Summary
Neste artigo, vamos mostrar imagens ao vivo de vermes individuais empregando um dispositivo microfluidic personalizado. No dispositivo, vários vermes limitam-se individualmente para separar câmaras, permitindo multiplexada vigilância longitudinal de vários processos biológicos.
Abstract
Na última década, microfluidic técnicas foram aplicadas para estudar pequenos animais, incluindo o nematódeo Caenorhabditis elegans, em provaram útil como uma plataforma de imagem ao vivo conveniente, fornecendo recursos para o controle preciso de condições experimentais em tempo real. Neste artigo, vamos mostrar imagens ao vivo de vermes individuais, empregando o WormSpa, um dispositivo microfluidic personalizado anteriormente publicada. No dispositivo, vários vermes limitam-se individualmente para separar câmaras, permitindo multiplexada vigilância longitudinal de vários processos biológicos. Para ilustrar o recurso, realizamos experimentos de prova de princípio em que minhocas foram infectadas no dispositivo com bactérias patogênicas e a dinâmica da expressão de genes de resposta imune e postura de ovos foram monitorada continuamente no indivíduo animais. O design simples e operação deste dispositivo torná-lo adequado para usuários sem experiência anterior com experimentos microfluidic-baseado. Propomos que esta abordagem será útil para muitos pesquisadores interessados nas observações longitudinais de processos biológicos, sob condições bem definidas.
Introduction
Mudanças nas condições ambientais podem levar a ativação de programas genéticos, acompanhado por indução e repressão da expressão de genes específicos1,2. Essas alterações cinéticas podem ser variável entre tecidos nos mesmos animais e entre animais diferentes. Estudos de tais programas genéticos, portanto, chamar para métodos que permitem a imagem longitudinal de animais individuais e fornecem controle dinâmico preciso das condições ambientais.
Nos últimos anos, microfabricated fluídico dispositivos têm sido usados para estudar muitos aspectos da resposta e comportamento em pequenos animais, incluindo vermes, moscas, água ursos e mais3,4,5,6, 7. As aplicações incluem, por exemplo, fenotipagem profunda, optogenetic gravação de atividade neuronal em resposta a estímulos químicos e monitoramento de comportamentos motor, tais como locomoção e bombeamento8,9,10 , 11.
Abordagens baseadas em microfluidic segurar muitas propriedades que poderiam beneficiar a longo prazo de imagem longitudinal da resposta a sinais ambientais, incluindo controle dinâmico preciso do microambiente local, design flexível que permite a manutenção de cada animal em quartos separados e atributos favoráveis para a imagem latente. No entanto, manter animais em uma câmara de microfluidic por um longo tempo com o mínimo impacto adverso sobre seus seres bem é um desafio que requer uma atenção especial no projeto do dispositivo microfluidic, bem como na execução do experimento.
Aqui vamos mostrar o uso de WormSpa, um dispositivo microfluidic para imagem longitudinal de Caenorhabditis elegans. 5 vermes individuais estão confinados em câmaras. Um baixo fluxo constante de suspensão bacteriana e líquido garante que vermes são bem alimentados e suficientemente ativo para manter a boa saúde e aliviar o estresse, e a estrutura das câmaras permite vermes para pôr ovos. A simplicidade do projeto e operação de WormSpa devem permitir que os investigadores com nenhuma experiência anterior em microfluídica para incorporar este dispositivo em seus próprios planos de pesquisa.
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Protocol
O protocolo abaixo usa WormSpa5, um dispositivo microfluidic descritas anteriormente para a imagem latente longitudinal de vermes. Fabricação de WormSpa (começando com arquivos de CAD que podem ser obtidos os autores mediante solicitação) é simples, mas requer alguma experiência. Na maioria dos casos, fabricação pode prontamente ser feita por uma instalação de núcleo ou por uma empresa comercial que fornece esses serviços. Quando o dispositivo de fabricação, certifique-se de especificar que a altura das características 50 µm.
1. experimental Setup
- Monte o dispositivo microfluidic em um microscópio de fluorescência invertido com um palco motorizado.
- Coloque um agitador orbital perto do microscópio, mas certifique-se que a vibração do agitador não afeta diretamente o microscópio. Por exemplo, colocar o agitador em uma prateleira fixada em uma parede que faz sem contato com a tabela de óptica.
- Coloca uma bomba de seringa no agitador orbital. Fita da bomba para o agitador para que ele não jiggle agitando.
2. preparação do ambiente microfluídicos
Nota: Durante o experimento, quatro seringas estão ligadas ao dispositivo microfluidic através de tubos de seringa, conforme descrito na Figura 1. Este passo descreve a preparação destas seringas. A não ser mencionado, caso contrário, manter os tubos de seringa tão curtos quanto possível sem torná-los tenso.
- Prepare uma seringa de saída e um tubo de seringa. Esta seringa (S1 na Figura 1) será mais tarde conectados à tomada do dispositivo através do tubo de seringa e usado para armazenamento temporário de líquido saindo do dispositivo.
- Fazer uma agulha de adaptador, removendo as peças de plástico de uma ponta de seringa de 20 x 1/2 polegada, mantendo apenas a agulha (parte metálica). Fazê-lo, mantendo as peças de plástico e de metal com um alicate e separá-los. Resíduo plástico restante na agulha pode ser queimado com um bico de Bunsen.
- Dobre a agulha de acordo com a geometria da instalação experimental, mantendo suas duas extremidades com um alicate. No projeto descrito aqui, dobrar a agulha em seu meio para um ângulo de ~ 110° é mais conveniente.
- Conecte a agulha do adaptador a meio caminho do tubo. A outra metade será mais tarde conectada no dispositivo. O tubo da seringa deve ser compatível com uma ponta de seringa de 20 G sem um vazamento (por exemplo, um tubo com diâmetro interno de 0,86 mm e diâmetro externo de 1,32 mm). O comprimento do tubo recomendado é ~ 50 cm.
- Conecte uma seringa luer-lock de 10 mL para a outra extremidade (aberta) do tubo seringa através de uma ponta de seringa de 20 x 1/2 polegada.
- Preparar amortecedor-entrada seringas e tubos de seringa. Dentre essas seringas (S2 na Figura 1) é usado como um reservatório para o líquido que entra no aparelho e para controlar o fluxo de injeção. A outra seringa (S3 na Figura 1) é necessária para troca de amortecedor, conforme explicado no passo 3.2.
- Conectar uma seringa de 10ml luer-lock (S2) diretamente a uma válvula de 3 vias e conectar outra seringa (S3) para a mesma válvula através de um tubo de seringa (Figura 1): S3 conectar-se ao tubo através de uma ponta de seringa e ligar o tubo para a válvula através de uma outra ponta de seringa.
Nota: Não importa a ordem em que esses materiais estão conectados. - Conecte um tubo de seringa à porta restante da válvula de 3 vias. Prepare outra agulha adaptador como na etapa 2.1.2 e conecte a outra extremidade (aberta) do tubo seringa a agulha na metade do caminho.
- Conjunto da válvula, tal que o tubo de seringa na etapa 2.2.2 e S2 estão ligados enquanto S3 é fechado (Figura 1).
- Conectar uma seringa de 10ml luer-lock (S2) diretamente a uma válvula de 3 vias e conectar outra seringa (S3) para a mesma válvula através de um tubo de seringa (Figura 1): S3 conectar-se ao tubo através de uma ponta de seringa e ligar o tubo para a válvula através de uma outra ponta de seringa.
- Prepare uma seringa de worm-entrada e um tubo de seringa. Esta seringa (S4 na Figura 1) é usado para carregar vermes no dispositivo.
- Conecte um tubo de seringa longa uma seringa de 10ml luer-lock (S4). Determinar o comprimento deste tubo do volume do fluido que será usado para o carregamento; por exemplo, 100 cm de tubo suporta mais de 2 mL de líquido (consulte também o passo 4.2).
- Prepare outra agulha adaptador como na etapa 2.1.2 e ligar um meia da agulha para a outra extremidade (aberta) do tubo seringa.
- Lave todas as seringas e tubos com S-médio12 duas vezes. Encha as seringas e os tubos com S-meio, tendo o cuidado de remover todas as bolhas de ar.
- Conecte o tubo de saída da seringa à saída do dispositivo.
- Conecte a agulha do adaptador na extremidade do tubo seringa à porta de saída.
- Injete um pequeno volume de S médio através da saída para encher o dispositivo, até um pouco S médio saia tanto a entrada da reserva e a entrada de verme.
- Conecte o tubo de seringa de tampão-entrada à porta de entrada de buffer do dispositivo, enquanto obstruindo a entrada de verme com um pino (pino de passador de aço inoxidável com um diâmetro de 1/32 de polegada).
- Injete um fluxo constante de buffer do dispositivo. Carregar a seringa de tampão-entrada S2 para uma bomba de seringa13e conjunto da bomba tal que a média em S2 é injectada continuamente o dispositivo com um caudal de 3 µ l/min.
3. carregar as bactérias para o dispositivo Microfluidic
- Prepare-se Escherichia coli OP50 suspendido em S-médio12.
- Na sequência de um protocolo padrão, inocular um balão de 250 mL com 50 mL de LB e uma única colônia e incubar durante uma noite a 37 ° C.
- Centrifugar a cultura durante a noite a 4000 rpm por 10 minutos e resuspenda o pellet em 30 mL de meio-de-S.
- Filtre a suspensão através de um filtro de seringa de 5 µm. Medir a concentração bacteriana por sua densidade óptica em 600 nm (OD600) e ajustar a concentração de uma OD600 de 3. Esta alta densidade é necessária para manter os vermes bem alimentados.
- Troca o buffer no dispositivo com a suspensão de OP50.
- Prepare uma seringa limpa (S5) preenchida com a suspensão de OP50. Segurar a seringa verticalmente e bata-o várias vezes para recolher todas as bolhas de ar no topo.
- Gire a válvula de 3 vias de seringas de tampão-entrada para fechar a conexão para o dispositivo e conecte as duas seringas, S2 e S3. Desengate o S2 da bomba de seringa.
- Desconecte a válvula-S2 e S5 se conectem a válvula. Expulsar todo o ar coletado no topo da S5 S3 através da válvula até um pouco de buffer OP50 entra S3. Ao fazer isso, certifique-se de que nenhuma bolha de ar permanece em S5 ou a válvula.
- Gire a válvula de 3 vias para a posição original para fechar a conexão entre S3 e S5 e conectar o dispositivo a S5. S5 de carga sobre a bomba de seringa. Ligue o agitador orbital que prende a bomba. Defina a velocidade de agitação para cerca de 200 rpm.
- Defina a taxa de fluxo ser 100 µ l/min. O tempo que leva para o novo buffer chegar para os vermes no dispositivo depende do comprimento do tubo seringa reserva-entrada (cerca de 5 minutos com a tubagem descrito acima). Uma maior taxa de fluxo pode ser empregada se uma troca de amortecedor mais rápida é necessária.
- Uma vez que o buffer OP50 se espalha por todo o dispositivo, defina a taxa de fluxo para 3 µ l/min.
4. carregar vermes no dispositivo Microfluidic
- Prepare um pequena ligação baixa microcentrifuga tubo (650 µ l) e preenchê-lo com 100 µ l de suspensão de OP50. Transferência em torno de 20-30 jovens de idade-sincronizado pegar germes adultos (46 horas após a detenção larval de L1 a 25 ° C) de uma placa de ágar NGM (meio de crescimento nemátodes) ao tubo por pegá-los um por um com um verme. Idade-sincronização pode ser feito na sequência de um protocolo padrão12.
- Preencher o worm-entrada da seringa e seringa do tubo (S4 na Figura 1) com a suspensão de OP50. Injete ~ 500 µ l do fluido dentro do tubo de microcentrifugadora com vermes. Desenhe a suspensão com vermes no tubo de seringa de worm-entrada. Certifique-se que o tubo da seringa é longa o suficiente (> 1 m) e que vermes desenhadas fiquem no tubo de seringa e não fazem todo o caminho até a seringa S4.
- Conecte o S4-entrada do worm. Injete o dispositivo microfluidic todos os vermes no tubo de seringa de worm-entrada. Desconecte o S4 e o tubo de seringa. Conecte a entrada de verme com um alfinete.
- Desencaixe a seringa de tampão-entrada S2 da bomba mecânica ( Figura 1) e controlar manualmente S1 e S2 para empurrar todos os vermes em canais separados. Pressionar S2 moverá vermes os canais, enquanto pressionar S1 irá movê-los na direção inversa. Uma vez que um canal é carregado, o verme em cada canal irá bloquear a entrada de outros worms.
- Deixe vermes ajustar ao novo ambiente, por 2-3 horas.
5. criação de um protocolo de imagem
- Encontrar todos os vermes que localizam-se firmemente no dispositivo e definir uma posição de imagem para cada um no software de aquisição de imagem que controla seu microscópio. Observe que em alguns casos (por exemplo, quando se deseja uma ampliação maior, ou quando utilizar câmeras com um sensor CCD menor) múltiplas posições de imagem são necessárias para cada canal.
Nota: Enquanto isso pode ser feito manualmente, alguns pacotes de software de aquisição podem carregar um arquivo de texto que lista as posições onde as imagens devem ser tomadas. Desde que estas posições são ordenadas regularmente em WormSpa, um usuário pode escrever um pequeno script que cria automaticamente uma lista desse tipo (por exemplo, em Python ou software comercial). O formato preciso desse script depende do formato de arquivo esperado pelo software de aquisição (veja um exemplo no Material complementar 1). - Defina a frequência necessária da imagem latente de lapso de tempo. Por exemplo, imagem latente da resposta de gene imune à infecção é feito com uma frequência de 10 minutos por quadro. Certifique-se de que todos os canais necessários (por exemplo, brilhante-campo e a fluorescência de GFP) são adquiridos em cada ponto de tempo.
6. host resposta à infecção de Pseudomonas
Nota: Este passo é específico para estudar interações patógeno-hospedeiro. Alternativamente, um pode preparar um buffer que contém outras pistas ambientais de interesse (estresses bióticos e abióticos, drogas, sinalização moléculas, etc.).
- Prepare-se Pseudomonas aeruginosa PA14 suspendido no SK-médio14.
- Inocular um balão de 250 mL com 50 mL de LB e uma única colônia e incubar durante uma noite a 37 ° C.
- Inocular o outro balão de 250 mL com 50 mL de LB e uma alíquota da cultura e incubar durante uma noite a 37 ° C.
- Centrifugar a cultura durante a noite a 4000 rpm por 10 minutos e resuspenda o pellet em 10 mL de SK-médio. Medir a concentração bacteriana e ajustar a concentração de OD600 = 4.
- A suspensão de transferência para um balão limpo e incubar a 37 ° C por 24 horas e a 25 ° C, durante 24 horas e agitando. Esta etapa imita a etapa de incubação-placa na norma de ensaio14a matar.
- Filtre a suspensão através de um filtro de seringa de 5 µm. Isso é para evitar agregados bacterianos de obstruir o dispositivo.
- Substitua a suspensão PA14, seguindo o mesmo procedimento como no passo 3.2 a suspensão OP50 no dispositivo. Manter a imagem por 10 horas.
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Representative Results
Idade-sincronizado em vermes de adultos jovens (46 horas pós prisão larval de L1 a 25 ° C)12 foram carregados no dispositivo, conforme descrito no protocolo. Individualmente, os vermes estavam localizados em canais separados, permitindo a medição longitudinal da resposta dos animais ao patógeno. Quando a experiência for bem sucedida, a maioria dos vermes permanecem em seus canais para a duração do experimento. Neste caso, imagens de worms individuais são tomadas simplesmente colocando seu canal no caminho da imagem latente, evitando a necessidade de localizar ativamente o animal. Figura 2 A mostra as imagens do brilhante-campo de um único representante verme ao longo de 10 horas no dispositivo. Enquanto os vermes estão confinados dentro de seus canais, eles podem se mover acima - e a jusante e livremente pode virar a cabeça. Isto é fundamental para garantir que o dispositivo em si não causar estresse ou prejudicar os animais.
Temos monitorado resposta de vermes a infecção bacteriana por p. aeruginosa, um dos mais bem estudados patógenos bacterianos de c. elegans. Também é um patógeno humano oportunista, que provoca a infecção em pacientes imunocomprometidos e fibrose cística. Alimentando vermes com particulares cepas de p. aeruginosa, tais como o clínico isolar PA14, leva a letal infecção intestinal, e os fatores de virulência envolvidos neste processo também são implicados na infecção de hospedeiros mamíferos. 14 , 15
Para examinar o padrão de alterações na expressão gênica durante a infecção bacteriana, repórteres fluorescentes podem ser empregados. Entre muitos genes que exibem resposta dinâmica à infecção, nós acompanhada a resposta transcricional de irg-1 (gene de resposta de infecção 1), imagem latente da fluorescência de GFP de vermes transgênicos expressando irg-1::GFP (AU0133 [agIs17 ( PIRG-1::GFP; pmyo-2::mCherry)], obtidos a partir do laboratório de Ausubel). IRG-1 é conhecida por ser fortemente induzida no intestino dos animais infectados na fase inicial da infecção por p. aeruginosa PA14. 16 , 17 Figura 2 B mostra imagens de lapso de tempo de um verme representativo (o mesmo animal como na Figura 2). Cada imagem de fluorescência foi tirada imediatamente após a imagem brilhante-campo correspondente. Na primeira infecção post 5 horas, fluorescência de GFP aumenta apenas ligeiramente em meados corpo e a cauda. Então, um substancial aumento na fluorescência é observado, a partir do corpo médio. A fluorescência total em cada worm é plotada na Figura 2C em função da infecção de post do tempo. Estes dados ilustram não só a indução descritas anteriormente do irg-1 mediante PA14 infecção, mas também a variabilidade de verme-de-verme no tempo e a extensão da indução.
O design do dispositivo microfluidic WormSpa inclui filtros que coletam os ovos postos por cada verme individual5. Uma vez que os ovos eclodem, as larvas L1 são lavadas através do filtro e o tubo de saída. Isso nos permitiu acompanhar manualmente a cinética de postura de vermes individuais durante a infecção bacteriana. As imagens de lapso de tempo dos ovos postos pelo worm mesmo como ilustrado na Figura 2 são mostradas na Figura 3. Estas imagens foram tiradas logo após as imagens brilhantes-campo correspondentes na Figura 2. O número cumulativo de ovos postos por cada worm é mostrado como uma função da infecção de post tempo em Figura 3B, e a média e o desvio-padrão ao longo de toda a população são mostrados na Figura 3C. Estes dados capturam a variabilidade de animal para animal, bem como o declínio descritas anteriormente na postura como progride de infecção. Em contraste, em animais não infectados não declinar a taxa de oviposição até picos a ~ 54 horas pós L1 em 25 ° C5,18.
Figura 1: regime Experimental de imagens ao vivo de vermes em um dispositivo microfluidic. Worms são carregados para o dispositivo através da entrada de worme posteriormente são empurrados em canais separados. Suspensão bacteriana de dispositivo a partir da entrada da reserva é injetado por uma bomba mecânica, montada em um agitador orbital. O buffer é encerrado através da abertura de saída do dispositivo. Quatro seringas (S1, S2/S5, S3 e S4) são usadas para operar o dispositivo. As linhas tracejadas vermelhas são tubos de seringa seringas e o dispositivo de ligação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: cinética de expressão de gene representante. Imagens de lapso de tempo de um verme representativa tomadas pelo (A) Bright-campo e (B) microscopia de fluorescência de GFP. As imagens mais à esquerda foram tiradas pouco antes do patógeno foi introduzido, Considerando que as imagens mais à direita foram tiradas 10 horas pós infecção por PA14. O intervalo de tempo entre as imagens é 1 hora. (C) o curso de tempo de total irg-1:: fluorescência de GFP em worms individuais. Cada linha corresponde a um único animal. Linhas foram classificadas em ordem decrescente de média fluorescência. Intensidade da fluorescência é codificados por cores e a escala de cores é mostrada à direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Representante cinética de postura. (A) tempo imagens lapso do número de ovos colocados pelo worm mesmo mostrado na Figura 2A e B. As imagens mais à esquerda foram tiradas pouco antes do patógeno foi introduzido, Considerando que as imagens mais à direita foram tiradas 10 horas pós infecção por PA14. O intervalo de tempo entre as imagens é 1 hora. (B) o curso de tempo do número cumulativo de ovos em worms individuais. Cada linha corresponde a um único animal. Linhas foram classificadas em ordem decrescente do número total de ovos postos por worm. O número de ovos é codificados por cores e a escala de cores é mostrada à direita. (C) o número médio de ovos estabelecidas por worm em função do tempo. A área cinza indica um desvio padrão de ±. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
1 de Material complementar: um script de exemplo que cria um arquivo de texto contendo as posições da imagem latente para todos os canais no dispositivo de WormSpa. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Microfluidic ferramentas fornecem vários benefícios no estudo de vermes. Imaging em um PDMS dispositivo oferece maior qualidade de imagem em comparação com uma placa de ágar padrão NGM. Várias imagens podem ser tomadas a partir de um único verme, em contraste com os métodos tradicionais em que os animais são colhidos a partir da placa e montados sobre uma lâmina de microscópio para a imagem latente. Além disso, o microambiente no qual residem vermes pode ser mantido constante ou modulado conforme desejado, permitindo precisão de mapeamento entre a composição do ambiente e a resposta dos animais.
Aqui temos demonstrado como realizar uma medição longitudinal da resposta do hospedeiro a infecção bacteriana por imagem a resposta de vários vermes individuais ao patógeno oportunista p. aeruginosa PA14 usando um dispositivo microfluidic personalizado (WormSpa). Tanto brilhante-campo e fluorescência imagens foram tiradas várias vezes sem distorçer a experiência em curso. Em particular, a cinética da postura e a expressão de gene do irg-1 foram vasculhados a cada 10 minutos, um aumento significativo na resolução temporal sobre os métodos tradicionais de14,15.
Neste dispositivo, medidas longitudinais de vários vermes podem ser executadas por revisitar o local salvo de cada worm em um determinado momento. Isto foi demonstrado nas figuras 2C e 3B, onde podemos quantificar o irg-1:: GFP fluorescência e os ovos postos por vermes individuais. Estes números mostram que os vermes exibir ampla gama de perfis de cinéticas. Como mostrada anteriormente em estudos de célula única19,20,21, esta individualidade pode ser usada para entender o design de circuitos genéticos, bem como a correlação entre distintos caminhos19, 22.
Para experiências bem sucedidas, é fundamental para carregar vermes no dispositivo microfluidic rapidamente. Enquanto vermes rastejam na superfície do ágar, eles tendem a bater em ambiente líquido, e este comportamento induz a um programa genético no qual AMP ativado proteína quinases são envolvidas23,24. Para minimizar esta perturbação indesejável, é importante colocar vermes em suas câmaras separadas rapidamente, como as microestruturas na câmara e a permeabilidade do ar de PDMS fornecem minhocas com um ambiente que imita a superfície sólida. 5 embora aplicar uma pressão mais elevada ajuda vermes de carregamento mais rápido, pressurizar o dispositivo demais poderia induzir estresse mecânico sobre as minhocas. Vermes que são severamente estressados fazem ovos não alimentação ou leigos, resultando em um fenótipo de ensacamento claramente observáveis25. Após o carregamento, vermes são alimentados OP50 de Escherichia coli por 2-3 horas, permitindo que os vermes ajustar ao ambiente microfluídicos e fornecendo ao pesquisador a oportunidade de observar os animais e descartar aqueles que foram danificados.
O tamanho e espaçamento das microestruturas em cada câmara são otimizados para os vermes crescidos para 46 horas de detenção de L1 a 25 ° C. As estruturas podem ser ampliadas para estudar mais velhos vermes ou reduzidas para examinar larvas L4, que são menores em tamanho. No entanto, os vermes não são capazes de muda com sucesso na câmara, impedindo o estudo de desenvolvimento post-embrionário neste dispositivo. Para tais aplicações, podem ser considerados métodos como WorMotel26 . Desde que os vermes estão confinados mas não imobilizadas em WormSpa, uma experiência bem sucedida de bens depende se os animais permanecer na câmara. Achamos que isso pode ser um desafio para a fase inicial de larvas, para adultos do sexo masculino e para alguns mutantes hermafroditos.
Em vez de usar uma entrada único buffer (no centro da parte superior, Figura 1), as duas entradas de cabeça para baixo em forma de balão podem ser usadas simultaneamente. Encher as duas seringas com buffers diferentes, um pode gerar ambientes temporalmente estruturados pressionando seringas diferentes em horários diferentes. Isto, por exemplo, permite o estudo da adaptação à mudança de ambiente. 27 , 28
Como mencionado acima, o dispositivo microfluidic descrito aqui pode ser usado para uma ampla gama de outras aplicações. Estes incluem respostas a outras pistas ambientais a estudar. Tais respostas podem incluir alterações na expressão gênica e postura comportamentos, como exemplificado aqui, mas também de alterações no metabolismo e gordura acúmulo (por exemplo, através da coloração pelo vermelho de Nilo de gordura), fisiologia neuronal e sinalização (por exemplo, por cálcio de imagem e optogenetic perturbações), alterações no motor comportamentos tais como bombeamento, defecação e cabeça movimento (através de imagem quantitativa automatizada de sequências de lapso de tempo) e muito mais.
Finalmente, esta abordagem é em grande parte automatizada e reduz o trabalho necessário para longas experiências ao longo de muitas horas, mesmo dias. Uma vez que as localizações dos vermes individuais são salvas no software de aquisição de dados, o experimento consiste de gravação automática de imagens enquanto o controlador da bomba mecânica mantém o fluxo constante de buffer no dispositivo. Importante, a fabricação de um dispositivo de WormSpa não requer qualquer protocolo de litografia macia mais de padrão, e seu design e operação são simples o suficiente até mesmo para os pesquisadores com nenhuma experiência anterior em microfluídica. Com as várias etapas de preparação relativamente simples e vantagens discutidas acima, esta abordagem pode ser útil para aqueles que estão considerando a medição longitudinal de vermes vivos sob condições precisamente controladas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pela National Science Foundation através de subvenções PHY-1205494 e MCB-1413134 (EL) e pela 2017R1D1A1B03035671 de concessão da Fundação de pesquisa nacional da Coreia (KSL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WormSpa | N/A | N/A | The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab. |
| Compound Microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | An inverted fluorescence microscope with a motorized stage |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-501 | |
| Tubing | SCI Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/5 | 0.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D |
| Syringe Tip | CMLsupply | 901-20-050 | 20 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula |
| Syringe Filter | PALL | 4650 | Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane |
| Syringe | Qosina | C3307 | 10 mL Male Luer Lock Syringe |
| 3 Way Valve | ColeParmer | FF-30600-23 | Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile |
| Dowel Pin | McMaster-Carr | 90145A317 | 18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.) |
| Low Binding Microcentrifuge Tube | Corning | CL S3206 | 0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube |
References
- Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation. Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).
- de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology. Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , (2013).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Grisi, M., et al. NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes. Sci Rep. 7, 44670 (2017).
- Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms. Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).
- Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. HandKAchip - Hands-free killing assay on a chip. Sci Rep. 6, 35862 (2016).
- Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nat Commun. 8, 14221 (2017).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps. , New Era Pump Systems Inc. (2017).
- Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. 2 (11), 183 (2006).
- Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction. Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).
- Chalancon, G., et al. Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture. Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).
- Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J. Regulation of noise in gene expression. Annu Rev Biophys. 42, 469-491 (2013).
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes. Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).
- Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling. Science. 301 (5629), 102-105 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 8 (3), 58345 (2013).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , (1997).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans. J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).
- Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).
