Inkuber prøver på mindst 72 ° C i en forvarmet termisk cycler i 3 minutter til lyse celler. Fjerne celler fra termiske cycler og sted på is i 2 minutter. Gemme den positive kontrol ved 4 ° C indtil trin 5.
6. Mens cellerne lysing, oprette en tilstrækkelig mængde af reverse transkription master mix for alle RNA prøver indeholdende følgende reagens nøgletal: 2 µL af første strand buffer, 0,5 µL af skabelon switch oligonukleotid (TSO), 0,25 µL af RNase hæmmer og 1 µL af reverse transkriptase (100 U/µL).
7. Forvarm termisk cycler til 42 ° C. Tilføje 3.75 µL af reverse transkription master mix til de resterende prøver, at bringe den samlede prøve volumen til 10 µL. Mix af pipettering op og ned 5 gange.
8. Udføre reverse transkription af straks markedsføring prøver i en forvarmet termisk cycler. Køre følgende program: 42 ° C til 90 min, 70 ° C i 10 min, 4 ° C for evigt. Dette er en sikker standsested.

4. gel adskillelse og prøve opsving

1. Forsigtigt rense en gel elektroforese kammer ved hjælp af et DNA fjernelse produkt. Anvende flere mL af den flydende rengøringsmiddel på en engangs lint gratis tørre og tørre på tværs af alle overflader af kammeret, og derefter fylde salen med ren 0,5 x TBE. For optimale resultater, sted hele apparatet i en 254 nm UV crosslinking ovn og sterilisere i 15 minutter (15 mJ/cm²).
2. Indsæt Gel-seq kassette i gel elektroforese kammeret og låse det på plads. Langsomt Fjern gel kam ved at trække lige op. Flyt langsomt at undgå rive gel eller ripping nogen af armene.
3. At holde prøverne fra trin 3 på is, reserver mindst én prøve som positiv kontrol til cDNA bibliotek generation. Gemme denne kontrol ved 4 ° C indtil trin 6. Tilføj 2 µL af 6 X lastning farvestof til de resterende prøver, at bringe den samlede mængde til ~ 12 µL. grundigt Bland prøverne af pipettering op og ned 5 gange.
4. Kombiner 1 µL af en DNA stige med 2 µL af 6 x lastning farvestof og 7 µL vand. Der afpipetteres denne blanding i lane 1 i Gel-seq kassetten som en elektroforese kontrol. Med pipette udtages prøver fra det forrige trin til separate baner af Gel-seq kassette. Vær omhyggelig med at forhindre forurening mellem brønde ved at indsætte pipetten fuldt i hver brønd og fjerne det ved hjælp af kun en lodret bevægelse.
5. Ved hjælp af en standard gel elektroforese strømforsyning, gælde et elektrisk felt af 250 V på tværs af Gel-seq kassette i 30 minutter for at adskille gDNA fra cDNA/RNA hybrider. Når adskilt, fjerne Gel-seq kassette fra gel elektroforese kammer og åbne de to halvdele af kassetten af nysgerrige kanterne med en skrabning værktøj.
6. Ved hjælp af en skalpel, halveret gel lige under det high-density lag. Kassér den halvdel, der indeholder fyldstof gel ved at samle det med din behandskede hånd. Skræl forsigtigt de resterende gel ud af kassetten ved at skrabe det med en maling skraber eller andre lignende værktøj. Placer denne gel i en skål indeholdende ~ 30 mL 0,5 x TBE med 3 µL af gel pletten.
7. Dække beholderen for at minimere photobleaching og blød gel mens forsigtigt ryste beholderen i 5 minutter. Placere gel på plastikfolie og tage en UV billedet ved hjælp af en gel dokumentationssystem (for yderligere detaljer se Ref. 13). En 30 anden eksponering producerer typisk klare billeder. Kontroller, at adskillelsen er opstået.
8. Flytte gel til en UV transilluminator til lette visualisering af nukleinsyrer. Iført passende UV briller, Bekræft resultaterne fra gel dokumentationssystem. GDNA skal placeres i starten af low-density gel og cDNA på grænsefladen af regionerne low-density og high-density.
9. Bruge en skalpel, skære regionerne i gelen indeholder gDNA og cDNA. Prøverne er bedst inddrives ved at skære en 4 mm ved 10 mm rektangulære del af gel; men den nøjagtige geometri vil afhænge af gel elektroforese systemet bruges. Husk at også skære lane fyldt med den negative kontrol.
10. Placer hver skåret gel i en stribe rør af med en stump ende pincet. Vær omhyggelig med ikke at anvende for meget kraft eller gel vil opdele i flere stykker. Dette skulle ske, bare afhente hvert stykke og føje den til røret.
11. Grind gel i hvert rør ved hjælp af spidsen af en pipette (200 µL pipette tips arbejde godt) ved at flytte pipetten spids i en cirkulær mode mod bunden af røret. Tilføje nukleasen gratis vand (40 µL til gDNA prøver og 80 µL til cDNA prøver) til hver tube før du fjerner pipette spidsen bruges til at slibe gel for at minimere prøve tab.
12. Sted strimlen rør til en vortex mixer inde i et 37 ° C inkubator og ryste i 8-12 timer. Dette tillader nukleinsyrer til diffuse ud af gelen og er en naturlig stoppunkt for denne multi dag protokol.
13. Afpipetteres prøverne i en 8 µm mesh filterplade og spin plade på 2600 x g i 5 minutter til stamme ud gel fragmenter. Løft mesh filterplade fra boliger plade og afpipetteres i gel-fri vandprøver ind i en ny 200 µL strip rør.
14. Tilføje 1 µL af protease (0,9 AU/mL) til hver prøve, der indeholder gDNA, bland godt af pipettering op og ned, og der inkuberes ved 50 ° C i 15 min. efterfulgt af en varme inaktivering ved 70 ° C i 15 min. Dette trin er kritisk for nedbryder nucleosomes og gør gDNA tilgængelige for efterfølgende reaktion trin.
15. Bruger en 18 gauge kanyle, stikke huller i caps af alle prøveglassene. Placer prøverne i en vacufuge at reducere flydende volumen. gDNA prøver bør reduceres til 5 µL og cDNA prøver reduceret til 10 µL.
16. Afhængigt af antallet af prøver og vacufuge vil den samlede fordampning tid varierer mellem 30 og 60 minutter. Hvis prøven volumen falder under destinationsdiskenheden, skal du blot tilføje nukleasen gratis vand for at øge sample volumen.

5. gDNA bibliotek forberedelse

1. Ved hjælp af en fluorometer eller lignende teknologi, kvantificere koncentrationen af DNA i hver gDNA prøve fra trin 4 samt den positive kontrol fra trin 3. For en detaljeret protokol Se fluorometer reference manual. ¹⁴
2. Fortynd prøver til 0,2 ng/µL DNA. Afhængig af udgangspunkt celletype og kvalitet af resultater kræves, kan lavere koncentrationer stadig producere levedygtige biblioteker. Nogle eksperimenter vil være påkrævet; Men forfatterne havde succes med biblioteker så lav som 0,1 ng/µL.
3. Komplet gDNA bibliotek forberedelse ved at følge den bibliotek forberedelse halve reaktion volumen protokol i trin 7.

6. cDNA bibliotek forberedelse

1. Start med 10 µL cDNA prøver og positiv kontrol fra trin 4, tilføje 12,5 µL af 2 X qPCR mix, 0,5 µL cDNA PCR primer og 2 µL nukleasen-gratis vand.
2. Udføre PCR i en real-time thermocycler ved hjælp af følgende protokol: hot-starter ved 95 ° C i 3 min, efterfulgt af 20-30 cyklusser af 98 ° C til 10 s, 65 ° C til 30 s, og mindst 72 ° C til 3 min. samlede volumen er 25 µL. overvåge reaktion kurver og stoppe forstærkning før th e reaktioner forlade den eksponentielle fase (lineær signal stigning versus cyklus nummer) for at undgå PCR artefakter på grund af overamplification. For mere om at undgå overamplification, se afsnittet diskussion af dette papir samt Ref. 15.
3. Efter forstærkning, ren produktet ved hjælp af faste fase reversible immobilisering (SPRI) perler efter protokollen i trin 8. Når færdig, fortsætte til næste trin.
4. Ved hjælp af en fluorometer eller lignende teknologi, kvantificere DNA-koncentrationen i hver prøve, cDNA samt den positive kontrol fra trin 4. Fortynd prøverne, hvis det er nødvendigt at indeholde ca 0,2 ng/µL DNA. Lidt lavere koncentrationer stadig producere levedygtige biblioteker. Nogle eksperimenter vil være påkrævet, men forfatterne havde succes med biblioteker så lav som 0,1 ng/µL.
5. Valgfrit trin: udføre en standard polyacrylamid gel elektroforese adskillelse på 1-2 µL af hver qPCR produkt til at validere bibliotek generation reaktion arbejdede. En prøve billede af vellykket resultat er vist i figur 4. For en detaljeret protokol om, hvordan man gennemføre polyacrylamid gelelektroforese, se Ref. 16.
6. Komplet cDNA bibliotek forberedelse ved at følge bibliotek forberedelse kit halv mængde reaktion protokol i trin 7.

7. bibliotek forberedelse med halv mængde reaktioner

1. Biblioteket forberedelse følger bibliotek forberedelse kit protokollen benytter halvdelen volumen reaktioner. ¹⁷ alle reagenser der refereres til i dette afsnit af protokollen er fra biblioteket forberedelse kit (Se Tabel af materialer). Begynde af UV-sterilisering et tilstrækkeligt antal strip rør til antallet af prøver skal behandles.
2. Udføre transposase reaktion ved at tilføje 5 µL transposase buffer til hver strimmel rør skal anvendes i analysen. Derpå tilsættes 2,5 µL input DNA på 0,2 ng/µL (0,5 ng alt) efterfulgt af 2,5 µL transposase. Mix af pipettering op og ned 5 gange.
3. Der inkuberes ved 55 ° C i 5 minutter, så hold på 10 ° C. Efter prøven når 10 ° C, fjerne det fra thermocycler og straks tilføje 2,5 µL transposase stop buffer til hver prøve. Holde prøverne ved stuetemperatur i 5 minutter.
4. Forberede PCR reaktion til at forstærke TRANSPONER behandles prøven ved at tilføje 7,5 µL bibliotek prep PCR mix, 2,5 µL af en indeks 1 primer og 2,5 µL af en indeks 2 primer. Disse primere er beskyttet og leveres af producenten af bibliotek forberedelse kit. Bland godt af pipettering op og ned 5 gange.
   Bemærk: Sikre at unikke primer kombinationer anvendes til hver prøve. Der er 12 forskellige indeks 1 primere og 8 forskellige indeks 2 primere, hvilket gør det muligt at unikt mærke op til 96 forskellige prøver. Vælg en unik kombination af primere for hver prøve.
5. Udføre PCR ved hjælp af følgende program på en thermocycler. Sample volumen er 25 µL.
   72 ° C i 3 minutter
   95 ° C i 30 sekunder
   12 cyklusser af:
   95 ° C i 10 sekunder
   72 ° C i 30 sekunder
   55 ° C i 30 sekunder
   72 ° C i 5 minutter
   Hold ved 10 ° C
6. Ren de forberedte biblioteker benytter SPRI perler efter protokollen i trin 8. Bibliotekerne skal valideres ved hjælp af gelelektroforese eller en lignende assay. Henvises til biblioteket forberedelse kit manual for oplysninger om, hvordan du validere biblioteker. ¹⁷

8. faste fase Reversible immobilisering perle bibliotek rengøring

1. Faste fase reversible immobilisering (SPRI) perler bør opbevares i 1,5 mL alikvoter og skal være bragt til stuetemperatur før hver brug. Det anbefales også at forberede friske 80% ethanol til hvert eksperiment. Følgende trin er baseret SPRI perle protokol i WTA kit manual. ¹⁸
2. Tilføje 1 µl af WTA kit lysisbuffer til hver PCR produkt. Vortex SPRI perler indtil jævnt blandet, derefter tilsættes 50 µl af Sprinkler perler til hver prøve. Mix af pipettering prøven op og ned 10 gange og derefter inkuberes prøverne ved stuetemperatur i 8 minutter.
3. Kort spin prøver for at indsamle væsken fra siden af rørene. Placer prøverne på en magnetisk separation enhed for ~ 5 minutter indtil væsken vises helt klart.
4. Mens prøverne er på enheden magnetisk separation, langsomt afpipetteres ud af supernatanten og kassere - pas på ikke at forstyrre ringen af perler på røret. Næste tilføje 200 µL 80% ethanol til hver prøve uden at forstyrre perlerne. Vent i 30 sekunder og derefter omhyggeligt afpipetteres off supernatanten. Gentag dette trin (ethanol vask) når.
5. Tillad prøver at tørre til 30 s - 1 min. Ikke over tør prøverne som store fragmenter vil blive permanent bundet til perlerne.
   Bemærk: En kort tørretid anbefales at sikre alle spor af ethanol er fjernet. Bør spormængder af ethanol forblive bag kan de lidt hæmme downstream reaktioner.
6. Fjernes prøverne fra enhedens magnetisk separation og tilføje 15 µL vand til hver prøve at eluere DNA fra glasperler. Pipetteres op og ned og sikre, at perlerne er fjernet fra siderne af rørene. Inkuber ved stuetemperatur i 2 minutter. Kort spin prøverne og derefter placere dem på enheden magnetisk separation for ~ 1 minut indtil løsningen vises tydeligt.
7. Mens prøverne er på enheden magnetisk separation, langsomt pipetteres op supernatanten og overføre det til ren rør. Pas på ikke at forstyrre ringen af perler på røret. Kassér rør med perler.

Representative Results

Den fysiske adskillelse af gDNA og cDNA/RNA hybrider i Gel-seq enhed kan visualiseres gennem fluorescerende gel imaging; et repræsentativt resultat er vist i figur 3. Panel A viser den opdigtede Gel-seq enhed; falsk farve er blevet tilføjet til at skelne de forskellige gel regioner. Panelet B viser en tæt af fire forskellige separationer bruges til validering. Den tredje lane, en negativ kontrol, repræsenterer baggrund og viser, at der ingen autoflourescence af gel på grænsefladerne. Vi læsset de første og anden baner med DNA stiger. Disse baner viser kun et mørkt bånd på grænsefladen mellem lav og høj density membraner, afslører, at små fragmenter kan passere gennem low-density gel. Den fjerde lane viser funktionsmåden for en biologisk prøve af interesse: 500 PC3 celler. Vi læsset lane fire som beskrevet i trin 3 i protokollen. Billedet viser adskillelse af genomisk DNA og cDNA/RNA hybrider. Et mørkt bånd på toppen af low-density membranen er megabase-skala genomisk DNA, mens cDNA/RNA hybrider er stablet på grænsefladen af regionerne lav og høj tæthed. I modsætning til de baner fyldt med stigen, er der også flere bands inden for regionen high-density af gelen. Disse fragmenter, mindre end 100 bp, er off-målprodukter genereret fra primer oligonukleotider under reverse transkription. Panelet C viser et repræsentativt billede af hele Gel-seq enheden fra en vellykket eksperiment. Baner mærket RNA/cDNA blev behandlet med Gel-seq-protokollen, mens baner mærket RNA viser en adskillelse af bare gDNA og RNA. Panel D viser et mislykket eksperiment med sorte bånd i toppen af hver vognbane af low-density membranen. Dette var forårsaget af elektroforese buffer forurenet med fragmenterede DNA. På dette trin, forskere bør være på udkig efter både rene negative kontroller og to særskilte sorte bånd, hvilket indikerer tilstedeværelsen af adskilte gDNA og RNA/cDNA hybrider.

Figur 3 . Gel-Seq adskillelse resultater. Gel-seq enhed (A) og en fluorescerende billedet viser adskillelse af DNA og RNA/cDNA hybrider (B). Falsk farve er blevet føjet til mere let skelne mellem de forskellige regioner af tæthed i gelen. (C og D) Repræsentative fluorescerende billeder af hele Gel-seq enheden fra en vellykket (C) og mislykkedes (D) eksperiment. NTC = ingen skabelon kontrol. Dele af dette tal var gengivet fra Ref. 7 med tilladelse fra Royal Society of Chemistry. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Når DNA og RNA/cDNA hybrider har været adskilt og resten af Gel-seq-protokollen gennemført, er det muligt at generere sekventering biblioteker. For at validere de forberedte biblioteker, kører vi enten en standard gel elektroforese eksperiment (figur 4) eller en bioanalyzer. Resultaterne i figur 4 viser biblioteker genereret fra 500 PC3 celler og 750 HeLa celler. Figuren viser fragment fordelinger for matchede biblioteker genereret fra Gel-seq (mærket "Gel") i forhold til uovertruffen prøver genereret med standardprotokoller (mærket 'Rør'). Fragment størrelser for Gel-seq vises mellem 200 og 800 basepairs som forventet ved udarbejdelsen af biblioteker ved hjælp af standard hele-genom bibliotek forberedelse kit. Hvis biblioteket fragmenter ikke vises i det korrekte størrelsesområde i dette trin, mislykkedes bibliotek forberedelse.

Figur 4 . Biblioteket Fragment størrelse sammenligning. En fluorescerende gel elektroforese billede sammenligning bibliotek størrelse fordeling mellem Gel-seq (Gel) og standard kontrol (Tube). Den venstre vognbane indeholder en lav masse DNA stige med fragment størrelser 100, 200, 400, 800, 1200 og 2000 basepairs. Fragment størrelser for alle biblioteker falder mellem 200 og 800 basepairs, som forventet for biblioteker udarbejdet med dette kit. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Den ultimative validering af Gel-seq-protokollen er baseret på analyse af sekventering resultater. Vi valgte PC3 celler for vores validering eksperimenter, da disse celler er homogent udtryk profiler, der tillader prøver at blive delt og behandlet ved hjælp af Gel-FF. og traditionelle metoder; Se figur 5. En sammenligning mellem genomisk DNA til PC3 celler er vist i tallene 5A og 5 b. Figur 5 A viser en sammenligning af genome-wide copy number variation (CNV) profiler genereret fra PC3 ved hjælp af enten Gel-seq eller en standard hele-genom bibliotek prep reaktion (tube kontrol). Hvert punkt er en gennemsnitlig normaliseret bin tæller; placeringer er defineret fra genom referencedata, sådan at hver bin har lige forventede antal i en sund diploide celler, dvs, en flad kurve, der repræsenterer lige eksemplarer for hver region af alle autosomal (undtagen X og Y) kromosomer. PC3 indeholder flere kopier af de samme regioner, som dukker op som spikes over en baggrund kopi nummer to. Gel-seq udbytter en kvalitativt lignende CNV profil som standard tube reaktion. Aftale mellem de to grunde kan vurderes kvantitativt ved lineær regression, som vist i panelet B. En Pearson korrelation på R = 0,90 angiver, genomisk data indsamlet fra enten metode er funktionelt tilsvarende.

Figur 5 . Biblioteket validering. Gel-seq-validering af den genomiske (A og B) og transkriptom (C, D og E) data genereret fra PC3 og Hela celler. Panel A viser en sammenligning af genome-wide CNV profiler genereret fra PC3 ved hjælp af enten Gel-seq (Gel-seq) eller en standard reaktion (tube). MAPD = Median absolutte parvise forskel. Panelet B er en lineær regression mellem de to prøver i panelet A med R = 0,90 med angivelse af de genomiske data er funktionelt tilsvarende. Akserne Vis log2 normaliseret bin tæller. Paneler C og D sammenligne transkriptom data fra PC3 celler, med hvert punkt viser en optælling i udskrifter pr. kilobase pr. million (TPM). Akserne vist en sammenligning mellem to prøver som log2 normaliseret udskrift tæller. Panelet C viser en sammenligning af tekniske replikater genereret ved hjælp af Gel-FF., og panelet D viser en sammenligning mellem Gel-FF. og traditionelle RNA-FF. Panel E viser, at Gel-seq kan løse celletype baseret på RNA udtryk ved hjælp af en principal komponent analyse. X-aksen viser, at de første hovedbestanddel konti for 91,6% af variationen mellem prøverne, mens y-aksen viser, at de anden hovedbestanddel konti for kun 6,5% af variansen. Dele af dette tal var gengivet fra Ref. 7 med tilladelse fra Royal Society of Chemistry. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Ligeledes, vi sammenlignede transkriptom data fra vores Gel-seq protokol til Smart-Seq standardprotokol i rør. Figur 5 viser sammenhængen mellem begge Gel-seq tekniske flergangsbestemmelser (figur 5C) og Gel-FF. og den standard metode (fig. 5D). Hvert punkt er en tælle i udskrifter pr. kilobase pr. million (TPM) for hvert gen registreret på TPM > 5 i begge datasæt. De lineære regressioner vises som røde linjer, og Pearson korrelationskoefficienten er vist i øverste venstre hjørne. Tekniske replikater fra Gel-seq enig (R ∼ 0,8), men korrelerer mindre godt med den standard metode (F < 0,7). Dette tyder på, at Gel-seq introducerer en skævhed i gen tæller. Heldigvis, denne bias er systematisk, og som det ses af figur 5Eprincipal komponent analyse, stadig kan drages meningsfulde konklusioner mellem forskellige biologiske prøver.

Discussion

Der er flere kritiske trin forbundet med Gel-seq enhed fabrikation samt selve protokollen. Under fabrikation anbefaler vi at starte med de foreskrevne lag tykkelser for de forskellige regioner af gelen. Vi brugte betydelig tid teste forskellige fabrikation indstillinger og protokollen beskrevet her producerer de bedste enheder til kassetter, der er anført i tabel af materialer og reagenser. Hvis forskere bruger en alternativ kassettesystem, kan de finde det nødvendigt at justere de mængder, der anvendes ved oprettelse af enhederne. Den store udfordring i fabrikation er, at hvis regionen high-density gel er for stor, det kan delaminere fra kanterne af kassetten og oprette luftlommer på indre af kassetten, der vil forstyrre elektroforese. Ved støbning flere kassetter med flere forskellige lag bind, bør forskere kunne hurtigt afgøre den optimale konfiguration for deres specifikke hardware.

Gel-seq-protokollen har også flere kritiske trin, som kan valideres, før protokollen er fuldført. En potentiel manglende punkt er adskillelsen af gDNA og RNA/cDNA hybrider. Dette kan bekræftes af imaging Gel-seq indretning efter separation (Se figur 3B). I en opsætning af eksperimenter, fandt vi at vores lab levering af buffer havde bliver forurenet med DNA og skabte betydelige autoflourescence i vores enhed (Se figur 3D). Dette gjorde det vanskeligt at afgøre, om adskillelse havde fundet sted. Fluorescerende imaging hjalp os med at identificere og løse problemet før du bruger nogen dyre reagenser til at generere sekventering biblioteker.

Et andet kritisk punkt er trin 6.2, qPCR forstærkning af cDNA efter adskillelse. Forskerne bør være omhyggelig med ikke at overamplify i dette trin, da det vil reducere kvaliteten af RNA-seq data. Denne overvejelse er ikke enestående for Gel-FF., men er en fælles aspekt af lav-input RNA-seq bibliotek forberedelse. PCR-amplifikation under sekventering bibliotek forberedelse er ofte nødvendig, men det kan indføre sekvens fejl og afvigelser. Det krævede antal cyklusser for PCR afhænger prøve mængde og kompleksitet. Det er generelt tilrådeligt at begrænse PCR cyklus antallet at som minimum kræves for at give tilstrækkelig klyngedannelse, når bibliotekerne er sekventeret. I teorien kan en protokol optimeret for at finde det nøjagtige cyklus-nummeret, der giver tilstrækkelig eksemplarnummer uden at indføre overdreven artefakter. I praksis, dog uoverensstemmelser i stikprøven kvalitet, lastning eller håndtering tidligt i protokollen kan dramatisk påvirker fordelingen af molekylære skabeloner til rådighed for biblioteket prep PCR, som igen påvirker optimal PCR cyklus antallet. Den mest almindelige løsning har vi fundet for at overvåge status for forstærkning reaktioner ved hjælp af et fluorescerende farvestof, køre reaktioner på en real-time PCR thermocycler og stoppe reaktioner i den eksponentielle (lineær versus cyklus antallet) fase. Vores erfaring er real-time overvågning især relevant, når udvikling, tilpasning eller vedtage en ny protokol.

Den sidste kritiske trin genererer genomisk og transkriptom biblioteker. Nøglen til dette skridt er at angive start prøve koncentrationen for DNA bibliotek prep reaktion så tæt på 0,2 ng/µL (0,5 ng alt) som muligt. Dette er forholdsvis ligetil for qPCR forstærket cDNA, da der som regel et overskud af cDNA, men det kan være mere udfordrende for gDNA prøver. Vi fandt omhyggelig opmærksomhed til vacufuge trin var påkrævet, mens prøverne blev koncentreres. Som forventet i eksperimenter med 1000 celler, vacufuge skridt kunne være stoppet meget hurtigere end eksperimenter med 100 celler. Antallet af prøver i vacufuge også påvirket fordampning sats i vores eksperimenter. Vi fandt, bruger en flourometer til at validere DNA indhold, halvvejs gennem trinnet koncentration kunne være nyttigt, når du udfører protokol med ukendte prøver. Heldigvis, hvis forskere over koncentrere sig om prøven, nukleasen gratis vand kan føjes til fortyndes prøven. Teoretisk set, det er muligt at bruge vacufuge at tørre DNA og derefter resuspend det i den ønskede mængde; Vi foreslår dog at undgå fuldstændig fordampning.

Vi se de tre nuværende metoder til at generere samtidige DNA og RNA biblioteker, Gel-FF.⁷, G & T-FF.⁸og DR-seq⁹, som gratis. Gel-seq er ideel til prøver i 100-1000 celleområde og kræver ingen pull-down mål eller forudgående viden om genomet. De andre to metoder er bedre egnet til enkelt celle applikationer. Et af vores mål med at udvikle Gel-seq var at skabe en protokol, der let kunne gennemføres af andre forskere. Vi besluttede derfor at fabrikere enheder i en polyacrylamid gel kassette standard formfaktor. Mens den teknik vi bruges til at definere vores forskellige membraner er roman, har de fleste genetik labs allerede alt det nødvendige udstyr til at fabrikere Gel-seq-enhed. Derudover enheden er triviel - bare $5.25 for en enhed, der kan behandle 12 prøver. Når det er sagt, som med ethvert bibliotek forberedelse protokollen ved hjælp af kommercielle reagenser, de samlede omkostninger til at generere biblioteker er stadig høj. Vores reagens omkostninger pr. sample var $50 for hele-udskrift forstærkning og $28 til biblioteket forberedelse til både DNA og RNA. Heldigvis er selve Gel-seq-enheden protokollen agnostiker. For eksempel, under udvikling testede vi enheden ved hjælp af celler fra kultur og en ældre RNA bibliotek forstærkning protokol¹⁹, selv om vi fandt, det ikke var egnet til vævsprøver fra mus. Ser mod fremtiden, som er udviklet billigere alternativer til biblioteket forberedelse, kan vores protokol tilpasses til at arbejde med disse nye teknikker. Vi mener, at forskere vil finde det ligetil at gennemføre Gel-seq i deres egen labs. Vi håber, at dette vil lette en hurtig vedtagelse af teknologien.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acrylamide Monomer	Sigma Aldrich	A8887-100G
Ammonium Persulfate	Sigma Aldrich	A3678-25G
Ampure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	Referred to in the text as solid phase reversible immobilization (SPRI) beads
DNA Gel Loading Dye (6x)	ThermoFisher Scientific	R0611	Referred to in the text as 6X loading dye
Ethyl alcohol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits	Kapa BioSystems	7959613001	Referred to in the text as 2X qPCR mix
N,N′-Methylenebis(acrylamide)	Sigma Aldrich	146072-100G	Also known as bis-acrylamide
NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referred to in the text as library preparation kit)	Illumina	FC-131-1024	Includes: TD (referred to in the text as transposase buffer), ATM (referred to in the text as transposase), NT (referred to in the text as transposase stop buffer), and NPM (Referred to in the text as library prep PCR mix)
Nuclease Free Water	Millipore	3098
Protease	Qiagen	19155
SMART-Seq v4 Kit (referred to in the text as whole-transcript amplification (WTA) kit)	Takara/Clontech	634888	Includes: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3’ SMART-Seq CDS Primer II A (referred to in the text as RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referred to in the text as first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referred to in the text as template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referred to in the text as reverse transcriptase), and PCR Primer II A (referred to in the text as cDNA PCR primer)
Random hexamer with WTA adapter	IDT	n/a	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G
TEMED	Sigma Aldrich	T9281-25ML
DNA AWAY Surface Decontaminant	ThermoFisher Scientific	7010PK	Referred to in the text as DNA removal product
Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentration)	Sigma Aldrich	T4415-1L
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)	ThermoFisher Scientific	S11494	Referred to in the text as gel stain
Equipment
BD Precisionglide syringe needles, gauge 18	Sigma Aldrich	Z192554	Any equivalent hardware is acceptable
Branson CPX series ultrasonic bath	Sigma Aldrich	Z769363	Any equivalent hardware is acceptable
Empty Gel Cassettes, mini, 1.0 mm	ThermoFisher Scientific	NC2010	Any equivalent hardware is acceptable
Mesh Filter Plate - Corning HTS Transwell 96 well permeable supports - 8.0 µm pore size	Sigma Aldrich	CLS3374	Referred to in the text as 8 um mesh filter plate
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052	Any equivalent hardware is acceptable
Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216	Any equivalent hardware is acceptable
Vacufuge Concentrator	Eppendorf	22822993	Any equivalent hardware is acceptable
XCell SureLock Mini-Cell system	ThermoFisher Scientific	EI0001	Any equivalent hardware is acceptable
Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855195	Any equivalent hardware is acceptable
Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker	GE Healthcare Life Sciences	UVC500-115V	Discontinued, any equivalent hardware is acceptable
Gel Doc XR+ Gel Documentation System	Bio-Rad	1708195	Referred to in the text as gel imager
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	DR89	Referred to in the text as UV transilluminator
Ultrasonic Bath	Bransonic	1207K35	Any equivalent ultrasonic bath is acceptable.