Questo protocollo analizza il comportamento di navigazione di Drosophila larva in risposta alla stimolazione simultanea optogenetica dei suoi neuroni olfattivi. Luce di lunghezza d'onda di 630 nm viene utilizzata per attivare i singoli neuroni olfattivi, esprimendo una rodopsina canale rosso-spostato. Larvale movimento viene registrato contemporaneamente, registrato in digitale e analizzati utilizzando il software personalizzato.
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Articolo metodologico
Il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione optogenetica dei neuroni olfattivi di rilevamento
In questo articolo
Sommario
Abstract
La capacità degli insetti di navigare verso le fonti di odore si basa sulle attività del loro primo ordine neuroni olfattivi (ORNs). Mentre una notevole quantità di informazioni è stata generata per quanto riguarda ORN risposte a odoranti, il ruolo di specifici ORNs in risposte comportamentali di guida rimane capito male. Complicanze nelle analisi di comportamento derivano a causa della diversa volatilità di odorizzazione che attivano ORNs singole, multiple ORNs attivato dal singolo odoranti e la difficoltà nella replica naturalmente osservate variazioni temporali in stimoli olfattivi utilizzando metodi convenzionali odore-consegna in laboratorio. Qui, descriviamo un protocollo che analizza il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione simultanea optogenetica di sua ORNs. La tecnologia optogenetica qui permette per la specificità di attivazione ORN e un controllo preciso del pattern temporale di attivazione ORN. Corrispondente movimento larvale viene tenuta traccia, digitalmente registrati e analizzati utilizzando scritta software personalizzata. Sostituendo gli stimoli odore con stimoli leggeri, questo metodo consente un controllo più preciso di attivazione ORN individuale al fine di studiare il suo impatto sul comportamento larvale. Il nostro metodo potrebbe essere esteso a studiare l'impatto dei neuroni di proiezione di secondo ordine (PNs) così come i neuroni locali (LNs) sul comportamento larvale. Questo metodo permetterà dunque una dissezione completa della funzione olfattiva circuito e complemento studi sulle attività del neurone olfattivo come traducono risposte di comportamento.
Introduzione
Informazioni olfattive in ambiente di una larva di Drosophila sono percepite dal solo 21 ORNs funzionalmente distinte, le attività di cui in definitiva determinare comportamento larvale1,2,3,4. Ancora, relativamente piccolo è conosciuto circa la logica con cui informazioni sensoriali sono codificate nelle attività di questi 21 ORNs. C'è quindi la necessità di misurare sperimentalmente i contributi funzionali di ogni ORN larvale di comportamento.
Anche se il profilo di risposta sensoriale di tutto il reper....
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Protocollo
1. costruire un Arena di comportamento e preparazione Hardware per abilitare optogenetica stimolazione in ambito di comportamento
- Per costruire un arena di comportamento luce-sfavoriti, costruire una scatola con una dimensione di 89 x 61 x 66 cm3 (35" L x 24" W x 26" H) fatta di lastre acriliche in plexiglass colorato nero (3 mm di spessore) (Vedi Tabella materiali). Materiali per costruire tale scatola dovrebbero essere disponibile presso negozi di ferramenta locale. Posizionare la scatola su un tavolo nella sala comportamento (Figura 1A).
- Montare una telecamera monocromati....
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Risultati
Per illustrare la specificità di attivazione ORN, il nostro metodo è stato applicato con successo per determinare l'impatto di due differenti ORN (ORN::7a & ORN::42a) (ORNs che esprimono Or7a o Or42a) attivazione sul comportamento larvale (Figura 3). Coerente con gli studi recenti di quell'individuo ORNs larvale sono funzionalmente distinte1,10,13, nostri dati ra.......
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Discussione
Qui, abbiamo descritto un metodo che consente la misurazione di Drosophila comportamento larvale in risposta all'attivazione di optogenetica simultanea dei neuroni olfattivi. Precedentemente descritto larvale metodi1,di rilevamento8 utilizzano la tecnologia di consegna di odore diverso per attivare ORNs. Tuttavia, questi metodi non possono controllare per la specificità o un pattern temporale di attivazione ORN. Il nostro metodo supera questi deficit uti.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da fondi di avvio dall'Università del Nevada, Reno e da NIGMS del National Institute of Health, sotto concessione numero P20 GM103650.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Videocamera per catturare il movimento larvale | |||
| Telecamera CCD | Edmund Optics | 106215 | |
| Adattatore filettato per filtro da M52 a M55 | Edmund Optics | 59-446 | |
| Portafiltro filettato quadrato da 2" per lenti di imaging | Edmund Optics | 59-445 | |
| RG-715, filtro passa-lungo quadrato da 2" | Edmund Optics | 46-066< | |
| strong>Elettronica per configurazione optogenetica | |||
| Raspberry Pi 2B | RASPBERRY-PI.org | RPI2-MODB-V1.2 | |
| Alimentatore programmabile a 3 canali | newegg.com | 9SIA3C62037092 | |
| 8 Canale optoaccoppiatore relè | amazon.com | 6454319 | |
| 630nm Strisce LED a quattro file | environmentallights.com | rosso3528-450-bobina | |
| 850nm Strisce LED | environmentallights.com | wp-4000K-CC5050-60x2-kit | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks Inc. | ||
| Ubuntu MATE v16.04 | Nubuntu | https://github.com/yslo/nubuntu | |
| Altri articoli | |||
| Plexiglass acrilico nero | Home Depot | MC1184848bl | |
| Cibo per mosche e altri reagenti | |||
| Nutrifly cibo per mosche | Genesee Scientific | 66-112 | |
| Polvere di agarosio | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 22cm X 22cm piastra di Petri quadrata | VWR Inc. | 25382-327 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Saccarosio | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Sigma-Aldrich | R2500 | trans-retinici | |
| Flies | |||
| UAS-IVS-CsChrimson | Centro di stoccaggio di Bloomington Drosophila | 55134 | |
| Orco-Gal4 | Centro di stoccaggio di Bloomington Drosophila | 26818 | |
| Or42a-Gal4 | Centro di stoccaggio di Bloomington Drosophila | 9970 | |
| Or7a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 23907 |
Riferimenti
- Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
- Ramaekers, A., et al.
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Ristampe e permessi
