Summary
Dit protocol analyseert navigatie gedrag van Drosophila larve in reactie op de stimulatie van de gelijktijdige optogenetic van haar olfactorische neuronen. Licht van 630 nm golflengte wordt gebruikt voor het activeren van individuele olfactorische neuronen uitdrukken van een rood-verschoven kanaal rodopsine. Larvale verkeer gelijktijdig wordt bijgehouden, digitaal opgenomen en geanalyseerd met behulp van aangepaste-geschreven software.
Abstract
Het vermogen van insecten om te navigeren naar de bronnen van de geur is gebaseerd op de activiteiten van hun eerste-orde olfactorische receptor neuronen (ORNs). Terwijl een aanzienlijke hoeveelheid informatie is gegenereerd met betrekking tot ORN reacties op reukstoffen, blijft de rol van specifieke ORNs in gedrags reacties rijden slecht begrepen. Complicaties bij gedrag analyse ontstaan als gevolg van verschillende volatiliteit van odorant die activeren van individuele ORNs, meerdere ORNs geactiveerd door één reukstoffen, evenals de moeilijkheid bij het repliceren van natuurlijk waargenomen temporele variaties in olfactorische stimuli gebruiken conventionele geur-leveringsmethoden in het laboratorium. Hier beschrijven we een protocol dat Drosophila larvale gedrag in reactie op de stimulatie van de gelijktijdige optogenetic van haar ORNs analyseert. De hier gebruikte optogenetic-technologie zorgt voor specificiteit van ORN activering en nauwkeurige controle van temporele patronen van ORN activering. Overeenkomstige larvale beweging wordt bijgehouden, digitaal opgenomen en geanalyseerd met behulp van aangepaste software geschreven. Door vervanging van geur stimuli met lichte prikkels, voorziet deze methode een meer nauwkeurige controle van individuele ORN-activering om het effect ervan op de larvale gedrag te bestuderen. Onze methode kan verder worden uitgebreid om te bestuderen van de gevolgen van de tweede orde projectie neuronen (PNs) evenals lokale neuronen (LNs) op larvale gedrag. Deze methode zal dus een uitgebreide dissectie van olfactorische circuit functie inschakelen en aanvulling studies over hoe olfactorische neuron activiteiten vertalen naar gedrag reacties.
Introduction
Olfactorische informatie in de omgeving van de larve van een Drosophila is gevoeld door slechts 21 functioneel verschillende ORNs, de activiteiten van die bepaalt uiteindelijk larvale gedrag1,,2,,3,4. Nog, is relatief weinig bekend over de logica die door die sensorische informatie is gecodeerd in de activiteiten van deze 21 ORNs. Er is dus behoefte aan de functionele bijdragen van elke larvale ORN gedrag experimenteel te meten.
Hoewel de zintuiglijke reactie-Profiel van het hele repertoire van Drosophila larvale ORNs is onderzocht in detail1,4,5, de bijdragen van individuele ORNs tot de olfactorische circuit en aldus te navigatie probleem blijven grotendeels onbekend. In de studie van de larvale gedrag, tot nu toe moeilijkheden als gevolg van het onvermogen om te activeren door het ruimtelijk en stoffelijk van één ORNs. Een panel van odorant die specifiek 19 van de 21 Drosophila larvale ORNs activeren werd recent beschreven1. Elke odorant in het deelvenster, in lage concentraties, lokt een fysiologische reactie alleen van haar cognaat ORN. Echter, bij hogere concentraties die normaal gesproken worden gebruikt voor conventionele gedrag testen, lokt elk odorant fysiologische reacties van meerdere ORNs1,5,6. Verder hebben odorant in dit deelvenster gevarieerd volatiliteiten die interpretatie van gedrag studies die afhangen van de vorming van stabiele geur verlopen7,8te bemoeilijken. Ten slotte, natuurlijk voorkomende geur prikkels hebben een temporele component die is moeilijk te repliceren onder laboratoriumomstandigheden. Daarom is het belangrijk om te ontwikkelen van een methode die larvale gedrag terwijl gelijktijdig het activeren van individuele ORNs in een ruimtelijke en temporele wijze kan meten.
Wij tonen hier, een methode die voordelen ten opzichte van de eerder beschreven larvale tracking heeft testen1,8. De bepaling van de tracking beschreven in Gershow et al. gebruikt elektronisch gestuurde kleppen te handhaven van een stabiel verloop van geur in de gedrag arena8. Echter, als gevolg van het niveau van complexe engineering betrokken te bouwen de geur stimulans setup, deze methode is moeilijk te repliceren in andere laboratoria. Verder, de kwesties met betrekking tot het gebruik van odorant specifiek het activeren van één ORNs onopgelost blijven. De bepaling van de tracking beschreven in Mathew et al. een eenvoudigere geur leveringssysteem gebruikt, maar de resulterende geur verloop is afhankelijk van de volatiliteit van de test odorant en is instabiel voor lange duur van de test1. Dus, door vervanging van geur stimuli met lichte prikkels, onze methode kent de voordelen van specificiteit en nauwkeurige temporele controle van ORN activering en is niet afhankelijk van de vorming van geur gradiënten van verschillende weerstandsniveau's.
Onze methode is gemakkelijk aan opstelling en is geschikt voor onderzoekers kochten meten van aspecten van Drosophila larvale navigatie. Deze techniek kan worden aangepast aan andere modelsystemen, mits de onderzoeker in staat om te rijden de expressie van CsChrimson in hun favoriete systeem neuron(s) van keuze is. CsChrimson is een rood-verschoven versie van kanaal rodopsine. Het is geactiveerd bij golflengten die onzichtbaar voor de larve van phototaxis systeem zijn. Daarom zijn wij kundig voor het manipuleren van de activiteit van neuronen met specificiteit, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid9. Door aanpassing van de maat geschreven software ter verantwoording voor formaatwijzigingen van de onderwerpen, kan deze methode gemakkelijk worden aangepast voor kruipen larven van andere insecten soorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. opbouw van een gedrag Arena en het voorbereiden van de Hardware om de stimulatie van de Optogenetic in de Arena gedrag
- Bouwen om te bouwen van een licht-beroofd gedrag arena, een doos met een dimensie van 89 x 61 x 66 cm3 (35" L x 24-inch W x 26" H) gemaakt van zwart gekleurde plexiglas acrylplaten (3 mm dik) (Zie Tabel van materialen). Materialen om te bouwen van een dergelijke doos moet beschikbaar zijn op lokale bouwmarkten. Plaats dit vak op een tafelblad in de kamer gedrag(Figuur 1).
- Mount een monochroom USB 3.0 CCD camera met een IR-long pass 830 nm-filter en een 8 mm F1.4 C-mount lens uitgerust (Zie Tabel van materialen) naar het midden van het plafond van de zwarte doos. Plaats twee infrarode LED strips (Zie Tabel van materialen) op het tafelblad om het verlichten van de larven in de donkere arena(Figuur 1).
- Om te bouwen van de LED-platform, een 22 cm × 22 cm vierkante aluminiumplaat (bij voorkeur gespoten met een mat zwarte afwerking te elimineren alle reflecties) te verkrijgen. In het midden van de plaat, met behulp van een metalen cutter, een gat dat is groot genoeg om te passen rond de CCD-camera.
- De metalen afdekplaat met rode LED strip verlichting (Zie Tabel van materialen). Soldeer LED light strip draden in serie en voeden van de draden van de strip in een optocoupler relay bestuurd door de microprocessor van een Raspberry Pi 2B (Zie Tabel van materialen) (Figuur 1B en 2).
- Installeren en configureren van Ubuntu stuurman/Raspian Jesse/Linux gebaseerd besturingssysteem op de processor van de Raspberry Pi voordat u de estafette optocoupler aansluit op de LED strips. Hechten van een power supply voor het aandrijven van de LED strips en de optocoupler (Figuur 2) (Zie Tabel van materialen). Het monteren van de LED-platform rond de CCD-camera (Figuur 1B).
Opmerking: Besturingssysteem van Ubuntu Mate v16.04 is vrij beschikbaar. Een aantal eenvoudige commando's van de Python gebaseerd kan gemakkelijk aangepast worden aan programma patronen van LED licht stimuli (Zie bestand van syntaxis). - Zorgen voor homogene bestralingssterkte op verschillende punten in de arena van gedrag. De absolute bestralingssterkte op het oppervlak van de arena met de hulp van een Spectrometer meet en bepalen het ~1.3 W/m2 in het oppervlak van de arena.
Opmerking: Bij deze intensiteit, geen significante veranderingen werden waargenomen in temperatuur in de loop van de experimenten. Een andere studie10 gebruikt een hogere bestralingssterkte van ~1.9 W/m2 en geen veranderingen in temperatuur waargenomen in de loop van de experimenten.
2. voorbereiding van Drosophila larven gedrag Analyses
- Handhaven van de vliegen op standaard vliegen voedsel (Zie Tabel van materialen) bij 25 ° C, 50-60% RH en een 12/12 uur licht/donker cyclus.
-
Om uit te drukken van CsChrimson in een paar van ORNs, kruis Maagd vrouwtjes uit een UAS-IVS-CsChrimson -lijn voor mannetjes van een OrX-Gal4 -lijn ('X' correspondeert met een van de 21 larvale geur-receptor (of) genen die uniek worden uitgedrukt in elk van 21 paren ORNs)9,11.
- Afwisselend, om uit te drukken CsChrimson in alle 21 larvale ORNs, cross Maagd vrouwtjes uit een UAS-IVS-CsChrimson lijn aan mannetjes uit een Orco-Gal4 -lijn ('Orco' is de co-receptor die wordt uitgedrukt in alle 21 ORNs).
- Gebruik UAS-IVS-CsChrimson lijn door zelf als een besturingselement in deze experimenten.
Opmerking: De vliegen bestanden hier vermeld worden alle beschikbare op de Bloomington Drosophila voorraad Center (Zie Tabel van materialen).
-
Zodra de mannelijke en vrouwelijke vliegen in een kruis zijn toegestaan om te paren en leggen eieren voor 48 h, overbrengen in volwassenen een frisse flacon.
- Aan de oppervlakte van de voedsel-flacon met eieren, Voeg 400 µL van een mengsel met 400 µM all-trans retinal (ATR) opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO) en 89 mM sacharose opgelost in gedestilleerd water.
Opmerking: De kleine hoeveelheid sacharose bevordert larvale voederen van de ATR-oplossing. ATR is een cofactor vereist voor upregulating van CsChrimson expressie9,10. ATR is lichtgevoelig. - Zodra ATR wordt toegevoegd aan de flesjes van de levensmiddelen die eieren bevatten, Incubeer de flesjes in het donker voor een extra 72 h.
Opmerking: Terwijl deze studie en de bovenstaande twee studies niet effecten op het larvale gedrag als gevolg van ATR voeden waargenomen hebben, is het aanbevolen beheersen om de gevolgen van ATR voeden door lijnen van de test te onderwerpen aan dezelfde hoeveelheid het bovenstaande mengsel die geen ATR bevat.
- Aan de oppervlakte van de voedsel-flacon met eieren, Voeg 400 µL van een mengsel met 400 µM all-trans retinal (ATR) opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO) en 89 mM sacharose opgelost in gedestilleerd water.
- Uittreksel derde-instar-larven (~ 120 h na het leggen van eieren) van het oppervlak van vliegen voedsel door drijvend ze met behulp van een sacharoseoplossing hoge dichtheid (15%). Het gebruik van een P1000 micropipet naast de larven drijven op het oppervlak van de sacharoseoplossing in een bekerglas van 1000 mL glas.
- Wassen larven 3-4 keer door 800 mL vers gedestilleerd water in het glas bekerglas telkens uit te wisselen. Toestaan dat larven 10 min rusten alvorens hen te onderwerpen aan de bepaling van het gedrag.
3. gedrag Assay
- Consistente temperatuur (tussen 22 – 25 ° C) en luchtvochtigheid (tussen 50 en 60% relatieve vochtigheid) op de kamer gedrag.
-
Bereiden larvale kruipende medium door gieten 150 mL gesmolten agarose (1,5%) naar een 22 x 22 cm vierkant petrischaal. Een petrischaal wordt gegoten voor elk afzonderlijk experiment voor de bepaling, 8 – 10 proeven per experiment. Toestaan agarose om te stollen en cool voor 1-2 h in de petrischaaltjes voordat u ze gebruikt in de analyse van gedrag.
- Overdracht van niet meer dan 20 van de geprepareerde derde-instar-larven naar het centrum van petrischaal (Figuur 1C). Dekking van de petrischaal met het deksel. Plaats de petrischaal in de arena gedrag onder de CCD-camera.
Opmerking: Afhankelijk van het experiment, gedrag testen worden meestal uitgevoerd voor 3-5 min. Als er een odorant aan begeleiding aanwijzingen geven in de bepaling wordt gebruikt, heeft men opgemerkt dat het resulterende verloop van de geur stabiel voor ongeveer 5 min1 blijft. Langere assay tijden worden niet aanbevolen. Schadelijke effecten op de larven als gevolg van uitdroging of langdurige 630 nm rood-licht blootstelling zijn niet waargenomen binnen deze tijd punten.
- Overdracht van niet meer dan 20 van de geprepareerde derde-instar-larven naar het centrum van petrischaal (Figuur 1C). Dekking van de petrischaal met het deksel. Plaats de petrischaal in de arena gedrag onder de CCD-camera.
- Turn ON the 850 nm infrarood LED lichtbron te visualiseren larven in de video. Start de CCD camera als u wilt opnemen van larvale beweging.
- Met behulp van de software gekoppeld aan de processor van de Raspberry Pi, wordt de procedure voor het beheer van passende patronen van rood licht stimulatie.
Opmerking: Een aantal eenvoudige Python gebaseerd commando's kunnen gemakkelijk aan te passen om programma patronen van LED licht stimuli (Zie bestand van syntaxis).
4. verwerking van de gegevens en analyse
- De opgenomen video voor elk afzonderlijk experiment in elke beschikbare programmeersoftware zoals Matlab importeren.
- Het verkrijgen van XY-coördinaten van elke larve in een film als een functie van de tijd. Op basis van de grenzen van de opsporingssoftware, kunnen 15 – 20 derde-instar-larven worden bijgehouden in een enkele film1,8.
Opmerking: Een aantal eenvoudige Matlab codes ('Tracklarva') dat kan gemakkelijk aangepast aan passende omstandigheden worden (Zie bestand van syntaxis) worden verstrekt. Dit programma combineert alle proeven in een experiment en de XY-coördinaten van elke larve uitgangen voor de gehele duur van de test (zie code volgens onderstaande syntaxis). Afwisselend, kan men gebruik maken van verschillende open source programma's die vrij beschikbaar voor onderzoekers zijn. Bv JAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12. -
Gebruik de gegenereerde XY-coördinaten plot larvale trajecten en larvale motoriek verder te analyseren.
- Voor gedrag analyses, kunt navigatie statistieken zoals snelheid, pad kromming, rubriek hoek, segmenteren individuele larvale trajecten in afwisselend sequenties van loopt en bochten.
- Punten worden gedefinieerd als ononderbroken periodes van voorwaartse beweging. Bochten scheiden opeenvolgende punten. Bochten worden gemarkeerd wanneer wijzigingen in traject richting hoeken waren > 45° (Zie bestand van syntaxis).
- Berekenen gemiddelde waarden voor stormloop snelheid, lengte, lopen richting en andere parameters worden uitgevoerd zoals vereist.
Opmerking: Een aantal eenvoudige syntaxis voor het uittreksel 'loopt' en 'stopt' van larvale trajecten worden verstrekt (Zie bestand van syntaxis). Eenvoudige Matlab of Excel gebaseerde functies kunnen worden toegepast op de opgehaalde gegevens te berekenen van waarden voor 'stormloop speed', 'run lengte' enz. - Gegevens voor elke gedrags-metric vertegenwoordigen zoals bedoel ± SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om aan te tonen van de specificiteit van ORN activering, werd onze methode succesvol toegepast om te bepalen van het effect van twee verschillende ORN (ORN::7a & ORN::42a) (ORNs uiting van Or7a of Or42a) activering op larvale gedrag (Figuur 3). Overeenstemming met de recente studies dat individuele larvale ORNs zijn functioneel verschillende1,10,13, onze representatieve gegevens blijkt dat toen ORN::7a uiten van CsChrimson werd gestimuleerd door licht, was er een significante afname van de run lengte vergeleken met de controledieren. Omgekeerd, toen ORN::42a uiten van CsChrimson werd gestimuleerd door licht, was er een aanzienlijke toename in run lengte vergeleken met de controledieren (Figuur 3). De collectieve gegevens geanalyseerd van ~ 100-120 larvale nummers werden verkregen (n = 8) proeven uitgevoerd voor elk genotype. De foutbalken vertegenwoordigen SEM. We beschrijven alleen de parameter van een enkele gedrag (run length) hier, wij stellen vast dat elke larvale track kan verder worden geanalyseerd om te berekenen parameters voor snelheid, pad kromming, en lichaam1,8,13buigt, 14,,15. Meer parameters aan directionaliteit zoals rubriek hoek gerelateerde, lengte uitvoeren en uitvoeren snelheid naar en uit de buurt van geuren kunnen worden verkregen als een bron van de geur wordt geleverd aan de ene kant van de arena1,8,13.
Om aan te tonen onze methode de mogelijkheid om te veranderen de temporele patronen van ORN activering, gevarieerd we onze stimulans om te schakelen tussen de lampjes uit en weer aan. We ondergaan de larven uiten UAS -CsChrimson in de ORN::42a drie verschillende temporele patronen van licht stimuli in de lights ON-periode (0,04 Hz 1 Hz en constante). We gemeten dan veranderingen in de gedragsmatige parameters die tijdens lights OFF → ON fase en lichten op → uit fase gebeuren. We vonden dat voor ORN::42a, verschillende temporele patronen van licht stimulatie verschillende gedrags Reacties (Figuur 4 ontlokte). Dergelijke veranderingen werden niet vastgesteld bij controle larven die niet UAS-CsChrimson in een ORNs. uitdrukken doen Deze resultaten hoogtepunt het belang van inzicht in hoe temporele patronen van ORN activering bijdragen aan dierlijk gedrag.
Figuur 1 : Gedrag arena en larvale kruipende medium. (A) vooraanzicht van de zwarte-doos-gedrag-arena. De open deur van de arena onthult een CCD camera opgehangen aan het plafond van het vak. (B) de onderste weergave van een metalen platform met rode LED licht strips gebruikt voor optogenetic stimulaties is rond de CCD-camera gemonteerd. (C) bovenaanzicht van het larvale kruipende medium gebruikt in de test. Voor aanvang van de opname van larvale beweging, gelaagde ~ 20 gewassen larven worden gelegd langs het midden van een 22 x 22 cm petrischaal met 1,5% agarose. De petrischaal met larven wordt geplaatst in het midden van de arena onder de CCD-camera en tussen twee infrarood LED licht strips die worden gebruikt als een lichtbron voor de camera. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Optogenetics setup. Een infographic weergegeven: de elektronische regeling voor het optogenetics-setup. Kort, LED-verlichting (630 nm) stroken in serie zijn geschakeld en draden van de strips worden gevoed in een optocoupler aangesloten op een raspberry PI 2B microprocessor. Zowel de LED licht strips en de optocoupler worden aangedreven door een voeding. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Impact van lichte activering van individuele ORNs op larvale gedrag. Lengte van larven uiting van CsChrimson in ORN::7a en ORN::42a werden anders getroffen in vergelijking met controle van larven bij lichte activering worden uitgevoerd. Elke staaf vertegenwoordigt gemiddelde RI ± SEM (n = 8). Run lengte van larven als ORN::7a werd geactiveerd was aanzienlijk lager dan controle. Run lengte van larven als ORN::42a werd geactiveerd was aanzienlijk hoger is dan het besturingselement. Gemiddelde ± SEM de staven (n = 8, Student t-test; "*" is p < 0.05, "**" is p < 0.001). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Impact van verschillende temporele patronen van ORN activering op larvale gedrag. (A) drie temporele patronen van stimuli gebruikt om ORNs te activeren. Stimulans a: 1 min constante licht tijdens Stimulus b: 0,04 Hz lichte stimulatie, Stimulus c: 1 Hz lichte stimulatie in minuut 2 periode LED op. (B) larven werden onderworpen aan de drie verschillende patronen van licht stimuli beschreven in A. Elke stip vertegenwoordigt de verandering van larvale gedrag, onder elk patroon van licht stimuli, wanneer licht activering is overgestapt van ON naar OFF. Wijzigen 'uitvoeren lengte' (Av. uitvoeren lengte (OFF) - Av. lengte uitvoeren (ON)) wordt uitgezet op de x-as. Wijzigen 'uitvoeren snelheid' (Av. uitvoeren snelheid (OFF) - Av. uitvoeren snelheid (ON)) op de y-as worden uitgezet. De linker grafiek (grijze stippen) geeft metingen van de larven van de controle en de juiste grafiek (rode stippen) geeft metingen van larven uiting van CsChrimson in ORN::42a. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende bestand van syntaxis: een aantal eenvoudige Matlab codes ('Tracklarva') dat kan gemakkelijk aangepast worden aan passende voorwaarden. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschreven hier, een methode die het mogelijk voor de meting van Drosophila larvale gedrag in reactie op de activering van de gelijktijdige optogenetic van olfactorische neuronen maakt. Eerder beschreven larvale bijhouden methoden1,8 verschillende geur levering technologie gebruiken om te activeren ORNs. Echter controle geen over deze methodes voor zowel de specificiteit of temporele patronen van ORN activering. Onze methode overwint deze tekorten met behulp van lichte stimuli in plaats van geur prikkels voor meer nauwkeurige controle van ORN activering.
De materialen die nodig zijn om te bouwen van het gedrag arena gemakkelijk kan worden verkregen bij de lokale ijzerhandel en vereist minimale inspanning tijdens vergadering. De elektronica die nodig zijn voor het bereiden van de optogenetics module zijn ook gemakkelijk beschikbaar en gebouwd. De beschreven methode wordt hier rood licht om te activeren van een rood-verschoven kanaal rhodopsine (CsChrimson) uitgedrukt in specifieke neuronen. Het resulterende larvale gedrag in reactie op de overeenkomstige ORN activering wordt met behulp van een CCD-camera en gemeten met behulp van software op maat geschreven die hier geregistreerd. Onze methode kunnen onderzoekers graag antwoorden op verschillende vragen die niet mogelijk waren: 1) wat is de impact van verschillende olfactorische stimulans patronen op het dier de mogelijkheid om te navigeren naar een geur? 2) vergelijkbaar met ON-center en OFF-center ganglion cellen van zoogdieren retina16, zijn er ORNs die specifiek op een afname van de olfactorische stimuli naast ORNs die op een toename van de olfactorische prikkels reageren reageren? Tot slot, onze methode vliegvergunningen een scala aan toekomstige toepassingen, met inbegrip van meting van de impact van downstream neuronen in de olfactorische circuit (PNs en LNs) larval navigatie.
Hoewel er verschillende voordelen aan onze methode, erkennen wij bepaalde beperkingen. Het is onduidelijk of concentratie waargenomen met odorant effecten kunnen worden gemakkelijk gerepliceerd met behulp van dit systeem. Terwijl onze huidige instelling dit niet toelaat, kan de optogenetics module gemakkelijk worden gewijzigd om stijgingen of dalingen in de intensiteit van de lichte stimulus. In de toekomst zullen we controleren om te zien of wisselende intensiteit van licht stimulus gevolgen van de concentratie van odorant nabootst. Eenvoudige vliegen genetische technieken kunnen worden gebruikt om uit te drukken van de CsChrimson in hetzij alle 21 paren van ORNs (met behulp van Orco-Gal4) of in een paar van ORNs (met behulp van individuele of-Gal4s). Echter ingewikkeld genetica zouden moeten uitspreken op de CsChrimson in ' 1 < n < 21' neuronen. Wegens dit zou het moeilijk om te repliceren de waargenomen met geur mengsels waar individuele bestanddelen van het mengsel reacties van meer dan één ORN ontlokken effecten. Hoewel larvale navigatie gedrag wordt beschouwd als een lage dimensionale probleem, wij erkennen dat onze larvale tracking programma verder kan worden verbeterd in de toekomst door te overwegen extra gedrags descriptoren gebaseerd op dierlijke houding (bv kans op hoofd draait, lichaam bochten etc.)8,17. Onze studie was beperkt tot de eerste orde sensorische neuronen in de larve. Nader onderzoek is vereist voordat onze methode kan worden toegepast op de tweede orde projectie neuronen en lokale neuronen die zijn ingesloten in de hersenen kwab regio van de hersenen-18.
Kortom biedt onze methode de mogelijkheid om ontleden van de functie van elke ORN in het eenvoudige, hanteerbare olfactorische circuit van de larve van de Drosophila . Door dit te doen, kan onze methode ontwikkeling van nauwkeuriger rekenmodellen die beschrijven hoe geur signalen zijn vertaald in verschillende gedrags uitgangen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door opstarten middelen uit de University of Nevada in Reno en NIGMS van het National Institute of Health onder grant nummer P20 GM103650.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Video camera to capture larval movement | |||
| CCD Camera | Edmund Optics | 106215 | |
| M52 to M55 Filter Thread Adapter | Edmund Optics | 59-446 | |
| 2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses | Edmund Optics | 59-445 | |
| RG-715, 2" Sq. Longpass Filter | Edmund Optics | 46-066 | |
| Electronics for optogenetic setup | |||
| Raspberry Pi 2B | RASPBERRY-PI.org | RPI2-MODB-V1.2 | |
| 3 Channel programmable power supply | newegg.com | 9SIA3C62037092 | |
| 8 Channel optocoupler relay | amazon.com | 6454319 | |
| 630nm Quad-row LED strip lights | environmentallights.com | red3528-450-reel | |
| 850nm LED strips | environmentallights.com | wp-4000K-CC5050-60x2-kit | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks Inc. | ||
| Ubuntu MATE v16.04 | Nubuntu | https://github.com/yslo/nubuntu | |
| Other items | |||
| Plexiglass black acrylic | Home Depot | MC1184848bl | |
| Fly food and other reagents | |||
| Nutrifly fly food | Genesee Scientific | 66-112 | |
| Agarose powder | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 22cm X 22cm square petri-dish | VWR Inc. | 25382-327 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| All trans-retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | |
| Flies | |||
| UAS-IVS-CsChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55134 | |
| Orco-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 26818 | |
| Or42a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 9970 | |
| Or7a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 23907 |
References
- Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
- Ramaekers, A., et al. Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit. Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).
- Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).
- Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva. Neuron. 46, 445-456 (2005).
- Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system. Neuron. 59, 110-124 (2008).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
- Monte, P., et al. Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis. Behav Genet. 19, 267-283 (1989).
- Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature methods. 9, 290-296 (2012).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11, 338-346 (2014).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics. eLife. 4, (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature methods. 10, 64-67 (2013).
- Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit. eNeuro. 3, (2016).
- Schulze, A., et al. Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis. eLife. 4, (2015).
- Tastekin, I., et al. Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva. Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).
- Famiglietti, E. V., Kolb, H. Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells. Science. 194, 193-195 (1976).
- Luo, L., et al. Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).
- Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. eLife. 5, (2016).
