Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב Caenorhabditis elegans

Published: May 2, 2018 doi: 10.3791/57348
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Department of Physics Education, Kongju National University, 2Department of Physics, Harvard University, 3FAS Center for Systems Biology, Harvard University

Summary

במאמר זה נדגים הדמיה חיה של תולעים בודדים העסקת התקן מותאם אישית microfluidic. את ההתקן, תולעים מרובים נכלאים בנפרד כדי להפריד בין תאי, ומאפשר מעקב מרובבת האורך של תהליכים ביולוגיים שונים.

Abstract

בעשור האחרון, microfluidic הוחלו ללמוד חיות קטנות, כולל את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans, וטכניקות הוכיחו שימושי כמו פלטפורמה נוחה הדמיה חיה מתן יכולות לשליטה מדויקת של תנאים ניסיוני בזמן אמת. במאמר זה נדגים הדמיה חיה של תולעים בודדים העסקת WormSpa, מכשיר שפורסמו קודם לכן microfluidic מותאם אישית. את ההתקן, תולעים מרובים נכלאים בנפרד כדי להפריד בין תאי, ומאפשר מעקב מרובבת האורך של תהליכים ביולוגיים שונים. כדי להמחיש את היכולת, אנחנו ביצע ניסויים הוכחה של עקרון בו תולעים נדבקו את ההתקן עם חיידקים פתוגניים, וכל הדינמיקה של ביטוי גנים התגובה החיסונית ביצה הנחת נוטרו באופן רציף של הפרט בעלי חיים. פשוט העיצוב ואופן הפעולה של מכשיר זה הופכים אותו למתאים עבור משתמשים עם לא נסיון עם microfluidic מבוסס ניסויים. אנו מציעים כי גישה זו יהיה שימושי עבור חוקרים רבים מעוניינים תצפיות האורך של תהליכים ביולוגיים בתנאים מוגדרים היטב.

Introduction

השינויים בתנאי הסביבה עלולה להוביל ההפעלה של תוכניות גנטי בליווי אינדוקציה ודיכוי של הביטוי של גנים ספציפיים1,2. שינויים אלה קינטי עשוי להיות משתנה בין הרקמות החיות באותה, בין בעלי חיים שונים. מחקרים של תוכניות כאלה גנטי ולכן קוראים שיטות לאפשר הדמיה האורך של חיות בודדות ומספקים שליטה מדויקת דינמיות של תנאים סביבתיים.

בשנים האחרונות, microfabricated פלואידים שימשו ללמוד היבטים רבים של התגובה וההתנהגות חיות קטנות, כולל תולעים, זבובים, דובוני מים עוד3,4,5,6, 7. יישומים לכלול, לדוגמה, phenotyping עמוק, optogenetic הקלטה של פעילות. עצבית בתגובה לגירויים כימיים, ומעקב אחר של התנהגויות מוטוריות כגון גפיים ו-8,שאיבה9,10 , 11.

גישות Microfluidic להחזיק נכסים רבים יכול להועיל ארוכת טווח אורכי הדמיה של תגובה לאותות סביבתיים, לרבות שליטה מדויקת דינמיות של microenvironment המקומי, עיצוב גמיש המאפשר קיום חיות בודדות רבעים נפרדים, וכן תכונות חיוביות עבור הדמיה. אולם, שמירה על בעלי חיים בתוך תא microfluidic במשך זמן רב עם השפעה שלילית מינימלית על בני שלהם היטב הוא אתגר, המחייב טיפול מסוים בעיצוב של המכשיר microfluidic, כמו גם ביצוע הניסוי.

כאן אנחנו מדגימים את השימוש WormSpa, מכשיר microfluidic עבור הדמיה האורך של Caenorhabditis elegans. 5 תולעים בודדים מרותק צ'יימברס. שוטף נמוכה של השעיה נוזלי ובקטריאליות ערבויות כי תולעים הם מוזן היטב ופעיל מספיק כדי לשמור על בריאות טובה, להקל על הלחץ, המבנה של התאים מאפשר תולעים להטיל ביצים. הפשטות של העיצוב ואופן הפעולה של WormSpa צריך לאפשר חוקרים ללא נסיון ב מיקרופלואידיקה לשלב התקן זה תוכניות מחקר משלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

להלן הפרוטוקול משתמשת WormSpa5, מכשיר microfluidic שתואר קודם לכן עבור הדמיה האורך של תולעים. פבריקציה נוספת של WormSpa (החל עם קבצי CAD שניתן להשיג מן המחברים על פי בקשה) היא פשוטה אך דורש מומחיות כלשהי. ברוב המקרים, פבריקציה נוספת יכול בקלות להיעשות באמצעות מתקן ליבה או באמצעות חברה מסחרית המספק שירותים כאלה. כאשר בדיית המכשיר, הקפד לציין הגובה של התכונות הם 50 מיקרומטר.

1. הגדרת הניסוי

  1. לטעון את המכשיר microfluidic על מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוך עם שלב ממונע.
  2. המקום של תפקודי לב / נשימה קרוב המיקרוסקופ, אך לוודא שהרטט מהמכשיר ניעור אינה משפיעה ישירות המיקרוסקופ. לדוגמה, לשים ניעור על מדף קבוע על הקיר שגורם שום קשר עם השולחן האופטי.
  3. במקום מזרק משאבה על ניעור מסלולית. קלטת את המשאבה על אהבת בשייקר כך זה לא מנענעת תוך טלטול.

2. הכנת הסביבה Microfluidic

הערה: במהלך הניסוי, מזרקים ארבעה מחוברים למכשיר microfluidic דרך צינורות מזרק, כמתואר באיור1. שלב זה מתאר את הכנת מזרקים אלה. אלא אם צוין אחרת, לשמור על הצינורות מזרק קצר ככל האפשר מבלי לבצע אותם מתוח.

  1. להכין מזרק עודפים של צינור מזרק. המזרק (S1 באיור1) מאוחר יותר להיות מחובר לשקע של המכשיר דרך הצינורית מזרק, המשמשים לאחסון זמני של נוזל יוצא המכשיר.
    1. להפוך את המחט מתאם על-ידי הסרת חלקי פלסטיק של קצה המזרק 20 G x 1/2 אינץ ', להשאיר רק את המחט (החלק מתכת). לעשות זאת באמצעות החזקת חלקי פלסטיק, מתכת עם צבת ומושך אותם בנפרד. שאריות פלסטיק הנותרים המחט יכול להיות נשרפו בעזרת מבער בונזן.
    2. לכופף את המחט לפי הצורה הגיאומטרית של ההתקנה ניסיוני תוך החזקת שני הקצוות שלה עם צבת. עיצוב המתוארים כאן, כיפוף המחט במרכזו בזווית של ° ~ 110 הוא הנוח ביותר.
    3. חבר את המחט מתאם בחצי הדרך ברכבת התחתית. החצי השני מאוחר יותר להיות פקוק לתוך המכשיר. הצינור מזרק צריך להיות תואם עם טיפ מזרק 20 גרם ללא דליפה (לדוגמה, אבובים עם הקוטר הפנימי של 0.86 מ מ, הקוטר החיצוני של 1.32 מ מ). אורך צינור המומלץ הוא ~ 50 ס מ.
    4. להתחבר מזרק זכוכית-lock 10 מ"ל (פתוח) בצד השני של הצינור מזרק דרך tip מזרק 20 G x 1/2 אינץ '.
  2. להכין מאגר-כניסת מזרקים, מזרק צינורות. אחד אלה מזרקים (S2 באיור1) משמש מאגר נוזל נכנס לתוך המכשיר, כדי לשלוט בזרימה הזרקה. המזרק אחרים (S3 באיור1) דרוש עבור מאגר exchange, כפי שהוסבר ב 3.2 שלב.
    1. חבר מזרק זכוכית-lock 10 מ"ל (S2) ישירות ל- 3-דרך שסתום וחבר אחר מזרק (S3) לשסתום באותה דרך צינור מזרק (איור 1): להתחבר S3 הצינור דרך tip מזרק, לחבר הצינור לשסתום באמצעות מזרק עצה נוספת.
      הערה: לא משנה הסדר שבו חומרים אלה מחוברים.
    2. חבר צינור מזרק ליציאת הנותרים של השסתום 3-way. להכין עוד מחט מתאם כמו שלב 2.1.2, ולחבר את המחט במחצית הדרך השני (פתוח) של הצינור מזרק.
    3. להגדיר את השסתום כך הצינור מזרק שלב 2.2.2, S2 מחוברים בזמן S3 סגורה (איור 1).
  3. להכין מזרק תולעת-כניסת צינור מזרק. המזרק (S4 באיור1) משמש עבור טעינת תולעים לתוך המכשיר.
    1. חבר צינור ארוך מזרק מזרק זכוכית-lock 10 מ"ל (S4). לקבוע את אורך הצינור הזה מאמצעי האחסון של נוזל ישמש עבור טעינה; לדוגמה, 100 ס מ של אבובים תומך מעל 2 מ ל נוזל (ראה גם שלב 4.2).
    2. להכין עוד מחט מתאם כמו שלב 2.1.2 וחבר אחד חצי של המחט לקצה השני (פתוח) של הצינור מזרק.
  4. לשטוף כל מזרקים, אבובים עם S-בינוני12 פעמיים. למלא את המזרקים, הצינורות S-בינוני, מקפיד להסיר את כל הבועות אוויר.
  5. לחבר את הצינור מזרק עודפים שקע המכשיר.
    1. חברו את המחט מתאם בסוף הצינור מזרק ליציאת ה-outlet.
    2. להזריק נפח קטן של S-בינוני עד ששקע כדי למלא את המכשיר, עד S קטן-בינוני יוצא לים מאגר והן לים תולעת.
  6. להתחבר הצינור מזרק מאגר-כניסת יציאת מאגר-כניסת של המכשיר, תוך חיבור לים-התולעת עם סיכה (סיכת פינים נירוסטה בקוטר 1/32 אינץ).
  7. מזריקים זרם קבוע של מאגר לתוך המכשיר. לטעון את המזרק מאגר-כניסת S2 אל משאבת מזרק13, והגדר את המשאבה כזה כי המדיום ב S2 ברציפות מוזרק לתוך המכשיר בקצב הזרימה של µL 3/min.

3. להעמיס את חיידקים לתוך המכשיר Microfluidic

  1. להכין OP50 Escherichia coli מושעה S-בינוני12.
    1. בעקבות פרוטוקול תקני, לחסן בקבוקון 250 מ ל 50 מ ל LB, שמושבה בודדת, דגירה בין לילה ב 37 º C.
    2. Centrifuge התרבות לילה ב- 4000 סל"ד למשך 10 דקות, resuspend בגדר ב30 מ"ל של S-בינוני.
    3. לסנן את המתלים דרך מסנן מזרק 5 מיקרומטר. למדוד את ריכוז חיידקים על ידי צפיפות אופטית שלה ב 600 nm (OD600), ולהתאים את ריכוז יתר600 של 3. צפיפות גבוהה זו נדרשת כדי לשמור את התולעים מוזן היטב.
  2. חילופי המאגר את ההתקן עם המתלה OP50.
    1. להכין מזרק נקי (S5) מלא את המתלים OP50. . תחזיק את המזרק אנכית, הקש על זה מספר פעמים כדי לאסוף את כל הבועות אוויר בחלק העליון.
    2. סובב את השסתום 3-way מזרקים מאגר-כניסת לסגור את החיבור להתקן, וחבר את שתי מזרקים, S2, S3. ולהיבלע S2 משאבת מזרק.
    3. נתק S2 השסתום וחבר S5 לשסתום. לדחוף את כל האוויר הנאסף בחלק העליון של S5 כדי S3 דרך השסתום עד קצת המאגר OP50 נכנס S3. בעשותו כן, ודא כי אין בועת האוויר נשאר S5 או את השסתום.
    4. להפוך את השסתום אסידו בחזרה למיקום המקורי כדי לסגור את חיבור בין S3 S5 ולהתחבר S5 המכשיר. העומס S5 לתוך למשאבה מזרק. הפעל את תפקודי לב / נשימה שמחזיק את המשאבה. הגדר את מהירות חזק כ 200 סל"ד.
    5. הגדר את קצב הזרימה כדי להיות µL 100/min. הזמן שהדרוש עבור מאגר חדש להגיע תולעים המכשיר תלויה אורך הצינור מזרק מאגר-כניסת (בסביבות 5 דקות עם הצנרת שתוארו לעיל). יכול להיות מועסק קצב זרימה גבוהה יותר אם נדרשת החלפת מאגר מהר יותר.
    6. ברגע המאגר OP50 מתפשטת על כל רחבי המתקן, להגדיר את קצב הזרימה לחזור µL 3/min.

4. להעמיס את התולעים לתוך המכשיר Microfluidic

  1. הכן צינור microcentrifuge קטן קשירה נמוכה (650 µL) ולמלא אותו µL 100 OP50 השעיה. העבר מסביב יאנג מסונכרן בגיל 20-30 תולעים בוגרות (46 שעות לאחר מעצר זחל L1 25 ° c) של צלחת אגר NGM (מדיום הגידול נמטודות) לשפופרת הזו על-ידי בחירת אותם אחד אחד עם תולעת לבחור. גיל-סנכרון יכול להיעשות בעקבות פרוטוקול סטנדרטי12.
  2. למלא את התולעת-הים מזרק, מזרק צינור (S4 באיור1) עם המתלה OP50. להזריק ~ 500 µL של הנוזל לתוך הצינור microcentrifuge עם תולעים. לצייר את הבולם עם תולעים לתוך מזרק תולעת-כניסת הצינור. ודא כי הצינור מזרק מספיק זמן (> 1 מ') מצויירות וורמס להישאר בצינור מזרק והוא לא להפוך כל הדרך אל המזרק S4.
  3. להתחבר S4 לים-התולעת. להזריק את כל התולעים בצינור מזרק תולעת-כניסה לתוך המכשיר microfluidic. נתק S4 ואת הצינור מזרק. חבר את התולעת-הים עם סיכה.
  4. . נתק את המזרק מאגר-כניסת S2 מהמשאבה מכני ( איור 1), לשלוט ידנית S1 ו- S2 לדחוף את כל התולעים לתוך ערוצים נפרדים. הקשה על S2 להעביר תולעים הערוצים, בזמן לחיצה על S1 יזיז אותם בכיוון ההפוך. פעם ערוץ נטען, התולעת בכל אחד מהערוצים יחסום את הכניסה של תולעים אחרים.
  5. תן תולעים להסתגל לסביבה חדשה עבור 2-3 שעות.

5. הגדרת פרוטוקול הדמיה

  1. למצוא את כל התולעים המצויות באופן מאובטח המכשיר וקבע עמדה הדמיה עבור כל אחד מהם בהתמונה רכישת התוכנה המפקחת שלך מיקרוסקופ. שימו לב כי במקרים מסוימים (למשל כאשר הגדלה גבוהה יותר היא הרצויה, או כאשר באמצעות מצלמות עם חיישן CCD קטן יותר) מספר עמדות הדמיה נדרשים לכל ערוץ.
    הערה: אמנם ניתן לבצע זאת באופן ידני, כמה חבילות תוכנה רכישה ניתן לטעון קובץ הטקסט המפרט את העמדות איפה צריך לקחת תמונות. מאז תפקידים אלה מסודרות באופן קבוע ב- WormSpa, משתמש יכול לכתוב סקריפט קטן (למשל, פיתון או תוכנה מסחרית) באופן אוטומטי יוצר רשימה כזו. התבנית המדויקת של קובץ script זה תלוי בתבנית הקובץ צפוי על ידי רכישת התוכנה (ראה למשל 1 חומר משלים).
  2. להגדיר את התדירות הנדרשת הדמיה בצילום מואץ. לדוגמה, נעשית הדמיה של ג'ין המערכת החיסונית בתגובה לזיהום בתדר של 10 דקות לכל מסגרת. ודא כי כל הערוצים הדרושים (למשל בהיר שדה, על ידי קרינה פלואורסצנטית GFP) נרכש בכל נקודת זמן.

6. מארח בתגובה Pseudomonas זיהום

הערה: שלב זה הוא ספציפי ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי. לחלופין, אחד יכולים להכין מאגר המכיל רמזים סביבתיים אחרים עניין (ביוטיים, והאביוטיים לחצים, סמים, איתות מולקולות, וכו ').

  1. להכין PA14 Pseudomonas aeruginosa מושעה SK-בינוני14.
    1. לחסן בקבוקון 250 מ ל 50 מ ל LB, שמושבה בודדת, דגירה בין לילה ב 37 º C.
    2. לחסן את הבקבוק עוד 250 מ עם 50 מ של ליברות, על aliquot של התרבות, דגירה בין לילה ב 37 º C.
    3. Centrifuge התרבות לילה ב- 4000 סל"ד למשך 10 דקות, resuspend בגדר ב 10 מ ל SK-בינוני. למדוד את ריכוז חיידקי ולהתאים את ריכוז יתר600 = 4.
    4. להעביר את המתלים בקבוקון נקי, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות ו- 25 ° c לעוד 24 שעות תוך כדי טלטול. שלב זה מחקה את הצעד צלחת-הדגירה בתקן הורג assay14.
    5. לסנן את המתלים דרך מסנן מזרק 5 מיקרומטר. זה כדי למנוע אגרגטים חיידקי וסותם את המכשיר.
  2. להחליף את הבולם OP50 במכשיר המתלה PA14, באותו ההליך כמו 3.2 שלב. לשמור על הדמיה במשך 10 שעות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

גיל-מסונכרנות צעיר תולעים בוגרות (46 שעות פוסט L1 מעצר זחל 25 ° c)12 היו הכניסו את המכשיר, כמפורט בפרוטוקול. . התולעים היו בנפרד ממוקם ערוצים נפרדים, המאפשרים מדידה האורך של התגובה של בעלי החיים לגורם המחלה. כאשר הניסוי המוצלח, מרבית התולעים נשארים ערוצי שלהם משך זמן הניסוי. במקרה זה, תמונות של תולעים בודדים נלקחים פשוט על-ידי הצבת את הערוץ שלהם בדרך הדמיה, ולהימנע מהצורך לאתר באופן פעיל את החיה. איור 2 A מציג את התמונות בהיר-שדה של תולעת נציג יחיד במשך 10 שעות במכשיר. בעוד תולעים כלואות ערוצי שלהם, הם יכולים להעביר למעלה - ויוצאת, בחופשיות יכול להפוך את ראשיהם. זה חיוני כדי להבטיח כי ההתקן עצמו לא לגרום ללחץ או לפגוע החיות.

אנחנו פיקוח התגובה של תולעים זיהום חיידקי על ידי פ aeruginosa, אחד של פתוגנים חיידקיים למד ביותר של C. elegans. . זה גם פתוגניות הזדמנותית, אשר גורם זיהום ב סיסטיק פיברוזיס ומטופלים immunocompromised... האכלה תולעים עם זנים מסוימים של aeruginosa פ, כגון PA14, מוביל זיהום מעיים קטלני, לבודד קליני הגורמים התקפה אלימה מעורב בתהליך זה הם גם מעורבים הזיהום של המארחים יונקים. 14 , 15

כדי לבחון את הדפוס של שינויים בביטוי הגנים במהלך זיהום חיידקי, כתבים פלורסנט יכול להיות מועסק. בין גנים רבים המציגים תגובה דינמית לזיהום, אנחנו במעקב התגובה תעתיק של irg-1 (זיהום התגובה ג'ין 1), על ידי הדמיה קרינה פלואורסצנטית GFP מן התולעים הטרנסגניים לבטא irg-1::GFP (AU0133 [agIs17 ( pirg-1::GFP; pmyo-2::mCherry)], שהושג מהמעבדה Ausubel). irg-1 ידוע להיות חריפה המושרה במעי של בעלי חיים נגועים בשלב מוקדם של זיהום על ידי aeruginosa פ PA14. 16 , 17 איור 2 B מציג זמן לשגות תמונות של תולעת נציג (אותה חיה כמו איור 2א). כל תמונה פלורסצנטיות נלקח מיד לאחר התמונה בהיר-השדה המתאים. בהזיהום הראשון פוסט 5 שעות, זריחה GFP מגדילה רק במתינות ב אמצע הגוף והזנב. לאחר מכן, עלייה משמעותית קרינה פלואורסצנטית הוא ציין, החל מאמצע הגוף. קרינה פלואורסצנטית הכולל של כל תולעת מותווים איור 2C כפונקציה של הזמן שלאחר זיהום. נתונים אלה ממחישים את תנאי הגיוס שתואר קודם לכן irg-1 על זיהום PA14 אלא גם מידת ההשתנות תולעת לתולעת ב העיתוי וההיקף של אינדוקציה.

העיצוב של המכשיר microfluidic WormSpa כולל מסננים לאסוף את הביצים על-ידי כל תולעת5. ברגע בוקעות, הזחלים L1 נשטפים דרך המסנן, לתוך הצינור לשקע. זה אפשר לנו לעקוב באופן ידני את כנס קינטיקה של תולעים בודדים במהלך זיהום חיידקי. זמן לשגות תמונות של הביצים שמטילים את התולעת זהה כמו באיור 2 מוצגים באיור 3א. התמונות האלו צולמו נכון אחרי התמונות בהיר-שדה המתאים באיור 2א. המספר המצטבר של ביצים על-ידי כל תולעת מוצג כפונקציה של הזמן זיהום פוסט איור 3B, ממוצע, סטיית תקן על כלל האוכלוסייה מוצגות באיור איור 3ג'. נתונים אלה ללכוד ההשתנות בעלי חיים-אל-חיה, כמו גם הירידה שתואר קודם לכן להטלת ביצים התקדמות הזיהום. לעומת זאת, אצל בעלי חיים נגוע שיעור להטלת ביצים לא תפחת עד שהוא מגיע לשיאו בשעות ~ 54 פוסט L1 בגיל 25 ° C5,18.

Figure 1
איור 1: ערכת ניסיוני של הדמיה חיה של תולעים במכשיר microfluidic. תולעים מוטענים לתוך המכשיר דרך כניסת תולעתולאחר מכן יידחפו לתוך ערוצים נפרדים. ההשעיה חיידקי מוזרק לתוך המכשיר של כניסת מאגר על ידי משאבה מכנית רכוב על תפקודי לב / נשימה. המאגר יוצא דרך שקע הנמל של המכשיר. מזרקים ארבע (S1, S2/S5, S3 ו- S4) משמשים להפעלת המכשיר. קווים מקווקווים אדום הם מזרק צינורות חיבור מזרקים ואת ההתקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: קינטיקה ביטוי גנים נציג. זמן לשגות תמונות של תולעת נציג נלקח על ידי מיקרוסקופ פלורסצנטיות GFP שדה בהיר (א) ו- (ב) . הדימויים הימנית צולמו לפני המחלה הוצג, ואילו התמונות הימניות צולמו 10 שעות פוסט זיהום על ידי PA14. מרווח הזמן בין התמונות הוא שעה. (ג) מסלול הזמן הכולל irg-1:: זריחה GFP ב- worms בודדים. כל שורה מקבילה חיים בודד. שורות היו מיון בסדר יורד של זריחה מרושע. עוצמת קרינה פלואורסצנטית מקודדות לפי צבעים, קנה המידה של צבע מוצגת בצד הימין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: נציג קינטיקה להטלת ביצים. (א) זמן לשגות תמונות של מספר ביצים שמטילים את התולעת זהה שמוצג באיור 2A ו- B. הדימויים הימנית צולמו לפני המחלה הוצג, ואילו התמונות הימניות צולמו 10 שעות פוסט זיהום על ידי PA14. מרווח הזמן בין התמונות הוא שעה. (B) מסלול הזמן של מספר מצטבר של ביצי תולעים בודדים. כל שורה מקבילה חיים בודד. שורות היו מיון יורד של המספר הכולל של ביצים זיון לכל תולעת. מספר הביצים מקודדות לפי צבעים, קנה המידה של צבע מוצגת בצד הימין. (ג) המספר הממוצע של ביצים הניח לכל תולעת כפונקציה של הזמן. האזור האפור מציין ± סטיית תקן אחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Supplementary Material 1
1 חומר משלים: קובץ script לדוגמה אשר יוצר קובץ טקסט המכיל את העמדות הדמיה עבור כל הערוצים במכשיר WormSpa. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Microfluidic כלים מספקים יתרונות רבים בלימוד תולעים. התקן דימות in PDMS מציע איכות הדמיה גבוהה יותר לעומת צלחת אגר NGM סטנדרטי. ניתן לקחת תמונות מרובות של תולעת יחיד, לעומת שיטות מסורתיות שבו בעלי חיים הרים מהצלחת והוקמה בשקופית מיקרוסקופ עבור הדמיה. בנוסף, ניתן לשמור את microenvironment שבו שוכנים תולעים קבוע או מאופנן לפי הצורך, המתיר מדויק מיפוי בין ההרכב של הסביבה ואת התגובה של בעלי החיים.

כאן להדגים כיצד לבצע מדידה האורך של התגובה לארח זיהום חיידקי על ידי הדמיה התגובה של תולעים בודדים מרובים לגורם המחלה הזדמנותית aeruginosa פ PA14 באמצעות התקן מותאם אישית microfluidic (WormSpa). שדה בהיר וגם קרינה פלואורסצנטית התמונות צולמו ב מספר פעמים ללא perturbing הניסוי מתמשך. בפרט, קינטיקה של הטלת ביצים, בביטוי הגן irg-1 היו ובחן כל 10 דקות, עלייה משמעותית ברזולוציה הטמפורלית מעל שיטות מסורתיות14,15.

במכשיר הזה, מידות האורך של תולעים מרובים יכול להתבצע על ידי המחודשת המיקום השמור של כל תולעת בכל זמן נתון. זה הודגם ב 2 דמויותC ו- 3B, איפה אנחנו לכמת את irg-1:: GFP פלורסצנטיות וביצים שמטילים תולעים בודדים. הנתונים האלה מראים כי תולעים להציג מגוון רחב של פרופילים קינטי. כפי שמוצג בעבר מחקרים תא בודד19,20,21, ושכלי יכול לשמש כדי להבין את העיצוב של מעגלים גנטית, כמו גם המתאם בין מסלולים ברורים19, 22.

לניסויים מוצלחת, חיוני כדי לטעון תולעים לתוך המכשיר microfluidic במהירות. בעוד תולעים לזחול על השטח אגר, הם נוטים ת'ראש בסביבה נוזלית ומשרה התנהגות זו תוכנית גנטית שבה המגבר מופעל חלבונים kinases הם מעורבים23,24. כדי לצמצם את ההפרעות לא רצוי, חשוב למקם את התולעים לחדריהם נפרד במהירות, כמו מזערים החדר, את החדירות אוויר של PDMS לספק תולעים עם סביבה המחקה משטח מוצק. 5 למרות הפעלת לחץ גבוה עוזר תולעים טעינה מהר יותר, מתאים לחץ המכשיר מדי עשויה לגרום ללחץ מכני על התולעים. תולעים קשות לחוצה לעשות לא להאכיל או להטיל ביצים, וכתוצאה מכך פנוטיפ שאלסי בבירור הנצפה25. לאחר הטעינה, תולעים אכלו e. coli OP50 במשך 2-3 שעות, המאפשר את התולעים להתאים לסביבה microfluidic ומספקת החוקר הזדמנות להתבונן החיות ולמחוק את אלה שניזוקו.

גודל ואת הריווח של מזערים בכל אחד הממוטבות התולעים גדלו 46 שעות ממעצרו L1 ב 25 º C. המבנים עשוי להיות מדרגיים ללמוד תולעים מבוגר או מופחתת לבחון את הזחלים L4 קטנים בגודלם. עם זאת, תולעים אינם מסוגלים בהצלחה הנשירה בבית הבליעה, מסלק חקר התפתחות פוסט במכשיר הזה. עבור יישומים כאלה, שיטות כמו WorMotel26 עשויים להיחשב. מאז תולעים מוגבל אך לא מרותק למיטה בטיפול WormSpa, עמיד ניסוי יירוט מוצלח תלוי אם החיות להישאר בבית הבליעה. אנו מוצאים כי זה יכול להיות מאתגר עבור הזחלים בשלב מוקדם, למבוגרים זכר ועבור כמה מוטציות דו-מיניים.

במקום להשתמש עם כניסת מאגר יחיד (במרכז העליון, איור 1), פתחי הכניסה שני בצורת בלון הפוך יכול לשמש בו זמנית. ממלא את שני מזרקים עם מאגרים שונים, אחד ליצור סביבות חנותם מובנים על ידי לחיצה על מזרקים שונים בזמן שונה. זה, לדוגמה, מאפשר לימוד של הסתגלות לשינוי הסביבה. 27 , 28

כפי שהוזכר לעיל, המכשיר microfluidic המתוארים כאן יכול לשמש למגוון רחב של יישומים אחרים. אלה כוללים לימוד התגובות רמזים סביבתיים אחרים. תגובות כאלה עשויים לכלול שינויים ביטוי גנים, כנס התנהגויות, כפי שהודגם כאן, אבל גם לשינויים הצטברות שומן ומטבוליזם (למשל באמצעות שמן מכתים מאת Red הנילוס), פיזיולוגיה עצביים והאיתות (למשל על ידי סידן הדמיה ו- optogenetic לפליטת), שינויים בהתנהגויות מוטוריים כגון שאיבה, עשיית צרכים, ראש התנועה (באמצעות הדמיה כמותיים אוטומטיות של רצפי זמן לשגות) ועוד.

בסופו של דבר, גישה זו היא במידה רבה אוטומטית ומפחית את העבודה הנדרש לניסויים ארוך במשך שעות רבות, אפילו ימים. ברגע המיקומים של תולעים בודדים נשמרים נתונים רכישת התוכנה, הניסוי מורכב הקלטה אוטומטית של תמונות בזמן הבקר משאבה מכנית שומרת על שטף קבוע של מאגר לתוך המכשיר. חשוב, ייצור של מכשיר WormSpa אינה דורשת בכל פרוטוקול ליתוגרפיה רך יותר סטנדרטי, עיצוב ותפעול שלה הם מספיק פשוט אפילו לחוקרים ללא ניסיון קודם מיקרופלואידיקה. עם יתרונות שנדונו לעיל, הכנה פשוטה יחסית שלבים שונים, גישה זו יכולה להיות מועיל לאלה השוקלים מדידת האורך של תולעים חיות בתנאים מבוקרים בדיוק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע באמצעות מענקים PHY-1205494 ו- MCB-1413134 (EL) ועל ידי 2017R1D1A1B03035671 המענק של קרן המחקר הלאומי של קוריאה (KSL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
WormSpa N/A N/A The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab.
Compound Microscope Zeiss AxioObserver Z1 An inverted fluorescence microscope with a motorized stage
Syringe Pump New Era Pump Systems NE-501
Tubing SCI Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/5 0.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D
Syringe Tip CMLsupply 901-20-050 20 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula
Syringe Filter PALL 4650 Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane
Syringe Qosina C3307 10 mL Male Luer Lock Syringe
3 Way Valve ColeParmer FF-30600-23 Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile
Dowel Pin McMaster-Carr 90145A317 18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.)
Low Binding Microcentrifuge Tube Corning CL S3206 0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation. Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).
  2. de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
  3. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology. Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).
  4. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , (2013).
  5. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  6. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
  7. Grisi, M., et al. NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes. Sci Rep. 7, 44670 (2017).
  8. Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms. Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).
  9. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).
  10. Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. HandKAchip - Hands-free killing assay on a chip. Sci Rep. 6, 35862 (2016).
  11. Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nat Commun. 8, 14221 (2017).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  13. NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps. , New Era Pump Systems Inc. (2017).
  14. Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).
  15. Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  16. Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. 2 (11), 183 (2006).
  17. Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).
  18. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction. Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).
  19. Chalancon, G., et al. Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture. Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).
  20. Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J. Regulation of noise in gene expression. Annu Rev Biophys. 42, 469-491 (2013).
  21. Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes. Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).
  22. Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling. Science. 301 (5629), 102-105 (2003).
  23. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
  24. Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 8 (3), 58345 (2013).
  25. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , (1997).
  26. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  27. Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans. J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).
  28. Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 135 C. elegans מיקרופלואידיקה מדידת האורך בקרה סביבתית התגובה החיסונית הנחת הביצה
פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, K. S., Levine, E. A… More

Lee, K. S., Levine, E. A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (135), e57348, doi:10.3791/57348 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter