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Immunology and Infection

具有量身定做多样性的合成噬菌体展示库的构建

doi: 10.3791/57357 Published: May 1, 2018
* These authors contributed equally

Summary

本议定书描述了一个详细的程序, 以构建一个噬菌体显示合成抗体库, 具有量身定做的多样性。合成抗体具有广泛的应用, 从基础研究到疾病诊断和治疗。

Abstract

基础研究和医学中单克隆抗体 (抗体) 的需求逐年增加。自1975年第一次报告以来, 杂交瘤技术一直是单克隆抗体发展的主要方法。作为一种替代技术, 噬菌体显示方法为单克隆的发展越来越有吸引力, 因为 Humira, 第一种噬菌体抗体和最畅销的抗体之一, 被批准用于临床治疗类风湿关节炎在2002年。噬菌体展示作为一种非动物性的单克隆技术, 它绕过了传统的基于杂交瘤技术的抗体开发所需要的抗原免疫原性、人性化和动物维护。在本协议中, 我们描述了一种构建的合成噬菌体显示的工厂图书馆的多样性 109-1010获得单电穿孔。本协议包括: 1) 高效电控细胞制剂;2) 提取含尿单链 DNA (杜 ssDNA);3) 基于寡核苷酸定向诱变的安德鲁·库恩克尔方法;4) 电穿孔及库尺寸计算;5) 蛋白质 A/l-基酶联免疫吸附试验 (ELISA) 用于折叠和功能多样性评价;和 6) DNA 序列分析的多样性。

Introduction

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抗体具有广泛的应用范围, 从基础研究到疾病诊断和治疗。截至 2016年, 美国食品药品监督管理局 (USFDA) 批准了60多抗体, 用于临床治疗自身免疫性疾病、癌症和传染性疾病1,2

在 1975年, 科勒和米尔斯坦报告了一种技术, 连续产生抗体的单一克隆特异性从细胞源称为 ' 杂交瘤 ', 这一技术后来成为医药和工业的基石 3 ,4。这种方法产生的抗体需要各种步骤, 包括抗原生产、小鼠免疫、b 淋巴细胞的提取、b 细胞与骨髓瘤细胞的融合, 形成不朽的杂交瘤细胞、克隆选择和治疗应用,人性化是需要避免人类抗鼠抗体 (哈马)4,5。然而, 对于这种技术, 抗原, 包括毒素, 病原体和高度保守的蛋白质是相对无效的触发体内免疫应答的单克隆生产5

在 1978年, 和记黄埔et报告使用寡核苷酸直接诱变的残留在单链噬菌体病毒6。在 1985年, 史密斯报告说, 外国基因片段可以融合在框架内的基因编码噬菌体涂层蛋白 III, 从而可以显示在噬菌体表面, 而不损害其传染性7。这些开创性的工作奠定了基础, 随后构建噬菌体显示抗体库的免疫, 幼稚, 和合成形式的单链可变片段 (抗体) 和抗原结合片段 (工厂) 的格式, 以治疗单克隆开发8,9。从技术角度看, 基于噬菌体的抗体开发提供了一种互补的方法, 以杂交瘤为基础的单克隆细胞的发展, 可以帮助规避的局限性, 一些抗原可以构成和人性化的过程,杂交瘤衍生的抗体通常需要5。截至 2016年, 已在市场上批准了6种噬菌体显示衍生抗体, 其中 Humira 是治疗类风湿性关节炎最成功的抗体之一, 许多噬菌体显示抗体候选者目前处于不同的临床阶段。调查10

对于免疫和幼稚的噬菌体抗体库, 在光和重链中互补决定区域 (CDRs) 的多样性来源于自然免疫汇 (, 从 B 细胞)。与此相反, 合成噬菌体抗体库中 CDRs 的多样性是完全人工的。图书馆建设的综合方法对序列多样性的设计提供了精确的控制, 为抗体结构和功能的机械研究提供了机会11,12。此外, 在图书馆建设之前, 可以优化合成库框架, 以方便下游、大型工业发展1112

在 1985年, 安德鲁·库恩克尔报告了单链 DNA (ssDNA) 基于模板的突变方法, 将站点定向突变引入到 M13 噬菌体中, 有效地13。这种方法后来被广泛应用于噬菌体展示库的建设。化学合成的 DNA 寡核苷酸设计, 以引入多样性的 CDRs, 被纳入一个 phagemid 与抗体骨干模板。在这个过程中, phagemid 被表达为一个尿的 ssDNA (杜 ssDNA), 寡核苷酸被退火到 CDRs, 并扩展到合成双链 dna (dsDNA) 在存在 T7 dna 聚合酶和 T4 dna 连接酶。最后, 生成的 ds DNA 可以通过电穿孔引入到大肠杆菌中.

为高多样性, 噬菌体展示图书馆建设, 应仔细准备的两组分混合物的电主管细胞和共价键闭环 dsDNA (CCC-dsDNA) 的高压电穿孔。Sidhu et修改了传统方法制备的电控细胞和 DNA, 大大提高了图书馆的多样性14

在本协议中, 我们描述了一种构建的合成噬菌体显示的工厂图书馆的多样性 109-1010获得单电穿孔。图 1显示了库结构的概述, 其中包括: 1) 高效电控电池的制备;2) 提取杜 ssDNA;3) 基于寡核苷酸定向诱变的安德鲁·库恩克尔方法;4) 电穿孔及库尺寸计算;5) 蛋白质 A/l-基 ELISA 用于折叠和功能多样性评价;和 6) DNA 序列分析的多样性。所有试剂、菌株和设备都列在材料的表中。表 1显示了试剂设置。

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Protocol

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注: 过滤无菌提示必须在处理噬菌体时使用, 以避免污染的吸管枪和周围地区。在处理细菌和噬菌体实验时, 必须使用无菌区或罩。噬菌体实验区必须使用2% 的月桂酸钠 (SDS), 其次是70% 乙醇, 以避免噬菌体污染。对于在本协议中进行串行稀释, 每个稀释都应使用新的提示。

1.大肠杆菌SS320 电子主管细胞制剂

  1. 预热的 LB/新年琼脂盘 (准备和储存在4°c 小于1周) 在37°c 孵化器为 1 h. 使用无菌接种循环或无菌提示, 将一只甘油 (大肠杆菌) SS320 细胞在总监的前预热的 LB/新年琼脂板上。轻轻地沿着盘子的表面。在37摄氏度孵化箱里孵化出一夜约12-15 小时的盘子。
  2. 第二天, 使用无菌接种回路或无菌尖端选择一个分离良好的单一群体沿曲折线, 并接种到10毫升的 2, 在一个50毫升的圆底管通过浸渍循环到培养基中, 并简要搅拌。
  3. 孵育在37°c 与震动在200转每分钟大约3-4 小时直到 OD600到达在大约 0.4-0.8 (日志阶段增长)。监视 OD600 at 2 小时。在这期间, 预热的5磅/年的琼脂板 (准备和储存在4°c 小于1周) 在37°c 孵化器至少 1 h。
  4. 添加 20 ul M13KO7 帮助噬菌体从实验室库存约 1 x 1013菌落形成单元 (cfu)/毫升到 180 ul 的灭菌 1X PBS 在蒸压1.5 毫升管, 以准备10十倍串行稀释。
  5. 整除4毫升蒸压和液体2YT 顶琼脂成 5 X 14 毫升圆底管, 标签每管与一个稀释从第五到九的十倍稀释, 分别和孵化在65°c 孵化器维护2YT 顶琼脂在液体状态。
  6. 混合 500 ul 的日志相大肠杆菌SS320 细胞进入 M13KO7 稀释管 (选择第五十倍稀释到九十倍稀释) 和孵化在37摄氏度孵化器为5-10 分钟。
  7. 在步骤1.6 的孵化过程中, 从步骤1.5 到室温 (RT) 转移2YT 顶琼脂, 冷却约5分钟至约42摄氏度。使用内手腕测试2YT 顶琼脂的温度;它应该保持液体。将每个稀释混合物从步骤1.5 转移到相应的2YT 顶琼脂管。拧紧每个管子的盖子, 然后轻轻地翻转几次, 以避免气泡产生。
  8. 小心地将每种混合物倒入预热的 LB/新年琼脂板的边缘 (从步骤 1.3), 并稍微倾斜板, 以充分和均匀地填充与混合物的板块, 同时避免引入气泡。保持板在 RT 约5-10 分钟, 以巩固在每个板块中的最高琼脂和孵化2YT 顶琼脂板在37°c 过夜约15-18 小时。
  9. 选择稀释板后, 隔夜增长从步骤1.8 与约100-200 平均大小, 单一, 良好分离斑块接种。用一只手把琼脂板放在光源上, 另一只手拿着一支吸管枪, 上面装着一个长不育的吸管尖, 垂直刺入顶端的琼脂, 并收集一个单独的和分离良好的斑块。
    1. 将吸管尖略微倾斜, 将顶端琼脂与斑块分开。吸管向上和向下几次, 以去除琼脂与斑块成一个14毫升圆形底部培养管预加载1毫升 2 ml/菅直人/春节中期 (见表 1)。
    2. 重复此过程, 总共挑选3-5 块牌匾。采摘几个斑块的目的是确保成功的接种, 因为斑块可以是微弱的, 相对较小的细菌菌落相比。在37摄氏度生长8小时的斑块, 摇晃 200 rpm。
  10. 在250毫升的折流瓶中, 将生长培养的试管转成50毫升的2种/坎/日式培养基。生长在37°c 与震动在 200 rpm 隔夜大约12小时。
  11. 接种三2升的折流板, 含900毫升的 superbroth/中/坎培养基, 每一个都有5毫升的隔夜文化。孵育在37°c 与震动在200转每分钟 6-7 h 到 OD600在 0.6-0.8 附近。
  12. 将三瓶的细菌培养在冰浴中冷却5分钟, 用手轻轻不停地旋转。以下步骤应在冰冷的房间, 在冰上, 用 prechilled 解决方案和设备。
  13. 使用吸光度纸巾擦拭每瓶的外玻璃;用一只手将1升蒸压离心机瓶倾斜到工作台上, 另一方面将介质从每个瓶中轻轻倒入每个离心瓶中。
  14. 旋转在 5000 x g 和4°c 为10分钟颗粒细菌.
  15. 离心后, 轻轻将上清醒酒为5升蒸压废烧杯。
  16. 填充每瓶100毫升的无菌过滤1.0 毫米 HEPES, pH 7.4, 并添加一个蒸压磁力搅拌杆到每个瓶子, 以帮助颗粒泥沙在 200 rpm。在磁搅拌过程中, 每隔几分钟就从瓶子壁上旋流并取出整个颗粒。一旦颗粒溶解, 填充每瓶额外的400毫升无菌过滤1.0 毫米 HEPES, pH 7.4。
  17. 离心机在 5000 x g 和4°c 为10分钟醒酒上清, 保留搅拌杆在瓶子里。
  18. 重复步骤1.16 到1.17 次。
  19. 并用重悬每个颗粒在500毫升的无菌过滤, 10% 纯甘油的帮助下搅拌棒。在磁搅拌过程中, 每隔几分钟就从瓶子壁上旋流并取出整个颗粒。
  20. 离心机和醒酒在步骤1.17 中。重复步骤1.19。使用长臂蒸压钳去除搅拌杆。
  21. 离心机在 5000 x g 和4°c 为15分钟醒酒上清, 并从每个离心瓶中取出任何残留的清液。
  22. 在一瓶中加入3.0 毫升10% 纯甘油, 并通过吹打轻轻并用重悬颗粒。将悬浮液转移到下一个瓶子, 重复直到所有的小球都悬浮并组合在一个瓶子里。大约6毫升高浓缩细胞获得的滴度约 3 x 1011 cfu/毫升。
  23. 预冷1.5 毫升蒸压离心管和一个96井管存储箱没有分隔在-80 °c 至少1小时之前, 在此步骤。在吹打整除数细胞颗粒悬浮液前, 将预冷离心管转移到冰室。使用吸管整除 350 ul 的细胞悬浮到每1.5 毫升离心管。
  24. 将整除数转移到装满液氮的泡沫箱容器中 (3-5 分钟)。
    1. 将泡沫盒与液氮输送到-80 °c 冰箱 (见步骤 1.23)。
    2. 从-80 °c 冰箱中取出1.5 毫升的离心管储存盒 (见步骤 1.23) 并放在冰上。
    3. 快速使用金属网筛整除数从液氮和放置在管储存盒。存储在-80 摄氏度。
      注意: 液氮会引起烧伤, 必须注意安全防护。使用 phagemid 骨干, 以检查所制备的电子主管细胞的效率 (phagemid 的骨干, 应在 400 ng/µL 的超纯水 (MilliQ) 水。解冻1微克的 phagemid 骨干, 在10µL 超纯水和 350 ul 整除的电控 SS320 在冰上, prechill 一个0.2 厘米的间隙电击试管在冰上。
  25. 将 350 ul 电控 SS320 细胞添加到10µL DNA 中, 解冻后再混合吹打几次, 同时保持混合物在冰上。避免引入气泡。
  26. 预热前15毫升的 SOC 介质在50毫升管中, 在37摄氏度的水浴中至少有30分钟的电穿孔。将 360 ul 混合物转移到试管, 并按照制造商的说明进行电穿孔。
  27. 在电穿孔后立即通过添加1毫升预热的 SOC 培养基 (从步骤 1.27) 和吹打来抢救细胞。将培养基从试管转移到125毫升的烧瓶, 预装5毫升预热的 SOC。
  28. 冲洗试管两次, 每次用1毫升预热的 SOC 培养基, 并将培养基转移到125毫升瓶 (见步骤 1.27)。将预热后的 SOC 介质添加到125毫升烧瓶的最终体积为10毫升。
  29. 孵育10毫升细胞培养30分钟在37°c 与震动在200转每分钟。
  30. 制作串行稀释, 以确定转染效率和 M13KO7 前感染率。
    1. 使用多通道吸管将 180 ul 2YT 介质添加到一列 96 microwell 板的每一个井中。
    2. 制作8稀释系列: 将 20 ul 的文化从步骤1.29 转移到板块的第一井, 混合吹打, 并将混合物的 20 ul 转移到下一井。重复此步骤到序列稀释的末尾。
    3. 板 10 ul 每系列稀释在 lb/碳水化合物, lb/菅直人和 lb/新年版的重复。
    4. 孵化过夜在37摄氏度。
    5. 效率计算公式: 假设 M 是从稀释的褶皱 10n (n 为 1-8) 计数的平均菌落数。大肠杆菌SS320 从 LB/碳水化合物板块 phagemid 的晶圆骨架的电控细胞转染效率等于 M X 10N+3 cfu/µg。M13KO7 前感染率的估计从殖民地的比例在 lb/菅直人和 lb/春节。根据 SS320 和磅/坎的菌落比例, 估计出的大肠杆菌的百分比 (phagemid), 这些细胞是由该组织的骨干组织转染的。

2. 从 Phagemid 模板中准备含有尿的 ssDNA (杜 ssDNA)

注意: 以前报告的 phagemid 骨干网是用于 ssDNA 准备15的模板。phagemid 主干系统的体系结构显示在图 2中。采用质粒自旋试剂盒 (QIAprep 旋转 M13) 提取 ssDNA, 并进行了细微的修饰。

  1. 预热的 LB/cmp 板 (准备和储存在4°c 小于1周) 在37摄氏度孵化器为1小时. 在预热的 LB/cmp 板上, 用无菌循环或小贴士将大肠杆菌CJ236 细胞 (或另一种 dut−/ung−菌株) 的甘油储存起来。在37摄氏度一夜之间孵化出约12-15 小时的盘子。
  2. 在14毫升聚丙烯圆底管中, 选择一个无菌尖端的单一菌落, 并接种到2毫升的2种化学/cmp 培养基中。
  3. 孵化介质在37°c 与震动在200转每分钟3-4 小时直到 OD600到达在大约 0.4-0.8 (日志阶段增长)。
  4. 添加 5-10 ul 噬菌体的骨架模板的文化, 并孵化37摄氏度与颤抖 200 rpm 30 分钟, 以使噬菌体感染。
  5. 孵化后, 使用一个不育的尖端, 以 10 ul 的文化, 在预热的 LB/碳水化合物板块在37摄氏度。每晚孵化37摄氏度, 约12-15 小时。
  6. 选择一个包含 CJ236 骨干 phagemid 的大肠杆菌的单一殖民地, 在14毫升聚丙烯圆底管中接种3毫升2的发酵剂/碳水化合物/cmp, 并以37摄氏度的时速在 200 rpm 处过夜, 大约12小时。
  7. 接种0.3 毫升起始培养成30毫升 2 ml/碳水化合物/cmp 在一个250毫升的困惑瓶。
  8. 孵化细胞培养在37°c 与震动在 200 rpm 3-4 小时, 直到 OD600达到在大约 0.4-0.8 (日志阶段增长)。
  9. 添加 M13KO7 (实验室库存, 大约 1 x 1013 cfu/毫升) 的文化从步骤2.8 的多样性的感染 (语言) 约 10, M13KO7 的最终效价约 1 x 1010 cfu/毫升。
  10. 孵育在 200 rpm 和37°c 为1小时。
  11. 在50毫升的圆底管中以 5000 x g 和25°c 为20分钟, 以离心的方法将培养基颗粒。
  12. 醒酒上清和并用重悬30毫升新鲜2的颗粒/碳水化合物/菅直人/苷。把泥沙转移到一个新的250毫升的困惑瓶。
  13. 孵育在 200 rpm 和25°c 为22-24 小时。
  14. 将养殖从步骤2.13 转移到50毫升的圆底管中, 离心培养 1.2万 x g, 以将噬菌体上清与细菌细胞颗粒分离。将噬菌体上清液转移到新的50毫升圆底管中, 加入1/5 的 PEG/NaCl 溶液的最终体积, 以沉淀噬菌体。混合好, 在冰上孵化30分钟, 以沉淀噬菌体粒子。
  15. 离心机在 1.2万 x g 和4°c 为30分钟醒酒上清和离心机在 4000 x g 和4°c 为2分钟吸入剩余的上清。
  16. 并用重悬2毫升无菌过滤 1X PBS 中的噬菌体颗粒, 并转移到1.5 毫升离心管。离心机在一个台式离心 1.2万 x 克5分钟, 以清除残留的细菌碎片, 并将噬菌体上清转移到新的1.5 毫升离心管, 并贮存在4摄氏度。
  17. 通过与大肠杆菌SS320 的比较, 检查大肠杆菌CJ236 中的尿合并效率。
    1. 添加 180 ul 的2YT 介质, 每一个井一排的96井板。
    2. 制作十10倍系列稀释: 将噬菌体上清的 20 ul 转移到板块的第一井, 混合吹打, 并将混合物的 20 ul 转移到下一井。重复此步骤到序列稀释的末尾。
    3. 添加 10 ul 的噬菌体从过去八系列稀释感染 90 ul 的大肠杆菌 CJ236 和 大肠杆菌SS320 在日志阶段 (OD600 = 0.4-0.8)。37摄氏度孵育30分钟, 轻轻摇动。
    4. 板材 10 ul 从每传染的连续稀释在大肠杆菌CJ236 和大肠杆菌SS320 在2个 am 或碳水化合物板材复制。
    5. 孵化过夜在37摄氏度。
    6. 效价计算公式: 假设 M 是从稀释的褶皱 10n (n 为 1-10) 计数的平均菌落数。大肠杆菌CJ236 或大肠杆菌SS320 的效价等于 M X 10N+2 cfu/毫升。从大肠杆菌CJ236 和大肠杆菌SS320 的滴度比中估计尿的效率。
  18. 在1.5 毫升的离心管中添加1/100 体积的噬菌体沉淀缓冲 MP 到噬菌体上清, 并轻轻翻转以混合数次。在 RT 中孵育至少2分钟的噬菌体粒子是从培养基中沉淀出来的, 因此, 在这一点上, 多云溶液应该是可见的。
  19. 将该样本从步骤2.18 应用于一个1.5 毫升离心管中的质粒自旋柱 (例如, QIAprep)。ssDNA 的一个自旋柱的结合能力可以达到至少10µg. 离心机在 6000 x g 和25°c 三十年代在台式离心。丢弃在1.5 毫升离心管中的流动。在这个阶段, 噬菌体粒子仍然与柱形矩阵绑定。
  20. 添加0.7 毫升的 UT-多层噬菌体裂解和捆绑缓冲 (见讨论) 的列和孵化在 RT 至少1分钟。 离心机在 6000 x g 和25°c 三十年代和放弃流经。
  21. 再添加0.7 毫升的 UT 多层缓冲液, 在 RT 中孵育至少1分钟。
  22. 离心机在三十年代的 6000 x g. 丢弃流程。在这一阶段, 噬菌体涂层蛋白与杜 ssDNA 分离, 这仍然与柱状矩阵绑定。
  23. 添加0.7 毫升的洗涤缓冲 PE 含乙醇按照制造商的指示。离心机在 6000 x g 三十年代和放弃流经。
  24. 重复步骤 2.23, 然后离心机再次在 6000 x g 三十年代, 以消除残留缓冲 PE。
  25. 将该列转移到新的1.5 毫升离心管, 并添加100的洗脱缓冲 EB (10 毫米 Tris·) ulCL, pH 值 8.5) 到柱膜的中心。
  26. 在 RT 上孵育10分钟, 离心机在 6000 x g 1 分钟洗脱 ssDNA。大约可以获得 1.5-2.5 微克 ssDNA/毫升的培养。
  27. electrophoresing 1 ul 对1% 琼脂糖泰凝胶进行洗脱 DNA 分析。DNA 应该出现作为一个主要的单一波段, 没有涂抹。
  28. 通过测量 260 nm (260 = 1.0 ssDNA 33 ng/ul) 的 nanodrop 分光光度计测定 DNA 浓度。典型的 ssDNA 浓度在200-500 纳/ul 以内。

3. 基于安德鲁·库恩克尔的寡核苷酸定向诱变方法

注意: 最好在进行全面反应之前进行小规模反应, 以确保诱变寡核苷酸和反应成分的质量。安德鲁·库恩克尔的一种基于寡核苷酸定向诱变的卡通动画在图 3中显示。将各种氨基酸多样性引入 CDRH1、CDRH2、CDRH3 和 CDRL3 区域, IMGT 编号命名为16 (表 2)。在表 2中列出了每个 CDR 的理论氨基酸多样性、总的理论氨基酸多样性和寡核苷酸序列。

  1. 寡核苷酸磷酸化与 T4 核苷酸激酶
    1. 结合0.6 微克的诱变寡核苷酸, 旨在变异一个单一的 CDR, 与 2 ul 10X TM 缓冲器, 2 ul 10 毫米 ATP, 和 1 ul 100 毫米。将超纯 H2O 添加到1.5 毫升管中的 18 ul 的总容积中。在图书馆建设中, 分别建立了与 CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL3 相对应的4种独立的、平行的磷酸化反应。
    2. 添加 20 U (2 uL) 的 T4 核苷酸激酶每管和孵化1小时37°c (反应1在表 3)。立即用于退火。
  2. 寡核苷酸对模板的退火
    1. 到20微克的 ssDNA 模板, 添加 25 ul 10X TM 缓冲器, 20 ul 的每一个磷酸化寡核苷酸解决方案, 和超纯 H2O 到最后体积 250 ul 在0.5 毫升管。混合良好, 并转移到0.20 毫升 PCR 管 (50 ul 每) 作为反应2在表 3中。这些 DNA 数量在寡核苷酸和模板之间提供了3:1 的摩尔比, 假设寡核苷酸和模板的长度比为1:100。
    2. 在 PCR 机中孵育反应在90°c 为3分钟, 50 °c 3 分钟, 20 摄氏度为5分钟。
  3. 酶法合成 CCC-dsDNA
    1. 对 250 ul 退火寡核苷酸/模板混合物, 添加 10 ul 10 毫米 ATP, 10 ul 的25毫米 dNTP 混合, 15 ul, 100 毫米, 30 维斯单位 T4 dna 连接酶, 30 U T7 dna 聚合酶作为反应3在3 中。
    2. 在1.5 毫升管中孵育反应, 在20摄氏度过夜。
    3. 将合成的 CCC-dsDNA 在0.5 毫升的离心过滤器中进行清洗和浓缩, 其 30 kDa 孔径膜在 RT 中。
      1. 将隔夜反应混合物转移到过滤器, 并将超纯 H2O 添加到400µL 最终卷。在 1.4万 x g 处旋转10分钟;体积小于 50 ul。
      2. 丢弃流, 将400µL 的超纯 H2O 添加到筛选器中, 并在 1.4万 x g 处旋转10分钟。
      3. 再次重复步骤3.3.3.2。
      4. 将过滤器倒在干净的离心管中, 以恢复 CCC-dsDNA。在 1000 x g 处旋转2分钟;恢复的容量一般大约 20-40 ul。恢复的 CCC-dsDNA 可立即用于电穿孔的大肠杆菌或冻结在-20 摄氏度以后使用。通常可获得20-40 微克 CCC-DNA。
    4. Electrophorese 1.0 µL 的洗脱反应产物旁边的 ssDNA 模板, 以可视化反应的结果。

4. 电穿孔及库尺寸计算

  1. 在1.5 毫升离心管和0.2 厘米的间隙电穿孔试管冰上冷却纯化的 CCC-dsDNA (最大体积为 50 ul 的20微克)。
  2. 预热20毫升的 SOC 介质, 在50毫升聚丙烯锥形离心机管37°c 水浴至少30分钟。
  3. 解冻 350 ul 整除的电主管的大肠杆菌SS320 在冰上。将细胞添加到 DNA 中, 并通过吹打多次混合。避免引入气泡。
  4. 将混合物转移到试管并按照制造商的说明进行电穿孔。例如, 当使用 BTX ECM-630 电穿孔系统时, 相关设置为 2.5 kV 场强、125Ω电阻和50µF 电容。
  5. 在125毫升烧瓶中加入1毫升预热的 soc 培养基, 将其转化为17毫升的 soc 介质, 立即抢救转细胞。用1毫升的 SOC 介质冲洗试管两次, 然后转到同一个烧瓶 (最终体积为20毫升)。
  6. 孵育30分钟在37°c 与震动在200转每分钟。
  7. 确定电穿孔效率。
    1. 将2YT 介质的 ul 180 添加到一列 96 microwell 板的每一个井中。
    2. 制作8十倍的串行稀释: 将20毫升文化的 20 ul 转移到板块的第一井, 与吹打混合, 并将混合物的 20 ul 转移到下一井。重复此步骤到序列稀释的末尾。
    3. 板 10 ul 每个系列稀释在一磅/碳水化合物板材复制。板材100µL 剩余从每个系列稀释到分开的磅/碳水化合物板材为殖民地计数交叉检查。这些板块还将提供单一克隆用于 ELISA 和序列分析 (见5节)。
    4. 孵化过夜在37摄氏度。
    5. 计数的殖民地从 10 ul 重复的 LB/碳水化合物板块。假设 M 是计数在 10n折叠磅/碳水化合物板 (n 是从 1-8) 的平均菌落数。库的总大小等于 2M X 10N+3殖民地。
  8. 整除的文化从步骤4.6 相等地成两个2升的困惑的烧瓶, 每一个含有500毫升的2种/碳水化合物/菅直人媒介为噬菌体库生成。
  9. 孵育在37°c 与震动在 200 rpm 隔夜大约16小时。
  10. 将文化转移到两个1升蒸压离心机瓶和离心机30分钟, 1.2万 x 克在4摄氏度。
  11. 将上清液转移到两个新的1升蒸压离心机瓶中, 加入1/5 的 PEG/NaCl 溶液的最终容积以沉淀噬菌体。在冰上孵育30分钟。
  12. 离心机为30分钟在 1.2万 x g 和4°c。小心醒酒上清, 避免干扰噬菌体颗粒。在 4000 x g 处旋转1分钟, 用吸管取出剩余的上清液。
  13. 并用重悬噬菌体颗粒与20毫升的无菌过滤 1X PBS 缓冲器和转移到一个新的50毫升管。
  14. 用离心在 1.2万 x g 和4摄氏度的5分钟内将不溶物质颗粒状。将上清液转移到新的50毫升管上。
  15. 用分光光度计 (OD268 = 1.0) 测量噬菌体浓度 (5 X 1012噬菌体/mL 的溶液)。
  16. 将噬菌体浓度调整为 5 X 1012噬菌体/毫升在 1X PBS 与10% 超纯甘油。
  17. 每1.5 毫升离心管整除1毫升的噬菌体溶液。立即使用库进行平移或存储在-80 摄氏度。

5. 蛋白质 A/L 直接结合 ELISA 检测和测序的质量评估

  1. 随机挑选96个单一的殖民地在 LB/碳水化合物板块从一步4.7.3 成一个96深井培养板, 其中包含 800 ul 2 每井。孵育3-4 小时在37°c 与震动在 1000 rpm 到 OD600 = 0.4-0.8。
  2. 添加 100 ul 的 M13KO7 (1 X 1011 cfu/毫升) 到每个井的96深井培养板与多通道吸管。孵育在37°c 与震动在1000转每分钟1小时。
  3. 添加 100 ul 2YT 含有10X 浓度的卡那霉素 (500 微克/毫升), 每井与多通道吸管。孵化隔夜在37°c 与震动在1000转每分钟。
  4. 在 1X PBS 中溶解蛋白质 L 到1µg/毫升。3/4 的水井在384井高蛋白结合聚苯乙烯板与30µL/井的蛋白质 L 溶液。孵化过夜在4摄氏度。
  5. 从步骤5.4 中丢弃隔夜蛋白质 L 涂层溶液。添加50µL PBST (堵塞溶液) 的所有油井在384井高蛋白结合聚苯乙烯板与多通道吸管。在微板块的振动筛上孵化出1小时的盘子。
  6. 从步骤5.3 在一个深96井文化板块的一夜文化, 在 3000 x g 10 分钟, 在4摄氏度下旋转。噬菌体在上清。
  7. 从步骤5.5 中丢弃阻止解决方案。添加 15 ul 的 PBST 和 15 ul 的每一个噬菌体上清 (步骤 5.6) 到3的蛋白 L 涂层井作为三, 和1非涂敷良好的负控制使用多通道吸管。在 RT 中孵育1小时, 晃动在200转每分钟。
  8. 放弃噬菌体溶液。用自动洗板机清洗盘子6次, PBST 80 ul。
  9. 添加 15 ul 的 M-PBST 和 15 ul 蛋白 A-HRP (1:1, 500 稀释 1X PBS), 每井与多通道吸管, 并孵化在 RT 1 h 与震动约 200 rpm。
  10. 放弃蛋白质 PBST 溶液。用 80 ul 的 PBST 洗盘子6次。
  11. 添加 TMB 基板 (30 ul/井) 与多通道吸管和孵化2-3 分钟, 直到颜色发展。停止与1.0 米 H3PO4 (30 ul/井) 的反应。
  12. 读 spectrophotometrically 450 纳米的盘子。阳性克隆被定义为那些表现为450度的平均比值的蛋白质 L 井对 PBST 井大于3.0。
  13. 在96深井, 感染 50 ul 的 SS320 在2在记录阶段与 5 ul 相同的噬菌体用于 ELISA (步骤 5.6) 为30分钟的 RT。
  14. 添加 950 ul 2, 从步骤5.13 到96深井和孵化隔夜在37°c 与震动在 1000 rpm。
  15. 用微型制备 dna 提取试剂盒提取 phagemid dna。使用 TCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTA (5 '-3 ') 和 VH (5 '-GACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCG-3 ') 的上游引物进行序列分析, 以估计库序列的多样性。

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Representative Results

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按照工厂库结构的流程图 (参见图 1), 我们准备了 M13KO7 帮助噬菌体预感染的大肠杆菌SS320 电子主管细胞。当使用 phagemid 库构造骨干 (图 4) 时, 这些电子主管单元的效率估计为 2 X 109 cfu/µg。

通过对大肠杆菌CJ236 和大肠杆菌SS320 细胞的效价比较, 尿合并效率。大肠杆菌CJ236 和大肠杆菌SS320 细胞感染了 ssDNA 的噬菌体。大肠杆菌SS320 有酶 (dUTPase 和尿 glycosylase), 可降解尿含有的 dna, 而大肠杆菌CJ236 缺乏这些酶, 也不能降低含有尿的 dna。为了达到可接受的尿合并效率, 从大肠杆菌CJ236 的效价必须至少比大肠杆菌SS320 的 104倍。否则, 由于尿合并效率低下, 人工抗体库中野生型种群将增加。图 5显示,大肠杆菌CJ236 的效价约为 3 X 105倍, 高于大肠杆菌SS320, 表明有效尿纳入噬菌体 ssDNA。

接下来, 我们准备并提取了 ssDNA。ssDNA 纯度由琼脂糖凝胶电泳 (图 6) 检查。然后进行了寡核苷酸定向诱变, 并对 ssDNA 转化为 CCC-DNA 的效率进行了评价 (图 6)。三个比 ssDNA 更低的运动的产品可以在凝胶上可视化, 包括最快运行的波段 (CCC-dsDNA), 中弱带 (带缺口), 和最慢运行的波段 (链移位的 DNA)。

电穿孔到大肠杆菌SS320 后, 从隔夜孵化盘中估计出库的大小 (见步骤 4.7.5)。平均库大小是 5 X 109 , 从在 LB/碳水化合物板上重复的串行稀释 (图 7)。然而, 这一步估计的大小可能含有噬菌体, 不显示工厂由于存在 frameshift 或停止密码, 或显示错误折叠工厂。采用测序和 ELISA 方法对构造库的功能多样性进行了估计。96随机挑选的单克隆被送往测序分析。表 4显示, 在96随机选取的单个克隆中, 有90个已成功地进行了排序, 其中包含70个克隆, 没有过早停止密码子 (53 个具有至少一个 CDR 变种的克隆和17个具有野类型序列的克隆) 和20个克隆, 并具有在不同地区的过早停止密码子。在70克隆中, CDRH1、CDRH2、CDRH3 和 CDRL3 的突变率分别为50%、57%、53% 和 56%, 而至少一个 CDR 的突变率为76%。在20个具有过早停止密码子 (90%) 的克隆中, 过早停止密码子主要来源于寡核苷酸诱变引物的 frameshift, 包括 45% (CDRH1)、10% (CDRH2)、15% (CDRH3) 和 20% (CDRL3)。

为了检测正确折叠的晶圆厂的显示, 采用了蛋白质 a/L 为基础的 ELISA, 因为它是已知的蛋白质 a 和蛋白质 l 可以识别适当折叠的 VH 框架和, 分别为17,18。与测序分析一致, ELISA 法 (图 8) 表明, 20 克隆具有早停密码子均为阴性, 而野型序列17无性系阳性率经验主义地设定在3.0。对于至少一个 CDR 突变体的53无性系, 在 ELISA 中有43个克隆阳性, 10 克隆为阴性;这表明, 大多数克隆是很好的折叠, 而从10克隆的 CDRs 可能会对晶圆折叠的有害影响。总共有43株克隆出90克隆 (48%), 折叠得很好, 至少有一个 CDR 突变体。因此, 基于蛋白质 A/L ELISA 和序列分析的构建库功能氨基酸多样性估计为 2.4 x 109 (, 48% 5 X 109)。

Figure 1
图 1: 噬菌体展示的工厂库结构概述.噬菌体展示的工厂图书馆的建设遵循了基本的一系列步骤。它包括制备高效的电控细菌细胞、ssDNA 的提取、安德鲁·库恩克尔的寡核苷酸定向诱变、电穿孔和噬菌体库大小的计算、功能评价蛋白质 A/L ELISA 和 DNA 序列分析。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: Phagemid 体系结构的构建.phagemid 骨干的基本特征包括单链 (f1 ori) 和双链 (dsDNA) DNA 复制的起源, 以及氨苄西林/羧苄青霉素抵抗基因 (AmpR)。对于晶圆显示, 在碱性磷酸酶启动子 (PhoA) 的控制下, phagemid 包含一个 bicistronic 盒来驱动表达和分泌: 光链 (LC) 由分泌信号组成, (光链可变区域), CL (常量光链区域) 和 C 终端标志标记;而重链 (HC) 由分泌信号、VH (重链可变区) 和 CH1 (固定区域1重链) 与 p3 噬菌体小涂层蛋白融合而成。在大肠杆菌periplasm 中, 将光链和重链组装成晶圆, 指示在噬菌体表面显示晶圆。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 基于寡核苷酸定向诱变的安德鲁·库恩克尔方法示意图.在该协议中, 我们使用安德鲁·库恩克尔的方法来准备 ssDNA 模板。CDRH1, CDRH2, CDRH3 和 CDRL3 的寡核苷酸是磷酸化, 退火到模板, 并用于将 ss DNA 转化为 CCC-dsDNA。经电穿孔进入大肠杆菌SS320 电子主管细胞后, heteroduplex DNA 被修复为野生型或突变体;由于尿在野生型链中的存在, 修复过程有利于突变体的形成, 从而使变异形态占据了图书馆的主导地位。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 估计 M13KO7 预感染的大肠杆菌SS320 电控细胞效率.采用 phagemid 主干载体检测细胞电穿孔效率。计算效率的公式如下: 假设 M 是从最稀释的褶皱 10n (n 是 1-8) 中计数的平均菌落数。大肠杆菌SS320 的效率从 LB/碳水化合物板块等于 M X 10N+3 cfu/µg。电子主管细胞的效率约为 2 X 109 cfu/µg.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 通过对大肠杆菌 CJ236 和 大肠杆菌SS320 细胞的噬菌体感染尿纳入 ssDNA 的评估。在安德鲁·库恩克尔方法的基础上, 对尿中的噬菌体感染效价与大肠杆菌 CJ236 和 大肠杆菌SS320 细胞进行了比较, 验证了其有效性。滴度计算公式如下: 假设 m 是从最稀释的褶皱 10n (n 为 1-10) 计数的平均菌落数, 并且从大肠杆菌CJ236 或大肠杆菌的效价 SS320 等于 M X 10N+2 cfu/毫升。尿的效率可以从大肠杆菌CJ236 和大肠杆菌SS320 的效价比率来估计。大肠杆菌CJ236 的效价为 9 X 1012 cfu/毫升, 而大肠杆菌的效价 SS320 为 3 X 107 cfu/毫升。大肠杆菌 CJ236 和 大肠杆菌SS320 的滴度比为 3 X 105请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 通过寡核苷酸定向诱变将杜 ssDNA 转化为 CCC-DNA.通过寡核苷酸定向诱变, 对 ssDNA 转化为 CCC-DNA 的效率进行了评价。杜-ssDNA 被完全转化为 dsDNA。显性带是 CCC-dsDNA, 而有一个小部分的 dsDNA 和股移位 DNA。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: 用于计算库大小的噬菌体滴定法.电穿孔到大肠杆菌SS320 后, 该库的大小估计是从稀释上的系列。尺寸计算公式如下: 假设 M 是从2的 yt/碳水化合物板 (N 是 1-8) 中从最稀释的褶皱 10N计数的平均菌落数, 大小等于 2M X 10N+3请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 8
图 8: 蛋白质 A/L 直接结合噬菌体 ELISA.蛋白质 L 可以识别折叠好的 VH 链和蛋白质 A 的框架, 可以识别折叠重链的框架。与蛋白质 L 和 A 的结合表明, 重链和轻链的适当折叠。简单地, 蛋白质 l 在三个和阴性控制 PBST 被涂对板材, 不同的无性系的上清液噬菌体由蛋白质 L 和 M PBST 孵化, 然后洗涤以后, 蛋白质 A-HRP 被用于捕获束缚的噬菌体。噬菌体 ELISA 读数显示90随机采摘的克隆与成功的测序读数。在实证上定义了一个表示克隆为正的阈值行, 其中, 从蛋白质 L (三个与误差条的平均值) 与负控制的 OD450吸光度值的比值大于3.0。三组基于序列分析显示, 对应于无停止密码子在红色 (53 克隆), 野生类型 (在蓝色 (17 克隆) 的突变, 和突变与停止密码子在绿色 (20 克隆)。请单击此处查看此图的较大版本.

试剂设置 组件 评论/说明
2YT 中型 酵母提取物 10克 添加超纯水, 使体积达到1.0 升, 调整 pH 值为 7.0, 蒸压釜。
胰蛋白胨 16克
Nacl 5克
2YT 顶琼脂 酵母提取物 10克 加入超纯水, 使体积达到1.0 升, 并调整 pH 值为 7.0, 加热溶解, 蒸压釜。
胰蛋白胨 16克
Nacl 5克
颗粒琼脂 7.5 克
2)/碳水化合物/cmp 介质 羧苄青霉素 100微克/毫升
氯霉素 10微克/毫升
2苷/碳水化合物/坎/中 羧苄青霉素 100微克/毫升
卡那霉素 50微克/毫升
0.25 微克/毫升
2元/碳水化合物/春节培养基 羧苄青霉素 100微克/毫升
四环素 10微克/毫升
2)/碳水化合物介质 Carbenicilin 100微克/毫升
2中/坎媒体 卡那霉素 50微克/毫升
2)/菅直人/春节中期 卡那霉素 50微克/毫升
四环素 10微克/毫升
2中/中 四环素 10微克/毫升
2、cmp 介质 氯霉素 10微克/毫升
LB 培养基琼脂 酵母提取物 5克 添加超纯水, 使体积达到1.0 升, 调整 pH 值为 7.0, 蒸压釜。对于 LB 琼脂, 加入20克的颗粒琼脂, 蒸压釜。
胰蛋白胨 10克
Nacl 10克
磅/碳水化合物板材 LB 琼脂 1L
羧苄青霉素 100微克/毫升
英镑/春节版 LB 琼脂 1升
四环素 10微克/毫升
LB/cmp 板 氯霉素 10微克/毫升
磅/坎板 卡那霉素 50微克/毫升
SOC 介质 酵母提取物 5克 添加超纯水, 使体积达到1.0 升, 并调整 pH 值为 7.0, 蒸压釜。
胰蛋白胨 20克
Nacl 0.5 克
氯化钾 0.2 克
2.0 M 氯化镁2 5.0 毫升
1.0 米葡萄糖 20毫升
Superbroth 介质 胰蛋白胨 12克 将超纯水添加到900毫升, 蒸压釜, 添加100毫升蒸压0.17 米,2PO4, 0.72 M K2HPO4
酵母提取物 24克
甘油 5毫升
Superbroth/春节中期 卡那霉素 50微克/毫升
四环素 10微克/毫升
1X PBS Nacl 137毫米 将 pH 值调整为 7.2, 蒸压釜。
氯化钾 3毫米
Na2HPO4 8毫米
2PO4 1.5 毫米
泰化/琼脂糖凝胶 泰缓冲器
琼脂 糖 1% (w/v)
GelRed 1:10000 (v/v)
TMB 基板 TMB 50% (v/v)
H2O2过氧化物酶基板 50% (v/v)
PBST 缓冲器 1X PBS 100毫升
Tween-20 0.05% (v/v)
无脂奶粉 5% (v/v)
5X. PEG/氯化钠 PEG-8000 20% (w/v) 添加超纯水, 以弥补体积为 1L, 和高压釜。
Nacl 2.5 米
PBST 缓冲区 1X PBS 1升 0.22 微米过滤消毒。
Tween-20 0.05% (v/v)
10X TM 缓冲器 氯化镁2 0.1 米 将 pH 值调整为7.5。
0.5 米
1.0 毫米 HEPES, pH 值7。4 1.0 M HEPES 4.0 毫升 0.22 微米过滤消毒。
纯水 4.0 升
10% (v/v) 超纯甘油 超纯甘油 100毫升 0.22 微米过滤消毒。
纯水 900毫升
纯水 H20 Dnase, 无 Rnase, 无热原。

表 1: 试剂设置。

Table 2
表 2: CDR 多样性和诱变底漆.将被突变的 CDR 区域的 DNA 序列以红色显示;序列使用 IUPAC 核苷酸代码进行格式化。"X" 表示含有不同氨基酸集的混合物中的三核苷酸;"n" 表示不同数量的 x 五引物与不同数量的 x-被用来多样化 CDRL3 或 CDRH3, 以产生可变长度的 CDRL3 和 CDRH3。剩余数由 IMGT 命名法定义。请单击此处下载此表.

基于安德鲁·库恩克尔的诱变方法
反应1。寡核苷酸磷酸化与 T4 核苷酸激酶
组件 最后
诱变寡核苷酸 0.6 微克
10X TM 缓冲器 2 ul 1X
10毫米 ATP 2 ul 1毫米
100毫米德勤 1 ul 5毫米
T4 核苷酸激酶 (10 U/ul) 2 ul 20 U
超纯 H20 高达 20 ul
反应设置
步骤1。 37°c 为 1 h
反应2。寡核苷酸对模板的退火
组件 最后
杜 ssDNA 模板 20微克 20微克
10X TM 缓冲器 25 ul 1X
磷酸化 CDRH1 寡核苷酸 20 ul 0.6 微克
磷酸化 CDRH2 寡核苷酸 20 ul 0.6 微克
磷酸化 CDRH3 寡核苷酸 20 ul 0.6 微克
磷酸化 CDRL3 寡核苷酸 20 ul 0.6 微克
超纯 H20 高达 250 ul
反应设置
步骤1。 90°c 为3分钟
步骤2。 50°c 为5分钟
步骤3。 20°c 为5分钟
反应3。酶法合成 CCC-dsDNA
组件 最后
退火寡核苷酸/模板混合物 250 ul
10毫米 ATP 10 ul 346µM 每核苷酸
dNTP 混合 (每核苷酸25毫米) 10 ul 865µM 每核苷酸
100毫米德勤 15 ul 5毫米
T4 DNA 连接酶 1 ul 30维斯单位
T7 DNA 聚合酶 3 ul 30 U
反应设置
步骤1。 20°c 过夜

表 3: 安德鲁·库恩克尔方法的程序和组件的反应。

克隆号 地区 百分比
没有过早停止密码子 70 CDRH1 突变 50% (35/70)
CDRH2 突变 57% (40/70)
CDRH3 突变 53% (37/70)
CDRL3 突变 56% (39/70)
至少一个 CDR 突变 76% (53/70)
过早停止密码子 20 CDRH1 缺陷 45% (9/20)
CDRH2 缺陷 10% (2/20)
CDRH3 缺陷 15% (3/20)
CDRL3 缺陷 20% (4/20)
其他缺陷 10% (2/20)

表 4: 合成工厂图书馆 CDRH1、CDRH2、CDRH3 和 CDRL3 的序列分析。

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Discussion

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构建高多样性、噬菌体展示的工厂图书馆, 需要质量控制检查点来监测施工过程的各个阶段, 包括电控细胞的能力、ssDNA 模板的质量、效率dsDNA 合成、电穿孔后滴度、晶圆折叠、CDRs 氨基酸多样性的序列分析。

ssDNA 的高产和纯度是高诱变率的必要条件。在我们的经验, 噬菌体诱导在25°c 隔夜可以产生更多的杜 ssDNA 比从噬菌体诱导在37摄氏度过夜。这与以前的报表19一致。关于 ssDNA 提取, 最初的质粒自旋试剂盒 (QIAprep) 含有多层的噬菌体裂解和结合。后来, 以未知的原因停止了多层板, 并被 PB 取代。结果表明, ssDNA 的收率与多层处理相比, 铅处理的产量要低得多。在本协议中, 我们使用了一个名为 UT ssDNA20的试剂取代了多层板, 并发现了杜的收益率类似于最初的自旋套件。

由于 CDRH3 和 CDRL3 是抗原识别的最不同的区域21, 引入一个定制的多样性与一组特定的氨基酸组合和比率, 并消除冗余偏差和停止密码子引入的退化密码子, 如NNK (N, 摩尔/克/吨;K、摩尔)、三聚体密码子 phosphoramidite 基寡核苷酸22, 并为 CDRH3 和 CDRL3 设计了一个与特定氨基酸对应的三聚体密码子。此外, CDRH3 和 CDRL3 寡核苷酸的可变长度可以进一步增加多样性。

在酶法合成 dsDNA 后, 用琼脂糖凝胶电泳法观察三条带, 不涂涂片即可清除。其中, 最快运行的波段是 CCC-dsDNA, 可产生高突变率 (约 80%) 后电穿孔23。最慢运行的波段是由 T7 dna 聚合酶的固有链位移活动产生的链移位 DNA, 其突变率低 (约 20%)23。由于 T4 dna 连接酶活性不足或寡核苷酸磷酸化不足, 中弱带在扩张后有 dna 的损伤。

一个小的排序示例池用于估计库的多样性, 虽然不是准确的24。为了准确估计实际的多样性, 下一代测序 () 可能是挖掘构造库25的多样性深度的好选择。在实践中, 由于目前的技术的挑战, 包括读取长度, 准确性, 成本和高吞吐量, 在本协议中使用的 CDRH1 噬菌体库的排序与长度约 950 bp 跨越, CDRH2, CDRH3 和 CDRL3 不是实现;然而, 有可能估计抗体 (大约 700 bp) 图书馆多样性在成千上万的范围之内24,25。评价人工图书馆多样性的另一个关键标准是利用图书馆对许多不同类型的抗原进行平移, 并计算出由于图书馆多样性与抗原成功率直接相关而捕获的阳性克隆。平移26。高通量选择平台非常适合这一目的, 读者可以参考 Miersch et . 报告的详细协议。27

从理论上说, 噬菌体显示的合成抗体库具有量身定做的多样性, 可用于任何抗原, 因此具有广泛的应用。目前, 包括剑桥抗体技术 (CAT)、MedImmune、Genentech、Dyax、Bioinvent、辉瑞和 MorphoSys 的公司严重依赖于用于治疗性抗体开发的噬菌体展示平台28。此外, 许多噬菌体展示核心技术专利已过期29。毫无疑问, 这将释放噬菌体显示的抗体技术的最大潜力。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者赞赏 Sidhu 实验室的弗雷德里克 Fellouse 博士对安德鲁·库恩克尔方法的综合构建。作者赞赏 Alevtina Pavlenco 夫人和 Sidhu 实验室的其他成员, 为制备高效的电子能力的大肠杆菌细胞和高质量的杜 ssDNA 提供了宝贵的帮助。这项工作得到中国国家自然科学基金 (批准号: 81572698, 31771006) 的支持, 并由 ShanghaiTech 大学 (批准号: F-0301-13-005) 到抗体工程实验室。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
1.0 M H3PO4 Fisher AC29570
1.0 M Tris, pH 8.0 Invitrogen 15568-025
10 mM ATP Invitrogen 18330-019
100 mM dithiothreitol Fisher BP172
100 mM dNTP mix GE Healthcare 28-4065-60 solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP.
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-76-02
50X TAE Invitrogen 24710030
Agarose Fisher BP160
Carbenicillin, carb Sigma C1389 100 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL.
Chloramphenicol, cmp Sigma C0378 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Invitrogen AM9620G
Granulated agar VWR J637-500G
H2O2 peroxidase substrate Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-65-02
K2HPO4 Sigma 795488
Kanamycin, kan Fisher AC61129 50 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL.
KH2PO4 Sigma P2222
Na2HPO4 Sigma 94046
NaCl Alfa Aesar U19C015
Nanodrop Fisher ND2000C
NaOH Fisher SS256 ! CAUTION NaOH causes burns.
NON-Fat Powdered Milk Sangon Biotech A600669
PEG-8000 Fisher BP233
Protein A-HRP conjugate Invitrogen 101123
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 22704
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28706
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
Recombinant Protein L Fisher 77679
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203S
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T7 DNA polymerase New England Biolabs M0274S
Tetracycline, tet Sigma T7660 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
Tryptone Fisher 0123-07-5
Tween-20 Sigma P2287
Ultrapure glycerol Invitrogen 15514-011
Uridine Sigma U3750 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL.
Yeast extract VWR DF0127-08
Name Company Catalog Number Comments
Strains
E.coli CJ236 New England Biolabs E4141 Genotype: dut-  ung-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA.
E.coli SS320 Lucigen 60512 Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production.
M13KO7 New England Biolabs N0315S
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.2-cm gap electroporation cuvette BTX
96-well 2mL Deep-well plates Fisher 278743
96-well Maxisorp immunoplates Nunc 151759
Baffled flasks Corning
Benchtop centrifuge Eppendorf 5811000096
Centrifuge bottles Nalgene
ECM-630 electroporator BTX
Magnetic stir bars Nalgene
Thermo Fisher centrifuge Fisher
High speed shaker TAITEK MBR-034P
Microplate shaker QILINBEIER QB-9002
Liquid handler for 96 and 384 wells RAININ
Mutil-channel pipette RAININ E4XLS
Amicon concentrator Merck UFC803096

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References

  1. Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. (2017).
  2. Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9, (2), 167-181 (2017).
  3. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, (5517), 495-497 (1975).
  4. Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21, (11), 966-973 (1999).
  5. Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34, (12), 960-969 (2016).
  6. Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253, (18), 6551-6560 (1978).
  7. Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228, (4705), 1315-1317 (1985).
  8. Sidhu, S. S. Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. CRC Press. (2005).
  9. Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, (16), 8950-8954 (2000).
  10. Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8, (7), 1177-1194 (2016).
  11. Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2, (12), 682-688 (2006).
  12. Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
  13. Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, (2), 488-492 (1985).
  14. Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
  15. Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425, (4), 803-811 (2013).
  16. Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27, (1), 55-77 (2003).
  17. Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9, (8), 679-687 (2001).
  18. Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, (10), 5399-5404 (2000).
  19. Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58, (1), 10-17 (2012).
  20. Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
  21. Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31, (3), 169-217 (1994).
  22. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22, (25), 5600-5607 (1994).
  23. Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Second Edition, CRC Press. 157-180 (2006).
  24. Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12, (5), e0177574 (2017).
  25. Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring? Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
  26. Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81, (4), 645-670 (1979).
  27. Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492 (2015).
  28. Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16, (5), 3675-3700 (2011).
  29. Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics - the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28, (5), 538-544 (2011).
具有量身定做多样性的合成噬菌体展示库的构建
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Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S., Sidhu, S. S., Hou, S. c., Wu, D. Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity. J. Vis. Exp. (135), e57357, doi:10.3791/57357 (2018).More

Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S., Sidhu, S. S., Hou, S. c., Wu, D. Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity. J. Vis. Exp. (135), e57357, doi:10.3791/57357 (2018).

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