Gel-seq: Um método para a preparação de biblioteca simultânea de sequenciamento de DNA e RNA usando matrizes de hidrogel

Summary

Gel-seq permite aos investigadores simultaneamente preparar bibliotecas para ambos DNA - e RNA-seq insignificante custo adicionado a partir de 100-1000 células usando um dispositivo simples de hidrogel. Este trabalho apresenta uma abordagem detalhada para a fabricação do dispositivo, bem como o protocolo biológico para gerar bibliotecas emparelhadas.

Abstract

A capacidade de amplificar e sequenciar o DNA ou RNA de pequenas amostras de partida só foi alcançada nos últimos cinco anos. Infelizmente, os protocolos padrão para gerar genômica ou transcriptomic bibliotecas são incompatíveis e pesquisadores devem escolher-se para sequenciar o DNA ou RNA para uma determinada amostra. Gel-seq resolve esse problema permitindo que pesquisadores preparar simultaneamente bibliotecas para DNA e RNA, começando com 100-1000 células usando um dispositivo simples de hidrogel. Este trabalho apresenta uma abordagem detalhada para a fabricação do dispositivo, bem como o protocolo biológico para gerar bibliotecas emparelhadas. Nós projetamos Gel-seq para que ele pode ser facilmente implementado por outros pesquisadores; muitos laboratórios de genética já tem o equipamento necessário para reproduzir a fabricação do dispositivo de Gel-seq. Nosso protocolo emprega comumente usados kits para ambos os todo-transcrição de amplificação (WTA) e preparação da biblioteca, que também são susceptíveis de ser familiar para os investigadores já versado na geração de genômica e transcriptomic bibliotecas. Nossa abordagem permite que os pesquisadores trazer para suportar o poder de sequenciamento de DNA e o RNA em uma única amostra sem divisão e com custo insignificante adicionado.

Introduction

Próxima geração (NGS) de sequenciamento teve um profundo impacto no caminho a pesquisa genética é realizada. Onde pesquisadores uma vez focada no sequenciamento do genoma de uma espécie inteira, é agora possível sequenciar o genoma de um tumor único ou até mesmo uma única célula em um experimento. ¹ NGS também tornou rentável para sequenciar os transcritos de RNA encontrados dentro de uma célula, uma coleção de dados conhecidos como a transcriptoma. A capacidade de amplificar e sequenciar o DNA ou RNA de pequenas amostras de partida só foi alcançada nos últimos cinco anos. ^{2 , 3 , 4} infelizmente, protocolos padrão são incompatíveis e pesquisadores devem escolher-se para sequenciar o DNA ou RNA para uma determinada amostra. Quando uma amostra inicial é grande o suficiente, ele pode ser dividido ao meio. Em escalas menores, no entanto, perda de material devido a separação de amostras pode afetar a qualidade da biblioteca, e pool de amostras pode média variações interessantes entre as células. ⁵ além disso, os pesquisadores estão cada vez mais interessados em examinar as amostras que não podem ser divididas, como células únicas ou biópsias de pequeno tumor heterogêneo. ⁶

Para resolver este problema, recentemente foram desenvolvidos três protocolos para sequenciar o DNA e o RNA da mesma amostra inicial: Gel-seq⁷, G & T-seq⁸e DR-seq⁹. Este artigo apresenta um protocolo detalhado para Gel-seq, que pode ser usado para gerar simultaneamente bibliotecas de DNA e RNA de apenas 100 células no custo adicionado insignificante. O aspecto inovador do Gel-seq é a capacidade de separar o DNA e RNA baseado exclusivamente no tamanho usando matrizes de hidrogel de baixo custo. A inovação do núcleo do protocolo Gel-Seq é a separação física do DNA do RNA. Esta separação é alcançada electrophoretically usando uma combinação de membranas de poliacrilamida que aproveitam as diferenças de tamanho entre estas moléculas. Para colocar estas diferenças de tamanho em contexto, considere como o DNA e RNA são fotografada: enquanto o ADN existe na escala de mícron e pode ser visualizado usando microscópios tradicionais, RNA existe na escala de nanômetros e deve ser fotografado usando técnicas complexas como cryo-elétron microscopia. ¹⁰

A abordagem para separação de DNA e RNA neste protocolo é mostrada na Figura 1. O painel esquerdo mostra DNA e RNA livram flutuação em solução perto de uma membrana. Quando um campo elétrico é aplicado, como mostrado no painel da direita, DNA e RNA experimentam uma força eletroforética que induz a migração através da membrana. Ajustando as propriedades da membrana, nós criamos uma membrana semipermeável que separa o DNA do RNA. As moléculas de DNA são empurradas contra a membrana, mas tornar-se enredado na borda, devido ao seu grande tamanho. Pequenas moléculas de RNA, por outro lado, podem reconfigurar e tecer sua maneira através da membrana. Este processo, conhecido como reptation, é similar à maneira que uma cobra se move pela grama. Eventualmente, estas moléculas de RNA são interrompidas por uma membrana de alta densidade, segunda que é muito difícil para polímeros ainda menores (> 200 pares de bases) de esquivar-se através de. Uma vez que fisicamente separados, DNA e RNA podem ser recuperado e processadas para gerar informação sobre o genoma e transcriptoma. Enquanto podemos separar DNA e RNA, encontramos melhores resultados são obtidos se o RNA é reverso transcrito de cDNA antes da separação. Os híbridos de cDNA/RNA são mais estáveis que o RNA sozinho e ainda podem passar através da membrana de baixa densidade.

Figura 1 . Princípio de funcionamento de gel-seq. O princípio subjacente usado para separar fisicamente o DNA e RNA. Em um campo elétrico aplicado, pequenas moléculas de RNA migram através da membrana de baixa densidade, mas grandes moléculas de DNA estão presas na superfície. Esta figura foi reproduzida da ref. 7 com a permissão da Real Sociedade de química. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este paper descreve detalhadamente tanto a fabricação do Gel-seq dispositivo e o protocolo biológico para gerar emparelhado bibliotecas de DNA e RNA. Uma visão geral de ambos é mostrada na Figura 2. O dispositivo é fabricado pela estratificação três diferentes densidade geles de polyacrylamide em cima do outro em um processo semelhante à criação de gel de empilhamento padrão. ¹¹ o protocolo biológico começa com 100-1000 células suspendidas em PBS. As células lysed e o RNA é convertido em cDNA antes que o dispositivo é usado para separar os híbridos de cDNA/RNA o DNA genômico. Após a separação e recuperação, genômica e transcriptomic bibliotecas são preparadas com um processo que segue de perto o protocolo de kit de preparação de biblioteca padrão do inteiro-genoma. Mais detalhes sobre o desenvolvimento e validação de Gel-seq podem ser lido no laboratório em uma publicação de Chip "Gel-seq: do inteiro-genoma e transcriptoma sequenciamento por simultânea baixa-entrada DNA e RNA biblioteca preparação usando barreiras semi-permeáveis hidrogel ." ⁷

Figura 2 . Protocolo de gel-seq. Uma visão geral das etapas para fabricar o dispositivo Gel-seq e o protocolo gerado emparelhado bibliotecas de DNA e RNA. Porções desta figura foram reproduzidas de ref. 7 com a permissão da Real Sociedade de química. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para gerar bibliotecas de DNA e RNA de células únicas, pesquisadores devem considerar o uso de G & T-seq ou Seq. DR G & T-Seq, como Gel-seq, se baseia em uma separação física do RNA do DNA genômico. Esta abordagem baseia-se no RNA mensageiro (mRNA) 3 ' polyadenylated cauda como um destino de suspenso. O mRNA é capturada em um grânulo magnético usando um primer de oligo-dT biotinilado. Uma vez que o mRNA foi capturado os grânulos são prendidos no lugar com um imã e o sobrenadante contendo o DNA genômico pode ser removido e transferido para outro tubo. Após concluir esta separação física, bibliotecas separadas podem ser geradas do mRNA e DNA. ⁸ esta abordagem funciona bem se o RNA de interesse é polyadenylated, porém não pode ser usado para estudar não-polyadenylated transcrições, tais como o RNA ribossomal, tRNA ou RNA de procariontes.

DR-seq baseia-se em uma etapa de pré-amplificação onde tanto o DNA e o cDNA derivados de RNA são amplificados no mesmo tubo. A amostra é então dividida em dois e processada em paralelo para preparar as bibliotecas de DNA e RNA-seq. Para distinguir entre DNA genômico e o cDNA derivados de RNA, DR-seq adota uma abordagem computacional. Sequências onde apenas exões estão presentes são computacionalmente suprimidas nos dados de DNA genômicos, como aqueles poderiam ter se originado de DNA ou RNA. ⁹ uma vantagem dessa abordagem é que o DNA e RNA de cDNA/precisam não ser fisicamente separados como é feito em Gel-seq e G & T-Seq A desvantagem, no entanto, é que DR-seq requer conhecimento a priori do genoma e transcriptoma (ou seja, exões contra os intrões) e talvez não seja ideal para aplicações tais como sequenciamento dos núcleos, no qual muitas transcrições ainda não são totalmente emendados e ainda contêm intrões. ¹²

O aspecto inovador do Gel-seq é a capacidade de separar o DNA e RNA em centenas de células com base exclusivamente em tamanho. Este método requer um priori nenhum conhecimento do genoma ou do transcriptoma, é robusto contra emenda incompleta e não está limitado a transcrições de poli-adenylated. Para aplicações onde um pesquisador pode começar com pelo menos 100 células, Gel-seq fornece uma abordagem simples, usando materiais baratos e amplamente disponível.

Protocol

1. preparação da solução química

Nota: Os passos seguintes são para a preparação de soluções químicas necessárias em etapas posteriores. Estes podem ser feitos em grandes quantidades e armazenados por vários meses.

1. Para começar, prepare-se 50 mL de água purificada, deionizada esterilização em 254 nm UV reticulação forno por 15 min (15 mJ/cm² exposição total) neutralizar qualquer DNA contaminante. Calor de 37 ° C para uso em etapas a seguir.
2. Fazer 10 mL de um 40% total (T) e 3,3% crosslinker (C) (29:1) solução de precursor de poliacrilamida. Pese 3,867 g de monômero de acrilamida e 0,133 g de monômero de bis-acrilamida. Combinar e trazer volume até 10 mL com água purificada quente e vórtice até dissolver. Armazenar protegido da luz em temperatura ambiente.
   Nota: Pré-misturados 40% T, soluções de poliacrilamida 3,3% C (29:1) podem ser adquiridas comercialmente.
3. Fazer 10mL 50% T, solução de gel 5% C. Pese 4,750 g de monômero de acrilamida e 0,250 g de monômero de bis-acrilamida. Combinar e trazer o volume de 10 mL de água filtrada morna e vórtice até dissolver. Armazenar protegido da luz em temperatura ambiente.
4. Fazer 10 mL da solução de sacarose a 50% (p/v). Adicionar sacarose 5 g para uma proveta graduada e adicionar água filtrada morna até um volume total de 10 mL. Vórtice até dissolver e armazenar à temperatura ambiente.
5. 10 mL de 10% de fazer APS (p/v). Adicione 1 g de persulfato de amónio (APS) para um cilindro graduado. Adicionar a frio (~ 4° C) purificado água até um volume total de 10 mL e vórtice até dissolver. Imediatamente congele em alíquotas de 200 µ l.

2. fabricação de gaveta gel-seq

Nota: Gel-seq foi originalmente desenvolvido com fitas na vertical (ver Tabela de materiais para obter mais informações); no entanto, este protocolo pode ser adaptado para trabalhar com qualquer gaveta de electroforese do gel de padrão.

1. Prepare o gel de precursores em três tubos de plástico separados adicionando os reagentes como mostrado abaixo no tabela 1. Não adicione APS ou tempted (TEMED) até dirigido nas etapas a seguir. Ingredientes de vórtice para homogeneizar.

Precursor do Gel de enchimento		Precursor de Gel de alta densidade		Precursor do Gel de baixa densidade
40 %T, 3.3%C do acrilamido Bisacrylamide solução	1,6 mL	50 %T, 5 %C do acrilamido Bisacrylamide solução	2,4 mL	40 %T, 3.3%C do acrilamido Bisacrylamide solução	0,6 mL
Água desionizada	10,2 mL	Água desionizada	1,0 mL	Água desionizada	4,8 mL
Solução de sacarose (50% p/v)	2,6 mL	Solução de sacarose (50% p/v)	0,6 mL
10 X Tris-borato-EDTA	1,6 mL			10 X Tris-borato-EDTA	0,6 mL
Persulfato de amónio (10% p/v)	104.0 Μ l	Persulfato de amónio (10% p/v)	50,0 Μ l	Persulfato de amónio (10% p/v)	39,0 Μ l
TEMED	6,0 Μ l	TEMED	1,0 Μ l	TEMED	2.2 Μ l
Volume total	16,1 mL	Volume total	4,1 mL	Volume total	6,0 mL

Tabela 1. Gel de síntese reagentes. Reagentes de precursor do gel de polyacrylamide suficientes para a fabricação de 2 gavetas.

2. Gás de gel de soluções de monômero inserindo uma agulha através da tampa do tubo e conexão esta agulha com uma linha de vácuo de casa. Submergir a este assembly em um conjunto de banho ultra-sônico de alta e esperar até que parem de bolhas emergindo o líquido antes de se mudar para a próxima etapa (~ 60 segundos / tubo).
   Nota: A qualidade do vácuo e o poder do banho ultra-sônico não é críticos desde que as bolhas podem ser vistas emergindo a solução.
3. Adicione TEMED e APS para o precursor do gel de enchimento e o vórtice brevemente. Imediatamente adicione 6 mL do precursor do gel de enchimento para cada gaveta de gel pipetando a solução na parte superior da fita. Use uma micropipeta 1ml para adicionar o precursor em incrementos de seis para evitar derramamento. O tempo total para esta etapa deve ser menos de 3 minutos.
4. Certifique-se que o fluido é nível posicionando as fitas na vertical em uma mesa de nível. Preencha o restante da fita com água desionizada, libertos. Distribuir a água, novamente, usando incrementos de 1 mL, lentamente para o centro da fita para minimizar a mistura. Permitir que o polímero curar pelo menos uma hora, até para a noite.
5. Após o polímero tem curado, inverta as fitas de gel sobre um dissipador para remover a sobreposição de água. Uma arma de ar comprimido pode ser usada para secar delicadamente a interface soprando ar através da abertura superior da fita de uma distância de 6 polegadas.
6. Adicione TEMED e APS para o precursor de gel de alta densidade e vórtice brevemente. Imediatamente adicione 320 µ l do precursor de alta densidade para a gaveta, novamente usando uma pipeta de 1 mL. Certifique-se que o fluido uniformemente reveste a camada de gel de enchimento balançando a gaveta e para trás em torno de 3 vezes. Esta etapa deve levar menos de três minutos.
7. Preencha o restante da fita com água desionizada, libertos. Pipetar lentamente com uma pipeta de 1 mL para o centro da fita para minimizar a mistura. Permitir que o polímero curar pelo menos quinze minutos, de preferência uma hora.
8. Novamente, inverta as fitas de gel para remover a sobreposição de água. Ar comprimido pode ser usado para secar delicadamente a interface. Adicione TEMED e APS para o precursor do gel de baixa densidade e o vórtice brevemente. Imediatamente, preencher o restante da fita (~1.65 mL) com o precursor do gel de baixa densidade e inserir o pente de gel.
9. Pipete um excesso de reserva precursor no topo do pente como ele será absorvido durante a polimerização. Permitir que o polímero curar pelo menos 4 horas, de preferência durante a noite. Géis podem ser armazenadas por uma semana ou mais em um tampão de ácido Tris-borato-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (amortecedor de TBE).

3. amostra preparação e reverter a transcrição

1. Começando com uma suspensão de células de interesse e trabalhando em uma capa de fluxo laminar do polymerase reação em cadeia (PCR), usam um hemocytometer ou um contador automático de células para calcular a concentração de células. Dilua as células a uma concentração de 100 a 1000 células por µ l de tampão fosfato salino (PBS).
   Nota: Este protocolo foi validado em um intervalo de células, incluindo células de fígado de rato, HeLa e PC3.
2. Utilizando reagentes fornecidos na WTA kit (ver Tabela de materiais), mistura 19 µ l de tampão de Lise e estoque de 1 µ l de inibidor de RNase para preparar um 10 X solução de tampão de reação. Crie uma mistura de mestre de Lise contendo 0,5 µ l de tampão de reação e 2,75 µ l de água livre de nuclease para cada amostra de volume suficiente.
3. Pipete a suspensão de eritrócitos e descer 5 vezes para re-suspender as células se estabeleceram e em seguida, Pipetar 1 µ l de amostra para um tubo de faixa livre de nuclease 200 µ l esterilizado por UV. Repita, se necessário, dependendo do número de amostras. Não se esqueça de incluir um controle negativo por pipetagem 1 µ l de água livre de nuclease em vez de células para uma reação. Em seguida, adicionar 3.25 µ l do mix mestre Lise para cada amostra e misture suavemente pipetando subindo e descendo 5 vezes.
4. Pré-aqueça um termociclador (com tampa aquecida) para 72 ° C. Adicione 1 µ l de primer RT e 1 µ l de hexâmero aleatória de 20 µM com adaptador WTA (5 '-AAGCAGTGGTAT-CAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3. ') para cada amostra. Reservar pelo menos um tubo como um controle positivo para preparação de biblioteca gDNA e adicionar 2 µ l de água em vez de cartilhas.
   Nota: Hexâmero aleatório com adaptador WTA é opcional e tem um impacto mínimo sobre os resultados do sequenciamento.
5. Incube as amostras a 72 ° C no termociclador pré-aquecido durante 3 minutos para lisar as células. Remova células do termociclador e coloque no gelo por 2 minutos. Armazene o controlo positivo a 4 ° C até o passo 5.
6. Enquanto as células são Lise, criar um volume suficiente de mistura mestre de transcrição reversa para todas as amostras de RNA contendo os seguintes rácios de reagente: 2 µ l de buffer de primeira vertente, 0,5 µ l de modelo interruptor do oligonucleotide (TSO), 0,25 µ l de inibidor de RNase e 1 µ l de transcriptase reversa (100 U / µ l).
7. Pré-aqueça o cycler térmico a 42 ° C. Adicionar 3,75 µ l do mix de mestre de transcrição reversa para amostras restantes, trazendo o volume total da amostra de 10 µ l. Mix pipetando subindo e descendo 5 vezes.
8. Execute a transcrição reversa, colocando imediatamente amostras em um termociclador pré-aquecido. Execute o programa a seguir: 42 ° C por 90 min, 70 ° C durante 10 min, 4 ° C para sempre. Este é um ponto de parada segura.

4. gel separação e recuperação da amostra

1. Limpe cuidadosamente uma câmara de electroforese do gel usando um produto de remoção de DNA. Aplicar vários mL do agente de limpeza do líquido de um apagamento livre de fiapos descartáveis e limpe todas as superfícies da câmara e em seguida, encha a câmara com 0,5 limpa x TBE. Para obter melhores resultados, coloque todo o aparelho em forno de reticulação 254 nanômetro UV e esterilizar por 15 minutos (15 mJ/cm²).
2. Insira a fita de Gel-seq câmara da electroforese do gel e travá-lo no lugar. Remova lentamente o gel de pente, puxando para cima. Mova lentamente para evitar rasgar o gel ou rasgando qualquer um dos braços.
3. Mantendo as amostras da etapa 3 no gelo, reserve pelo menos uma amostra como um controle positivo para geração de biblioteca de cDNA. Guarde este controle a 4 ° C até o passo 6. Adicionar 2 µ l de 6 X tintura para amostras restantes de carregamento, trazendo o volume total de ~ 12 µ l. completamente misturar as amostras pipetando subindo e descendo 5 vezes.
4. Combine 1 µ l de uma escada de DNA com 2 µ l de 6 x 7 µ l de água e tinta de carregamento. Pipete esta mistura para a pista 1 da fita Gel-seq como um controle de electroforese. Pipete as amostras da etapa anterior em corredores separados da fita Gel-seq. Tenha cuidado para evitar a contaminação entre poços inserindo a pipeta totalmente em cada poço e removê-lo usando apenas um movimento vertical.
5. Usando uma fonte de alimentação padrão do gel de eletroforese, aplica um campo elétrico de 250 V em toda a fita de Gel-seq durante 30 minutos para separar o gDNA os híbridos de cDNA/RNA. Uma vez separados, remova o cartucho de Gel-seq da câmara de eletroforese de gel e abra as duas metades da fita por erguer as bordas com uma ferramenta de raspagem.
6. Usando um bisturi, corte o gel ao meio logo abaixo da camada de alta densidade. Descarte a metade que contém gel de enchimento por pegá-la com a mão enluvada. Descasque delicadamente o gel restante fora da gaveta raspando-a com um raspador de tinta ou outra ferramenta semelhante. Coloque esta seção do gel em um prato contendo ~ 30 mL de 0.5 x TBE com 3 µ l de gel mancha.
7. Cobrir o recipiente para minimizar o fotobranqueamento e mergulhe o gel agitando suavemente o recipiente por 5 minutos. Coloque o gel em filme plástico e leve a uma imagem de UV, utilizando um sistema de documentação do gel (para mais detalhes, consulte ref. 13). Uma exposição de 30 segundo normalmente produz imagens claras. Verifique se que a separação ocorreu.
8. Mova o gel para um transiluminador UV para facilitar a visualização dos ácidos nucleicos. De óculos apropriado UV, confirme os resultados do sistema de documentação de gel. O gDNA deverá situar-se no início do gel de baixa densidade e o cDNA na interface das regiões de baixa densidade e alta densidade.
9. Usar um bisturi, corte fora das regiões do gel que contém o gDNA e cDNA. As amostras são recuperadas melhor cortando um 4mm de seção retangular de 10 mm de gel; no entanto, a geometria exata dependerá do sistema de eletroforese de gel de usado. Lembre-se também cortar a pista carregada com o controle negativo.
10. Coloque cada seção excisada do gel em um tubo de strip-tease, usando um par de pinças de ponta romba. Tenha cuidado para não aplicar muita força ou o gel irá dividir em vários pedaços. Deve isto acontecer, simplesmente pegar cada pedaço e adicioná-lo ao tubo.
11. Triture o gel em cada tubo, usando a ponta de uma pipeta (200 µ l pipetas dicas funcionam bem), movendo a ponta da pipeta de forma circular, contra o fundo do tubo. Adicione água livre de nuclease (40 µ l para as amostras gDNA e 80 µ l para as amostras de cDNA) para cada tubo antes de remover a ponta da pipeta usada para moer o gel para minimizar a perda de amostra.
12. Coloque os tubos de faixa para um misturador de vórtice dentro de uma incubadora de 37 ° C e agitar durante 8-12 horas. Isso permite que os ácidos nucleicos difundir fora o gel e é natural parar ponto para este multi protocolo de dia.
13. Pipetar as amostras para uma placa de filtro de malha de 8 µm e girar a placa a 2600 x g por 5 minutos para tensão fora os fragmentos do gel. Levante a placa do filtro de malha longe a placa da carcaça e pipetar as amostras grátis de gel de água para um novo tubo de tira 200 µ l.
14. Adicionar 1 µ l de protease (0,9 AU/mL) para cada amostra contendo gDNA, mistura bem pipetando para cima e para baixo e incubar a 50 ° C, durante 15 min, seguido por uma inativação de calor a 70 ° C por 15 min. Esta etapa é fundamental para esgotar os nucleossomas e torna o gDNA acessível para as etapas subsequentes de reação.
15. Usando uma agulha de 18 calibre, buracos no caps de todos os tubos de amostra. Coloca as amostras em um vacufuge para reduzir o volume de líquido. gDNA amostras devem ser reduzidas para 5 µ l e cDNA amostras reduzidas a 10 µ l.
16. Dependendo da vacufuge e do número de amostras, o tempo de evaporação total irá variar entre 30 e 60 minutos. Se o volume da amostra cai abaixo o volume de destino, basta adicione água livre de nuclease para aumentar o volume da amostra.

5. gDNA biblioteca preparação

1. Usando uma tecnologia similar ou dados, quantificar a concentração de DNA em cada amostra gDNA da etapa 4, bem como o controle positivo da etapa 3. Para um protocolo detalhado, consulte o manual de referência de dados. ¹⁴
2. Dilua as amostras de 0,2 ng / µ l de DNA. Dependendo do tipo de célula inicial e qualidade dos resultados exigidos, concentrações inferiores ainda podem produzir bibliotecas viáveis. Algumas experiências serão necessárias; no entanto, os autores tiveram sucesso com bibliotecas tão baixas quanto 0.1 ng / µ l.
3. Concluir a preparação de biblioteca gDNA seguindo o protocolo de volume biblioteca preparação meia reação na etapa 7.

6. preparação da biblioteca de cDNA

1. A partir de 10 µ l do cDNA amostras e controle positivo da etapa 4, adicione 12,5 µ l de mistura de X qPCR 2, primeira demão do PCR de cDNA µ l 0,5 e água livre de nuclease 2 µ l.
2. Realizar PCR em um thermocycler em tempo real usando o seguinte protocolo: quente-iniciar a 95 ° C por 3 min, seguido por 20 a 30 ciclos de 98 ° C por 10 s, 65 ° C por 30 s e 72 ° C por 3 min. o volume de amostra Total é de 25 µ l. monitorar as curvas de reação e parar a amplificação antes th reações e deixar a fase exponencial (aumento de sinal linear versus número de ciclo) para evitar artefatos PCR devido a overamplification. Para saber mais sobre evitando overamplification, consulte a seção de discussão deste papel, bem como ref. 15.
3. Após a amplificação, limpe o produto usando fase sólida grânulos de imobilização reversível (SPRI) seguindo o protocolo na etapa 8. Depois de concluído, prossiga para a próxima etapa.
4. Usando uma tecnologia similar ou dados, quantificar a concentração de DNA em cada amostra de cDNA, bem como o controle positivo da etapa 4. Dilua as amostras, se necessário, para conter aproximadamente 0,2 ng / µ l de DNA. Concentrações ligeiramente inferiores ainda produzem bibliotecas viáveis. Algumas experiências serão necessárias, no entanto, os autores tiveram sucesso com bibliotecas tão baixas quanto 0.1 ng / µ l.
5. Passo opcional: realizar uma separação de electroforese do gel de polyacrylamide padrão em 1-2 µ l de cada o produto de qPCR para validar a reação de geração de biblioteca funcionou. Uma imagem de exemplo de bom resultado é mostrada na Figura 4. Para um protocolo detalhado sobre como conduzir a eletroforese em gel de poliacrilamida, consulte ref. 16.
6. Concluir a preparação de biblioteca de cDNA, seguindo o protocolo de reação preparação biblioteca metade do volume de jogo na etapa 7.

7. Biblioteca preparação com reações de metade do Volume

1. Preparação de biblioteca segue o protocolo de kit de preparação de biblioteca usando reações metade do volume. ¹⁷ todos os reagentes referenciados nesta seção do protocolo são de preparação a biblioteca kit (veja a Tabela de materiais). Começar por UV esterilizar um número suficiente de tubos de strip-tease para o número de amostras a serem processadas.
2. Realizar a reação de transposase adicionando buffer de transposase 5 µ l de cada tubo tira a ser usado no ensaio. Em seguida, adicione 2,5 µ l de entrada DNA em 0,2 ng / µ l (total de 0.5 ng) seguido de 2,5 µ l transposase. Misture por pipetagem e descer 5 vezes.
3. Incubar a 55 ° C por 5 minutos e, em seguida, mantenha a 10 ° C. Após a amostra atinge 10 ° C, retire o thermocycler e imediatamente adicionar buffer de paragem 2,5 µ l transposase para cada amostra. Manter as amostras à temperatura ambiente por 5 minutos.
4. Prepare a reação de PCR para amplificar a amostra de transpor tratado pela adição de 7,5 µ l biblioteca prep PCR mix, 2,5 µ l de um primer de índice 1 e 2,5 µ l de um primer de índice 2. Estes primers são proprietários e são fornecidos pelo fabricante do kit preparatório de biblioteca. Misture bem por pipetagem e descer 5 vezes.
   Nota: Certifique-se que combinações originais da primeira demão são usadas para cada amostra. Existem 12 Cartilhas diferentes índice 1 e 8 primeiras demão de índice diferente de 2, tornando possível rotular com exclusividade até 96 amostras diferentes. Escolha uma combinação única de primers para cada amostra.
5. Realize PCR usando o programa a seguir em um thermocycler. O volume da amostra é de 25 µ l.
   72 ° C por 3 minutos
   95 ° C por 30 segundos
   12 ciclos de:
   95 ° C por 10 segundos
   72 ° C por 30 segundos
   55 ° C por 30 segundos
   72 ° C por 5 minutos
   Segure a 10 ° C
6. Limpe as bibliotecas preparadas usando grânulos SPRI seguindo o protocolo na etapa 8. As bibliotecas devem ser validadas usando electroforese em gel ou um ensaio semelhante. Consulte o manual de kit de preparação de biblioteca para obter detalhes sobre como validar as bibliotecas. ¹⁷

8. sólida fase reversível imobilização do grânulo biblioteca limpeza

1. Fase sólida de grânulos de imobilização reversível (SPRI) devem ser armazenados em alíquotas de 1,5 mL e devem ser trazido à temperatura ambiente antes de cada utilização. Também é aconselhável preparar fresco 80% de etanol para cada experimento. Baseiam-se as etapas a seguir o protocolo de grânulo SPRI no manual do kit da WTA. ¹⁸
2. Adicione 1 µ l de buffer WTA kit Lise para cada produto do PCR. Vórtice os grânulos SPRI até uniformemente misturados, em seguida, adicionar 50 µ l de grânulos SPRI para cada amostra. Misture pipetando a amostra acima e para baixo 10 vezes e então incubar as amostras à temperatura ambiente durante 8 minutos.
3. Brevemente gire as amostras para coletar o líquido do lado dos tubos. Coloca as amostras em um dispositivo de separação magnética por ~ 5 minutos até que o líquido parece completamente claro.
4. Enquanto as amostras estão no dispositivo de separação magnética, lentamente, pipetar o sobrenadante e descarte - cuidado para não perturbar o anel de miçangas no tubo. Em seguida, adicione 200 µ l de etanol a 80% de cada amostra sem perturbar os grânulos. Espere 30 segundos e então cuidadosamente Pipetar fora o sobrenadante. Repita essa etapa (lavagem de etanol) uma vez.
5. Permitir que as amostras secar por 30 s - 1 min. Não seque em demasiado as amostras como fragmentos grandes vão tornar-se permanentemente vinculados aos talões.
   Nota: Recomenda-se um breve tempo seco para garantir que todos os vestígios de etanol são removidos. Devem permanecer de vestígios de etanol por trás eles ligeiramente podem inibir reações a jusante.
6. Remover as amostras do dispositivo de separação magnética e adicionar 15 µ l de água para cada amostra a Eluir o DNA de grânulos. Pipetar para cima e para baixo e garantir que os grânulos são removidos dos lados dos tubos. Incube a temperatura ambiente por 2 minutos. Brevemente, girar as amostras e depois colocá-los no dispositivo de separação magnética ~ 1 minuto até que a solução aparece clara.
7. Enquanto as amostras estão no dispositivo de separação magnética, lentamente, pipetar se o sobrenadante e transferir para tubos limpos. Tenha cuidado para não perturbar o anel de miçangas no tubo. Descarte os tubos com miçangas.

Representative Results

A separação física dos híbridos gDNA e cDNA/RNA em Gel-seq dispositivo pode ser visualizada através de imagens de gel fluorescente; um resultado representativo é mostrado na Figura 3. Painel A mostra o dispositivo Gel-seq fabricado; falsa cor foi adicionada para distinguir as gel de diferentes regiões. Painel B aparece um close de quatro separações diferentes usadas para validação. A terceira pista, um controlo negativo, representa o plano de fundo e mostra que não há nenhum autoflourescence do gel para as interfaces. Nós carregamos as pistas de primeiras e segunda com escadas de DNA. Essas pistas mostram apenas uma banda escura na interface entre as membranas de baixa e alta densidade, revelando que pequenos fragmentos podem passar através do gel de baixa densidade. A quarta pista mostra o comportamento de uma amostra biológica de interesse: 500 células PC3. Nós carregamos pista quatro conforme descrito na etapa 3 do protocolo. A imagem mostra a separação de DNA genômico e híbridos de cDNA/RNA. Uma faixa escura na parte superior da membrana baixa densidade é megabase-escala DNA genômico, enquanto os híbridos de cDNA/RNA são empilhados na interface das regiões de baixas e alta densidade. Ao contrário das pistas carregadas com escada, há também várias bandas presentes dentro da região de alta densidade do gel. Estes fragmentos, menores do que 100 bp, são o alvo produtos gerados a partir de oligonucleotides cartilha durante a transcrição reversa. Painel C mostra uma imagem representativa de todo o dispositivo de uma experiência bem sucedida Gel-seq. Lanes rotulados RNA/cDNA foram processadas com o protocolo de Gel-seq, enquanto lanes rotulados RNA mostram uma separação de apenas gDNA e RNA. Painel D mostra uma experiência falhada com faixas pretas na parte superior de cada raia da membrana de baixa densidade. Isto foi causado por electroforese buffer contaminado com DNA fragmentado. Neste passo, os investigadores devem ser procurando ambos controles negativos limpo e duas faixas pretas distintas, indicando a presença de gDNA separado e híbridos de RNA/cDNA.

Figura 3 . Resultados de separação do gel-Seq. O dispositivo de Gel-seq (A) e uma imagem fluorescente, mostrando a separação dos híbridos de DNA e RNA/cDNA (B). Falsa cor foi adicionada para distinguir mais facilmente entre as diferentes regiões de densidade dentro do gel. (C e D) Imagens fluorescentes representativas de todo o dispositivo de uma bem sucedida (C) e a experiência falhada (D) Gel-seq. NTC = sem controle do modelo. Porções desta figura foram reproduzidas de ref. 7 com a permissão da Real Sociedade de química. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma vez que os híbridos de DNA e RNA/cDNA foram separados e o restante do Gel-seq protocolo concluído, é possível gerar bibliotecas de sequenciamento. Para validar as bibliotecas preparadas, podemos executar um experimento de electroforese do gel de padrão (Figura 4) ou um bioanalyzer. Os resultados da Figura 4 mostram bibliotecas geradas a partir de 500 células PC3 e 750 células HeLa. A figura mostra as distribuições de fragmento para bibliotecas correspondentes geradas a partir de Gel-seq (rotulado 'Gel') em comparação com amostras incomparáveis geradas com protocolos padrão (rotulados 'Tube'). Os tamanhos do fragmento de Gel-seq aparecem entre 200 e 800 basepairs como esperado quando preparar bibliotecas usando o kit de preparação da biblioteca padrão do inteiro-genoma. Se os fragmentos de biblioteca não aparecem na faixa de tamanho correto nesta etapa, a preparação de biblioteca falhou.

Figura 4 . Comparação de tamanho de fragmento de biblioteca. Uma imagem de eletroforese de gel de fluorescente comparando a distribuição de tamanho de biblioteca entre Gel-seq (Gel) e controles padrão (tubo). Na faixa da esquerda contém uma baixa massa escada de DNA com fragmento tamanhos 100, 200, 400, 800, 1200 e 2000 basepairs. Os tamanhos de fragmento para todas as bibliotecas cair entre 200 e 800 basepairs, conforme o esperado para bibliotecas preparadas com este kit. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A validação final do Gel-seq protocolo baseia-se na análise dos resultados do sequenciamento. Nós selecionamos PC3 células para nossos experimentos de validação, como estas células têm perfis de expressão homogénea que permitem amostras ser dividido e processados usando Gel-seq e métodos tradicionais; consulte a Figura 5. Uma comparação entre o DNA genômico para células PC3 é mostrada nas figuras 5A e 5B. Figura 5 A mostra uma comparação dos perfis de variação (CNV) cópia de genoma-largo números gerado a partir de PC3 usando Gel-seq ou uma reação de preparação de biblioteca padrão do inteiro-genoma (controle de tubo). Cada ponto é uma contagem média bin normalizado; escaninhos são definidos a partir de dados do genoma de referência tal que cada bin tem igual contagem esperada em uma célula diploide saudável, ou seja, uma linha plana, representando cópias iguais para cada região de tudo autossômica (excluindo o X e Y) cromossomos. PC3 contém várias cópias das mesmas regiões que aparecem como picos acima de um número de cópia do plano de fundo de dois. Gel-seq produz um perfil CNV qualitativamente semelhante como reação de tubo padrão. Acordo entre as duas parcelas pode ser avaliado quantitativamente por regressão linear, conforme mostrado no painel B. Uma correlação de Pearson r = 0,90 indica que dados genomic reunidos a partir de qualquer método são funcionalmente equivalentes.

Figura 5 . Validação de biblioteca. Gel-seq validação para a genômica (A e B) e transcriptomic (C, D e E) dados gerados de PC3 de células Hela. Painel A mostra uma comparação do genoma-largo CNV perfis gerados a partir de PC3 usando Gel-seq (Gel-seq) ou uma reação padrão (tubo). MAPD = mediana absoluta diferença emparelhadas. Painel B é uma regressão linear entre as duas amostras no painel A, com R = 0,90, indicando os dados genomic são funcionalmente equivalentes. Os eixos mostram que o bin normalizado log2 conta. Painéis C e D comparam dados de transcriptomic de células do PC3, com cada ponto, mostrando uma contagem em transcrições por mil por milhão (TPM). Os eixos mostram a comparação entre duas amostras como contagens de transcrição log2 normalizado. Painel C mostra uma comparação de técnicas repetições gerado usando Gel-seq e painel D mostra que uma comparação entre o Gel-seq e tradicional E de painel de RNA-Seq mostra que seq-Gel pode resolver o tipo de célula com base na expressão de RNA, usando uma análise de componentes principais. O eixo x que mostra as primeiras contas de componentes principais para 91,6% da variação entre as amostras, enquanto o eixo y mostra que as contas segunda componente principal apenas 6,5% da variância. Porções desta figura foram reproduzidas de ref. 7 com a permissão da Real Sociedade de química. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Da mesma forma, comparamos transcriptomic dados da nosso Gel-seq protocolo para o protocolo padrão do Smart-Seq no tubo. A Figura 5 mostra a correlação entre ambas as repetições técnicas Gel-seq (Figura 5-C) e entre Gel-seq e o método padrão (Figura 5-D). Cada ponto é uma contagem em transcrições por mil por milhão (TPM) para cada gene detectado no TPM > 5 em ambos os conjuntos de dados. As regressões lineares são mostradas como linhas vermelhas, e o coeficiente de correlação de Pearson é mostrado no canto superior esquerdo. Repetições de técnicas de Gel-seq (∼ R 0.8) de acordo, mas menos bem se correlacionam com o método padrão (R < 0,7). Isto sugere que o Gel-seq introduz um viés na contagem de gene. Felizmente, este preconceito é sistemático e, como pode ser visto na Figura 5Ea análise de componentes principais, conclusões significativas ainda podem ser estabelecidas entre diferentes amostras biológicas.

Discussion

Existem vários passos críticos associados com a fabricação do dispositivo de Gel-seq, bem como o protocolo em si. Durante a fabricação, recomendamos começar com as espessuras de camada prescritos para as diversas regiões do gel. Passamos um tempo significativo teste opções de fabricação diferentes e o protocolo descrito aqui produz os melhores dispositivos para as fitas listadas na tabela de materiais e reagentes. Se pesquisadores usam um sistema alternativo de gaveta, eles podem ser necessário ajustar os volumes usados ao criar os dispositivos. O grande desafio na fabricação é que se a região de gel de alta densidade é muito grande pode delaminate das bordas da fita e criar bolsões de ar no interior da fita que perturbe a electroforese. Lançando várias fitas com vários volumes diferentes camada, pesquisadores devem ser capazes de determinar rapidamente a configuração ideal para o seu hardware específico.

O protocolo de Gel-seq também tem várias etapas críticas que podem ser validadas antes que o protocolo seja concluído. Um possível ponto de falha é a separação do gDNA e híbridos de RNA/cDNA. Isto pode ser validado pelo Gel-seq dispositivo de imagem após a separação (ver Figura 3B). Em um conjunto de experiências, nós achamos que nosso suprimento de laboratório da reserva tinha sido contaminado com DNA e estava causando autoflourescence substancial em nosso dispositivo (consulte a Figura 3D). Isto tornou difícil determinar se a separação teve lugar. Imagem fluorescente nos ajudou a identificar e corrigir este problema antes de usar qualquer reagentes caros para gerar bibliotecas de sequenciamento.

Outro ponto crítico é passo 6.2, o qPCR amplificação do cDNA após a separação. Pesquisadores devem prestar atenção para não overamplify nesta etapa, pois isso reduzirá a qualidade dos dados do RNA-seq. Esta consideração não é exclusiva para Gel-seq, mas é um aspecto comum de preparação de biblioteca do baixo-entrada RNA-seq. Amplificação por PCR durante a preparação da biblioteca de sequenciamento é muitas vezes necessária, mas ele pode introduzir vieses e erros de sequência. O número requerido de ciclos para o PCR depende da complexidade e quantidade de amostra. É geralmente aconselhável limitar o número de ciclo PCR para o mínimo requerido para produzir suficiente de cluster quando as bibliotecas são sequenciadas. Em teoria, um protocolo pode ser otimizado para determinar o número exato do ciclo que produz o número suficiente de cópia sem a introdução de artefatos excessivos. Na prática, entretanto, inconsistências na qualidade da amostra, carregar, ou manipulação cedo no protocolo pode afetar drasticamente a distribuição de modelos moleculares disponíveis para a preparação da biblioteca do PCR, que por sua vez afeta o número ideal de ciclo PCR. Encontrámos a solução mais geral para monitorar o progresso das reações de amplificação utilizando um corante fluorescente, executar as reações em um thermocycler PCR em tempo real e parar as reações na exponencial (lineares versus número de ciclo) fase. Em nossa experiência, monitoramento em tempo real é especialmente relevante quando desenvolver, adaptar ou adoptar um novo protocolo.

A última etapa crítica está gerando genômica e transcriptomic bibliotecas. A chave para esta etapa é definir a concentração inicial da amostra para a reação de preparação de biblioteca de DNA tão perto de 0,2 ng / µ l (total de 0.5 ng) quanto possível. Isto é relativamente simples para o cDNA amplificado de qPCR como normalmente há um excesso de cDNA, mas pode ser mais desafiador para as amostras gDNA. Encontramos uma cuidadosos atenção à etapa vacufuge foi necessária enquanto as amostras foram sendo concentradas. Como esperado, em experimentos com células de 1000, o passo de vacufuge poderia ser parado muito mais cedo do que as experiências com 100 células. O número de amostras no vacufuge também impactou a taxa de evaporação em nossos experimentos. Descobrimos que usando um flourometer para validar o DNA conteúdo a meio da etapa de concentração poderia ser útil ao executar o protocolo com amostras desconhecidas. Felizmente, se pesquisadores sobre concentrado uma amostra, nuclease livre da água pode ser adicionado para diluir a amostra. Teoricamente, é possível usar o vacufuge para secar o DNA e então ele resuspenda o volume desejado; no entanto, sugerimos evitar evaporação completa.

Podemos ver os três métodos atuais para a geração de bibliotecas de DNA e RNA simultâneas, Gel-seq⁷, G & T-seq⁸e DR-seq⁹, como cortesia. Gel-seq é ideal para amostras no intervalo de 100-1000 células e não requer nenhum alvos suspensos ou conhecimento a priori do genoma. Os outros dois métodos são mais adequados para aplicações de célula única. Um dos nossos objetivos no desenvolvimento de Gel-seq era criar um protocolo que pode ser facilmente implementado por outros pesquisadores. Portanto, decidimos fabricar dispositivos dentro do fator de forma padrão de uma fita de gel de poliacrilamida. Enquanto a técnica que usamos para definir nossas diferentes membranas é novela, a maioria dos laboratórios de genética já tem todos os equipamentos necessários para fabricar o dispositivo Gel-seq. Além disso, o custo do dispositivo é trivial - apenas US $5,25 para um dispositivo que pode processar 12 amostras. Dito isto, como com qualquer protocolo de preparação de biblioteca usando reagentes comerciais, o custo total para a geração de bibliotecas continua alto. Nosso custo de reagente por exemplo foi de $50 para a amplificação de todo-transcript e US $28 para preparação de biblioteca para DNA e RNA. Felizmente, o próprio dispositivo de Gel-seq é independente de protocolo. Por exemplo, durante o desenvolvimento com sucesso testamos o dispositivo usando células de cultura e um mais velho RNA biblioteca amplificação protocolo¹⁹, embora não tenhamos encontrado não era adequado para amostras de tecido de ratos. Olhando para o futuro, como alternativas mais baratas para a preparação de biblioteca são desenvolvidas, nosso protocolo pode ser adaptado para trabalhar com essas novas técnicas. Acreditamos que os pesquisadores vão encontrá-lo simples para implementar Gel-seq em seus laboratórios. Esperamos que isto irá facilitar a rápida adoção da tecnologia.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acrylamide Monomer	Sigma Aldrich	A8887-100G
Ammonium Persulfate	Sigma Aldrich	A3678-25G
Ampure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	Referred to in the text as solid phase reversible immobilization (SPRI) beads
DNA Gel Loading Dye (6x)	ThermoFisher Scientific	R0611	Referred to in the text as 6X loading dye
Ethyl alcohol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits	Kapa BioSystems	7959613001	Referred to in the text as 2X qPCR mix
N,N′-Methylenebis(acrylamide)	Sigma Aldrich	146072-100G	Also known as bis-acrylamide
NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referred to in the text as library preparation kit)	Illumina	FC-131-1024	Includes: TD (referred to in the text as transposase buffer), ATM (referred to in the text as transposase), NT (referred to in the text as transposase stop buffer), and NPM (Referred to in the text as library prep PCR mix)
Nuclease Free Water	Millipore	3098
Protease	Qiagen	19155
SMART-Seq v4 Kit (referred to in the text as whole-transcript amplification (WTA) kit)	Takara/Clontech	634888	Includes: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3’ SMART-Seq CDS Primer II A (referred to in the text as RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referred to in the text as first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referred to in the text as template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referred to in the text as reverse transcriptase), and PCR Primer II A (referred to in the text as cDNA PCR primer)
Random hexamer with WTA adapter	IDT	n/a	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G
TEMED	Sigma Aldrich	T9281-25ML
DNA AWAY Surface Decontaminant	ThermoFisher Scientific	7010PK	Referred to in the text as DNA removal product
Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentration)	Sigma Aldrich	T4415-1L
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)	ThermoFisher Scientific	S11494	Referred to in the text as gel stain
Equipment
BD Precisionglide syringe needles, gauge 18	Sigma Aldrich	Z192554	Any equivalent hardware is acceptable
Branson CPX series ultrasonic bath	Sigma Aldrich	Z769363	Any equivalent hardware is acceptable
Empty Gel Cassettes, mini, 1.0 mm	ThermoFisher Scientific	NC2010	Any equivalent hardware is acceptable
Mesh Filter Plate - Corning HTS Transwell 96 well permeable supports - 8.0 µm pore size	Sigma Aldrich	CLS3374	Referred to in the text as 8 um mesh filter plate
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052	Any equivalent hardware is acceptable
Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216	Any equivalent hardware is acceptable
Vacufuge Concentrator	Eppendorf	22822993	Any equivalent hardware is acceptable
XCell SureLock Mini-Cell system	ThermoFisher Scientific	EI0001	Any equivalent hardware is acceptable
Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855195	Any equivalent hardware is acceptable
Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker	GE Healthcare Life Sciences	UVC500-115V	Discontinued, any equivalent hardware is acceptable
Gel Doc XR+ Gel Documentation System	Bio-Rad	1708195	Referred to in the text as gel imager
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	DR89	Referred to in the text as UV transilluminator
Ultrasonic Bath	Bransonic	1207K35	Any equivalent ultrasonic bath is acceptable.