Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Byggingen av syntetisk Phage vises Fab biblioteket med skreddersydd mangfold

doi: 10.3791/57357 Published: May 1, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver en detaljert fremgangsmåte for bygging av en phage vises syntetiske antistoffer biblioteket med skreddersydd mangfold. Syntetisk antistoffer har bred programmer fra grunnforskning sykdom diagnostikk og therapeutics.

Abstract

Etterspørselen etter monoklonale antistoffer (mAbs) i grunnleggende forskning og medisin øker årlig. Hybridoma teknologi har vært dominerende metoden for mAb utvikling siden sin første rapport i 1975. Som et alternativ teknologi er phage visningsmetoder for mAb utvikling stadig mer attraktivt siden Humira, første phage-avledet antistoffer og en av de bestselgende mAbs, ble godkjent for klinisk behandling av revmatoid artritt i 2002. Som en ikke-dyr basert mAb programvareutvikling teknologi, forbigår phage visning antigen immunogenisitet, menneskeliggjøring og dyr vedlikehold som kreves fra tradisjonell hybridoma teknologi basert antistoff utvikling. I denne protokollen beskriver vi en metode for bygging av syntetisk phage vises Fab biblioteker med forskjeller av 109-1010 oppnåelig med en enkelt electroporation. Denne protokollen består av: 1) høy effektivitet electro-kompetent celle forberedelse; 2) utvinning av uracil inneholder én-strandet DNA (dU-ssDNA); 3) Kunkels metode basert oligonucleotide-rettet mutagenese; 4) electroporation og beregning av biblioteket størrelse; 5) protein A/L-baserte enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA) for folding og funksjonell mangfold evaluering; og 6) DNA sekvens analyse av mangfold.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

mAbs har bred programmer alt fra grunnleggende forskning til sykdom diagnostikk og therapeutics. I 2016, er mer enn 60 mAbs godkjent av USA Food and Drug Administration (USFDA) for klinisk behandling av autoimmune sykdommer, kreft og infeksjonssykdommer1,2.

I 1975 rapportert Kohler og Milstein en teknikk for kontinuerlig generasjon av antistoffer av en enkelt klonal spesifisitet fra en mobil kilde refereres til som "hybridomas" og denne teknikken har blitt en hjørnestein i medisin og industri3 ,4. Generering av mAbs av denne metoden krever ulike trinn inkludert antigen produksjon, musen immunisering, utvinning av B-lymfocytter, blanding av B-celler med myelom celler å danne udødelig hybridoma celler, klone utvalg, og terapeutiske programmer, menneskeliggjøring er nødvendig for å unngå menneskelig anti-musen antistoff (HAMA)4,5. Men for denne teknologien er antigener inkludert giftstoffer, patogener og høyt konservert proteiner relativt ineffektiv utløse en i vivo immunrespons mAb produksjon5.

I 1978 rapportert Hutchison et al. bruk av en oligonucleotide til direkte mutagenese av en rest i en enkelt-strandet bacteriophage virus6. I 1985 rapportert Smith at utenlandske genet fragmenter kan være smeltet i rammen med genet koding phage pels protein III og kan dermed vises på phage overflaten uten akkord dens infectivity7. Dette banebrytende works lagt et grunnlag for påfølgende bygging av phage vises antistoff biblioteker i immunforsvar, naiv og syntetisk danner med formatene av enkelt-kjeden variabel fragment (scFv) og antigen bindende fragment (Fab) for terapeutisk mAb utvikling8,9. Fra teknisk synspunkt, phage skjerm-baserte antistoff utvikling tilbyr en utfyllende tilnærming til hybridoma-baserte mAb utvikling som kan bidra til å omgå begrensningene noen antigener kan utgjøre og menneskeliggjøring prosess som hybridoma-avledet antistoffer krever ofte5. I 2016, 6 phage skjerm-avledet mAbs er godkjent i markedet inkludert Humira, en av de mest vellykkede mAbs brukes for behandling av revmatoid artritt, og mange phage skjerm-avledet antistoff kandidater er på ulike stadier av klinisk etterforskningen10.

For immunforsvaret og naiv phage antistoff biblioteker og mangfoldet av komplementaritet-bestemme regioner (CDRs) i lette og tunge kjede er avledet fra det naturlige immun repertoaret (dvs.fra B celler). I kontrast er mangfoldet av CDRs i syntetisk phage antistoff biblioteker helt kunstig. Syntetisk tilnærminger til biblioteket konstruksjon gir deg presis kontroll over utformingen av variasjonen og tilbyr muligheter for mekanistisk studier av antistoff struktur og funksjon11,12. Videre kan rammeverket for syntetiske biblioteker optimaliseres før biblioteket bygging å lette nedstrøms, større industriell utvikling11,12.

I 1985 Kunkel rapportert en enkelt-strandet DNA (ssDNA) mal-basert mutagenese tilnærming å innføre nettstedet-rettet mutasjoner i M13 bacteriophage effektivt13. Denne tilnærmingen ble senere brukt mye for bygging av phage vises biblioteker. Kjemisk syntetisert DNA oligonucleotides utformet for å innføre mangfold i Fab CDRs er innlemmet i en phagemid med et antistoff ryggraden mal. I denne prosessen, phagemid uttrykkes som en uracil som inneholder ssDNA (dU-ssDNA) og oligonucleotides er herdet til CDRs og utvidet til å syntetisere double-strandet DNA (dsDNA) i nærvær av T7 DNA utvalg og T4 DNA ligase. Til slutt, genererte ds-DNA kan bli introdusert i Escherichia coli av electroporation.

For høy diversitet, phage vises biblioteket konstruksjon, høy spenning electroporation av en to-komponent blanding av elektro-kompetent celler og covalently bør lukket sirkulær dsDNA (CCC-dsDNA) være forberedt nøye. Sidhu et al. endret utarbeidelse av elektro-kompetent celler og DNA fra tradisjonelle metoder og sterkt forbedret biblioteket mangfold14.

I denne protokollen beskriver vi en metode for bygging av syntetisk phage vises Fab biblioteker med forskjeller av 109-1010 oppnåelig med en enkelt electroporation. Figur 1 viser en oversikt over biblioteket bygging inkludert: 1) høy effektivitet electro-kompetent celle forberedelse; 2) utvinning av dU-ssDNA; 3) Kunkels metode basert oligonucleotide-rettet mutagenese; 4) electroporation og beregning av biblioteket størrelse; 5) protein A/L-baserte ELISA for folding og funksjonell mangfold evaluering; og 6) DNA sekvens analyse av mangfold. Alle reagenser, stammer og utstyr er oppført i materialet tabell. Tabell 1 viser reagens oppsettet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Merk: Filter sterilt tips må brukes gjennom når du arbeider med phage for å unngå forurensning pipette pistol og området rundt. Aseptiske området eller hette må brukes når behandling med bakterier og phage eksperimenter. Phage eksperiment området må renses opp med 2% natrium dodecyl sulfate (SDS) etterfulgt av 70% etanol phage forurensning unngås. For å gjøre føljetong fortynninger i denne protokollen, skal nye tips brukes for hver fortynning.

1. E. Coli SS320 Electro-kompetent celle forberedelse

  1. Pre varme LB/tet agar plate (forberedt og lagret på 4 ° C for mindre enn 1 - uke gamle) på 37 ° C inkubator for 1 h. Bruk en steril inokuleringen sløyfe eller sterilt tips for strek ut en glyserol lager av E. coli SS320 celler på forvarmes LB/tet agar platen i en sikk-sakk direc sjon forsiktig langs overflaten av platen. Inkuber platen på 37 ° C inkubator over natten for ca 12-15 h.
  2. Dagen bruk en steril inokuleringen sløyfe eller sterilt tips å plukke en godt atskilt enkelt koloni langs sikk-sakk og vaksinere i 10 mL av 2YT/tet medium i en 50-mL runde bunnen tube av dipping løkken til medium og stirring kort.
  3. Ruge på 37 ° C med skjelvende på 200 rpm rundt 3-4 h inntil OD600 nås på rundt 0,4 0,8 (Logg fase vekst). Skjermen OD600 på 2 timer. I denne perioden Forvarm 5 LB/tet agar plater (forberedt og lagret på 4 ° C for mindre enn 1 - uke gamle) i en 37 ° C inkubator minst 1t.
  4. Legge til 20 μL M13KO7 hjelper phage fra lab lager med titer rundt 1 x 1013 kolonien forming unit (cfu) /mL i 180 μL sterilt 1 X PBS i autoklaveres 1.5-mL rør å forberede 10 tidoble føljetong fortynninger.
  5. Aliquot 4 mL autoklaveres og flytende 2YT topp agar i 5 X 14 mL rundt bunnen rør, merke hver rør med en fortynning fra femte til niende av tidoble uttynnet, henholdsvis, og ruge i en 65 ° C inkubator å opprettholde 2YT topp agar i flytende form.
  6. Mix 500 μL Logg fase E. coli SS320 celler i M13KO7 fortynning røret (Velg femte tidoble fortynning til niende tidoble fortynning) og Inkuber i en 37 ° C inkubator i 5-10 min.
  7. Under incubation trinn 1.6, overføre 2YT topp agar fra trinn 1.5 til romtemperatur (RT) for å kjøle seg ned rundt 5 min til ca 42 ° C. Bruke indre håndleddet for å teste temperaturen på 2YT topp agar; Det burde være som flytende. Overføre hver fortynning blanding fra trinn 1.5 til hver tilsvarende 2YT topp agar rør. Skru lokket på hver rør og bland ved å snu opp ned flere ganger forsiktig og kort å unngå boble.
  8. Nøye hell hver blanding langs kanten av en pre varme LB/tet agar plate (fra trinn 1.3) og skråstilling plate litt å fullt og jevnt fyll tallerkenen med blandingen og unngå innføring av bobler. Oppbevare platene på RT for rundt 5-10 min å stivne den øverste agar innenfor hver plate og ruge 2YT topp agar platene på 37 ° C over natten for rundt 15-18 h.
  9. Velge fortynning platen etter overnatting vekst fra trinn 1.8 med rundt 100-200 gjennomsnittlig størrelse, enkelt, godt atskilt plaketter plakk vaksinering. Bruk én hånd for å holde agar platen mot en lyskilde og derimot å holde en pipette pistol lastet med lang sterilt pipette tips til loddrett dolke agar topp, og samle en enkelt og godt atskilt plakk.
    1. Skråstill pipette spissen litt å skille topp agar plakk. Pipetter opp og ned flere ganger for å løsne agar med plakett i en 14-mL runde bunnen kultur tube med 1 mL av 2YT/kan/tet medium (se tabell 1).
    2. Gjenta denne fremgangsmåten for å få 3-5 plaketter totalt. Formålet med plukke flere plaketter er å sikre vellykket inoculation, som en plakett kan være svak og relativt små sammenlignet med en bakterier koloni. Vokse plaketter 8 h på 37 ° C med skjelvende på 200 rpm.
  10. Overføre en tube vokser kultur i 50 mL av 2YT/kan/tet medium i en 250-mL forbløffet kolbe. Vokse i 37 ° C med skjelvende på 200 rpm over natten for rundt 12 h.
  11. Vaksinere tre 2-L forbløffet flasker med 900 mL av superbroth/tet/kan medium hver med 5 mL av natten kultur. Ruge på 37 ° C med skjelvende på 200 rpm for 6-7 h OD600 rundt 0,6 0,8.
  12. Chill i tre flasker av bakteriell kultur i en isbadet i 5 min med mild konstant virvlende for hånd. Følgende bør gjøres i en kjølerom, på is, med prechilled løsninger.
  13. Bruk absorbansen vev håndkle ytre glass hver kolbe; Bruk én hånd skråstille 1-L autoklaveres sentrifuge flasken på benken og derimot å helle mediet forsiktig hver kolbe til hver sentrifuge flaske.
  14. Spinne 5000 × g og 4 ° C i 10 min å pellets bakterier.
  15. Etter sentrifugering, forsiktig Dekanter nedbryting i en 5-liters autoklaveres avfall kanne.
  16. Fyll hver flaske med 100 mL steril-filtrert 1.0 mM HEPES, pH 7.4, og legge en autoklaveres magnetic røre bar til hver flaske til hjelp i pellet rørets 200 rpm. Virvel og løsne hele pellet fra flasken veggen hver flere minutter under omrøring magnetisk. Når pellet er oppløst, Fyll hver flaske med en ekstra 400 mL steril-filtrert 1.0 mM HEPES, pH 7.4.
  17. Sentrifuge 5000 × g og 4 ° C for 10 min. Decant nedbryting, beholde baren rør i flasken.
  18. Gjenta trinn 1,16 til 1.17 en gang.
  19. Resuspend hver pellet i 500 mL steril-filtrert, 10% ultrapure glyserol ved hjelp av rør barer. Virvel og løsne hele pellet fra flasken veggen hver flere minutter under omrøring magnetisk.
  20. Virvel og Dekanter som i trinn 1.17. Gjenta trinn 1,19 en gang. Bruke lang arm autoklaveres pinsett fjerne baren rør.
  21. Sentrifuge på 5000 × g og 4 ° C i 15 min. Decant nedbryting og fjerne eventuelle gjenværende spor av nedbryting fra hver sentrifuge flaske med en pipette.
  22. Legge til 3.0 mL 10% ultrapure glyserol i en flaske og forsiktig resuspend pellet av pipettering. Overføre suspensjon til neste flaske og gjenta til alle pellets er resuspended og samles i en flaske. Ca 6 mL av svært konsentrert celler oppnås med en titer rundt 3 x 1011 cfu/mL.
  23. Pre chill 1.5-mL autoklaveres microcentrifuge rør og en 96-brønns tube oppbevaringsboks uten skillevegger ved-80 ° C for minst 1 time før dette trinnet. Overføre pre kjølt microcentrifuge rør til kalde rommet på is før pipettering dele celle pellet suspensjon. Bruke en pipette til aliquot 350 μL celle suspensjon i hver 1,5 mL microcentrifuge rør.
  24. Overføre dele i et skum boks beholder fylt med flytende nitrogen for flash fryse (3-5 min).
    1. Transportere boksen skum med flytende nitrogen til-80 ° C fryser (se trinn 1,23).
    2. Fjerne boksen 1.5-mL microcentrifuge tube lagring fra fryseren-80 ° C (se trinn 1,23) og lagt på is.
    3. Raskt bruke et metallnett sil dele fra flytende nitrogen og plassere dem i boksen tube lagring. Butikken på-80 ° C.
      FORSIKTIG: Flytende nitrogen kan forårsake brannskader og omsorg må tas for sikkerhet beskyttelse. Bruk en Fab ryggraden phagemid å kontrollere effektiviteten av forberedt electro-kompetent cellene (Fab ryggraden phagemid aksjen skal være i ultrapure (MilliQ) vann på 400 ng/µL). Tine 1 μg av Fab ryggraden phagemid i 10 µL ultrapure vann og en 350 μL aliquot av elektro-kompetent SS320 på is, og prechill 0,2-cm mellomrom electroporation søppel på is.
  25. Legg 350 μL electro-kompetent SS320 cellene til 10 µL DNA etter tining og bland av pipettering flere ganger samtidig blandinger på is. Unngå å innføre bobler.
  26. Forvarm 15 mL SOC medium i en 50-mL tube i et vannbad 37 ° C i minst 30 min før electroporation. Overføre 360 μL blandingen til cuvette og utfører electroporation etter produsentens instruksjoner.
  27. Umiddelbart redde cellene etter electroporation ved å legge 1 mL av forvarmes SOC medium (fra trinn 1.27) og pipettering. Overføre medium fra cuvette til en 125 mL kolbe forhåndslastet med 5 mL forvarmes SOC.
  28. Skyll cuvette to ganger, hver gang med 1 mL av forvarmes SOC medium og overføre mediet til 125mL kolbe (se trinn 1.27). Legg forvarmes SOC medium til et endelig antall 10 mL til 125mL kolbe.
  29. Inkuber 10-mL cellekultur i 30 min på 37 ° C med skjelvende på 200 rpm.
  30. Gjøre føljetong fortynninger å bestemme hva effektivitet og M13KO7 pre-infeksjon rate.
    1. Bruk en flerkanals pipette til 180 μL 2YT media hver brønn i en enkelt kolonne med en 96-microwell plate.
    2. Gjøre 8 tidoblet føljetong fortynninger: overføre 20 μL kultur fra trinn 1,29 til den første brønnen av plate, blanding av pipettering og føre 20 μL blandingen til neste godt. Gjenta dette trinnet til slutten av føljetong fortynning.
    3. Plate 10 μL av hver serielle fortynning på LB/carb og LB/kan LB/tet platene i duplikat.
    4. Ruge over natten på 37 ° C.
    5. Effektivitet beregningsformel: anta at M er hvor gjennomsnittlig kolonien regnet fra utvannet fold 10N (N er 1-8). E. coli SS320 electro-kompetent celle transfection effektiviteten av Fab ryggraden phagemid fra LB/carb plate er M X 10N + 3 cfu/µg. M13KO7 før infeksjonen hastigheten er beregnet på forholdet mellom koloniene i LB/kan og LB/tet. Prosentandelen av E. coli SS320 kompetent celler transfekterte med Fab ryggraden phagemid anslås på forholdet mellom koloniene i LB/carb og LB/kan.

2. klargjør Uracil inneholder ssDNA (dU-ssDNA) fra malen Phagemid

Merk: A tidligere rapporterte Fab ryggraden phagemid ble brukt som mal for dU-ssDNA forberedelse15. Arkitekturen av Fab ryggraden phagemid er vist i figur 2. En plasmider spinn kit (QIAprep Spin M13) brukes for utvinning av dU-ssDNA med små modifikasjoner.

  1. Forvarm en LB/cmp plate (forberedt og lagret på 4 ° C for mindre enn 1 - uke gamle) i en 37 ° C inkubator for 1 h. strek ut en glyserol lager av E. coli CJ236 cellene (eller en annen dut−/ung− belastning) med sterilt looper eller tips til forvarmes LB/cmp platen. Inkuber platen ved 37 ° C over natten i rundt 12-15 h.
  2. Plukk en enkelt koloni med sterilt tips og vaksinere i 2 mL 2YT/cmp medium i en 14-mL polypropylen runde bunn rør.
  3. Inkuber middels på 37 ° C med skjelvende på 200 rpm 3-4 h inntil OD600 nås på rundt 0,4 0,8 (Logg fase vekst).
  4. Legge til 5-10 μL phage av Fab ryggraden i kulturen og ruge på 37 ° C med skjelvende på 200 rpm i 30 min å tillate phage infeksjon.
  5. Etter inkubasjon bruk et sterilt tips for strek ut 10 μL kultur på en forvarmes LB/carb tallerken på 37 ° C. Inkuber ved 37 ° C over natten i rundt 12-15 h.
  6. Velg en enkelt koloni av E. coli CJ236 inneholder Fab ryggraden phagemid å vaksinere et forrett kulturen i 3 mL 2YT/carb/cmp i et 14-mL polypropylen runde bunn rør, og vokse på 37 ° C med skjelvende på 200 rpm over natten for rundt 12 h.
  7. Vaksinere av startkulturer som 0,3 mL til 30 mL 2YT/carb/cmp i en 250-mL forbløffet flaske.
  8. Inkuber cellekultur på 37 ° C med skjelvende på 200 rpm 3-4 h inntil OD600 nås på rundt 0,4 0,8 (Logg fase vekst).
  9. Legg til M13KO7 (lab lager, titer ca 1 x 1013 cfu/ml) til kulturen fra trinn 2.8 med et mangfold av infeksjon (MOI) i ca 10 og den endelige titer av M13KO7 er ca 1 x 1010 cfu/mL.
  10. Inkuber ved 200 rpm og 37 ° C i 1 time.
  11. Pellets kulturen med sentrifugering i et 50-mL runde bunn rør på 5000 × g og 25 ° C for 20 min.
  12. Dekanter nedbryting og resuspend pellets med 30 mL av fersk 2YT/carb/kan/uridine. Overfør rørets til en ny 250-mL forbløffet flaske.
  13. Inkuber ved 200 rpm og 25 ° C 22-24 h.
  14. Overføre kulturen fra trinn 2.13 til en 50-mL runde bunn rør og sentrifuge kulturen på 12.000 × g for 20 min for å skille phage supernatant fra bakteriell celle pellets. Overføre phage supernatant til en ny 50 mL runde bunn tube og legge til 1/5 det siste bindet PEG/NaCl løsningen å fremskynde phage. Bland godt og ruge på is 30 min å utløse phage partikler.
  15. Sentrifuge 12.000 × g og 4 ° C for 30 min. Decant nedbryting og sentrifuge på 4000 × g og 4 ° C for 2 min. Sug opp gjenværende nedbryting.
  16. Resuspend phage pellets i 2 mL steril-filtrert 1 X PBS og overføring til 1.5-mL microcentrifuge rør. Sentrifuge 12.000 × g i 5 minutter i en Borstemmaskin microcentrifuge Fjern gjenværende bakteriell rusk og overføre phage supernatant til nye 1.5-mL microcentrifuge rør og lagre på 4 ° C.
  17. Sjekk uracil innlemmelse effektiviteten i E. coli CJ236 gjennom side ved side sammenligning med E. coli SS320.
    1. Legg til 180 μL 2YT media hver brønn i én enkelt rad av en 96-brønns plate.
    2. Gjør ti 10-fold føljetong fortynninger: overføre 20 μL phage supernatant til den første brønnen av platen, blande av pipettering og overføre 20 μL blandingen til neste godt. Gjenta dette trinnet til slutten av føljetong fortynning.
    3. Legge til 10 μL phage fra siste åtte serial fortynninger å infisere 90 μL av E. coli CJ236 og E. coli SS320 i loggen fase (OD600 = 0,4 0,8). Ruge på 37 ° C i 30 min med mild risting.
    4. Plate 10 μL fra føljetong fortynning av hver infeksjon i E. coli CJ236 og E. coli SS320 på 2YT/Carb plater i duplikat.
    5. Ruge over natten på 37 ° C.
    6. Titer beregningsformel: anta at M er hvor gjennomsnittlig kolonien regnet fra utvannet fold 10N (N er 1-10). Titer fra E. coli CJ236 eller E. coli SS320 tilsvarer M X 10N + 2 cfu/mL. Beregne effektiviteten av uracil innlemmelse fra titer forholdet av E. coli CJ236 og E. coli SS320.
  18. Legg 1/100 volum phage nedbør bufferstørrelsen MP i phage supernatant i 1,5-mL microcentrifuge rør, og slå opp ned forsiktig for å blande for flere ganger. Ruge på RT for minst 2 min. Phage partikler er utløst fra kultur medium, og dermed en skyet løsning skal være synlig på dette punktet.
  19. Bruk eksemplet fra trinn 2,18 i en plasmider spinn kolonne (f.eksQIAprep) i en 1.5-mL microcentrifuge tube. Bindende kapasiteten til én spinn-kolonnen for ssDNA kan nå minst 10 µg. sentrifuge på 6000 × g og 25 ° C for 30 s i en Borstemmaskin microcentrifuge. Kast gjennomflytsenhet i 1,5-mL microcentrifuge røret. Phage partikler forblir bundet til kolonne matrix på dette stadiet.
  20. Legg til 0,7 mL av UT-MLB phage lyse og bindende buffer (se diskusjon) til kolonnen og ruge på RT for minst 1 min.  Sentrifuge 6000 x g og 25 ° C for 30 s og kast gjennomflytsenhet.
  21. Legg til en annen 0,7 mL av UT-MLB bufferen og ruge på RT for minst 1 min.
  22. Sentrifuge 6000 × g for 30 s. kast gjennomflytsenhet. På dette stadiet, er phage strøk protein separert fra dU-ssDNA, som forblir bundet til kolonne matrix.
  23. Legge til 0,7 mL vaske bufferen PE inneholder etanol følge instruksjonene fra produsenten. Sentrifuge 6000 × g for 30 s og kast gjennomflytsenhet.
  24. Gjenta trinn 2,23, så sentrifuge igjen på 6000 × g for 30 å fjerne gjenværende buffer PE.
  25. Overføre kolonnen til en ny 1.5-mL microcentrifuge tube og tilsett 100 μL av elueringsbufferen EB (10 mM Tris· CL, pH 8.5) til midten av kolonnen membranen.
  26. Ruge på RT for 10 min og sentrifuger 6000 × g for 1 min til elute dU-ssDNA. Ca, 1.5-2.5 μg dU-ssDNA/mL kultur kan oppnås.
  27. Analysere eluted DNA ved electrophoresing 1 μL på en 1% agarose TAE gel. DNA skal vises som et overveiende enkelt band med ingen smøre.
  28. Bestemme DNA konsentrasjonen av måler absorbansen på et nanodrop spektrofotometer på 260 nm (en260 = 1.0 for 33 ng/μL av ssDNA). Typisk dU-ssDNA konsentrasjoner er 200-500 ng/μL.

3. Kunkels metode basert Oligonucleotide-rettet mutagenese

Merknader: Det anbefales å drive småskala reaksjoner før fullskala reaksjoner å sikre kvaliteten på mutagene oligonucleotide og reaksjonen komponentene. En tegneserie fra Kunkels metode basert rettet oligonucleotide-mutagenese er vist i Figur 3. Ulike aminosyre forskjeller blir introdusert i CDRH1, CDRH2, CDRH3 og CDRL3 områder IMGT nummerering nomenklatur16 (tabell 2). Den teoretiske aminosyre mangfoldet av hver CDR, totalt teoretisk aminosyre mangfold og oligonucleotide sekvenser er oppført i tabell 2.

  1. Oligonucleotide fosforylering med T4 polynucleotide kinase
    1. Kombinere 0,6 μg av mutagene oligonucleotides, beregnet å mutere en enkelt CDR, med 2 μL 10 X TM buffer, 2 μL 10 mM ATP og 1 μL 100 mM DTT. Legg ultrapure H2O til et totalt volum på 18 μL i en 1.5-mL tube. Biblioteket konstruksjon, er 4 separate og parallelle fosforylering reaksjoner satt opp tilsvarende CDRH1, CDRH2, CDRH3 og CDRL3, henholdsvis.
    2. Legge til 20 U (2 uL) av T4 polynucleotide kinase hver rør og Inkuber 1t på 37 ° C (reaksjon 1 i tabell 3). Bruk umiddelbart for avspenning.
  2. Avspenning av oligonucleotides i malen
    1. 20 μg dU-ssDNA mal, legge 25 μL 10 X TM buffer, 20 μL hver fosforylert oligonucleotide løsning, og ultrapure H2O til en endelig mengde 250 μL i en 0,5 mL tube. Bland godt og overføre til 0,20 mL PCR rør (50 μL hver) reaksjon 2 i tabell 3. Disse DNA antallene gir molar forholdet 3:1 mellom oligonucleotide og malen, forutsatt at lengden forholdet mellom oligonucleotide og malen er 1: 100.
    2. Inkuber reaksjonen i en PCR maskin ved 90 ° C for 3 min, 50 ° C i 3 minutter, og 20 ° C i 5 minutter.
  3. Enzymatisk syntese av CCC-dsDNA
    1. Til 250 μL herdet oligonucleotide/mal blanding, legge 10 μL 10 mM ATP, 10 μL 25 mM dNTP blanding, 15 μL 100 mM DTT, 30 Weiss enheter T4 DNA ligase og 30 U T7 DNA utvalg som reaksjon 3 i tabell 3.
    2. Inkuber reaksjonen i 1,5-mL tube ved 20 ° C over natten.
    3. Vask og konsentrere syntetisert CCC-dsDNA i en 0,5 mL sentrifugal filter enhet med en 30 kDa pore størrelse membran på RT.
      1. Overføre overnatter reaksjonsblandingen til filter enheten og legge ultrapure H2O til 400 µL siste volum. Spin 14.000 × g i 10 min; volumet er mindre enn 50 μL.
      2. Forkaste flyten gjennom, legge til 400 µL ultrapure H2O i filteret og spinne 14.000 × g i 10 min.
      3. Gjenta trinn 3.3.3.2 igjen.
      4. Plass filteret opp ned i en ren microcentrifuge tube gjenopprette CCC-dsDNA. Spinn på 1000 × g i 2 minutter; gjenopprettede volumet er vanligvis rundt 20-40 μL. Den gjenopprettede CCC-dsDNA kan brukes umiddelbart for electroporation av E. coli eller frosset ved 20 ° C for senere bruk. Vanligvis 20-40 μg CCC-DNA kan oppnås.
    4. Electrophorese 1.0 µL av elut reaksjonen produktet sammen med malen dU-ssDNA å visualisere resultatet av reaksjonen.

4. Electroporation og beregning av biblioteket størrelse

  1. Chill renset CCC-dsDNA (20 μg i et maksimalt volum på 50 μL) i en 1.5-mL microcentrifuge tube og 0,2-cm mellomrom electroporation søppel på is.
  2. Forvarm 20 mL SOC media i et 50-mL polypropylen konisk sentrifuge rør i 37 ° C vannbad i minst 30 min.
  3. Tine en 350 μL aliquot av elektro-kompetent E. coli SS320 på is. Legge celler til DNA og blanding grundig av pipettering flere ganger. Unngå å innføre bobler.
  4. Overføre blandingen til cuvette og utfører electroporation etter produsentens instruksjoner. For eksempel når BTX ECM-630 electroporation systemet brukes, er relevante innstillingene 2,5 kV feltstyrke 125 Ω motstand og 50 µF kapasitans.
  5. Umiddelbart redde electroporated cellene ved å legge 1 mL av forvarmes SOC medium og overføring til 17 mL av SOC medium i en 125mL kolbe. Skyll cuvette to ganger med 1 mL av SOC medium og overføring til samme kolbe (siste bindet er 20 mL).
  6. Inkuber i 30 min på 37 ° C med skjelvende på 200 rpm.
  7. Bestemme electroporation effektivitet.
    1. Legg til 180 μL 2YT media i hver brønn i en enkelt kolonne med en 96-microwell plate.
    2. Gjøre 8 ti-fold føljetong fortynninger: overføre 20 μL av 20-mL kulturen til den første brønnen av platen, bland med pipettering og overføre 20 μL blandingen til neste godt. Gjenta dette trinnet til slutten av føljetong fortynning.
    3. Plate 10 μL av hver av de serielle fortynninger på én LB/carb plate i duplikat. Plate 100 µL gjenværende fra hver av de serielle fortynninger på separate LB/carb plater kolonien teller kryssjekke. Disse platene gir også enkelt kloner for ELISA og rekkefølgen analyse (se avsnitt 5).
    4. Ruge over natten på 37 ° C.
    5. Telle koloniene fra 10 μL duplikater på LB/carb tallerkenen. Anta at M er gjennomsnittlig kolonien tall telles på 10N brett LB/carb plate (N er 1-8). Totalt biblioteket størrelse er 2 M X 10N + 3 kolonier.
  8. Aliquot kulturen fra trinn 4.6 like i to 2-L forbløffet flasker, hver med 500 mL av 2YT/carb/kan medium for phage biblioteket generasjon.
  9. Ruge på 37 ° C med skjelvende på 200 rpm over natten på rundt 16 h.
  10. Overføre kulturen til to 1-L autoklaveres sentrifuge flasker og sentrifuge for 30 min 12.000 × g på 4 ° C.
  11. Overføre nedbryting til to nye 1-L autoklaveres sentrifuge flasker og legge til 1/5 det siste bindet PEG/NaCl løsningen å fremskynde phage. Ruge på is 30 min.
  12. Sentrifuge for 30 min 12.000 × g og 4 ° C. Nøye Dekanter nedbryting og unngå å forstyrre av phage pellets. Spinn for 1 min 4000 x g og fjerne gjenværende nedbryting med en pipette.
  13. Resuspend phage pellets med 20 mL steril-filtrert 1 X PBS buffer og overføre til en ny 50 mL tube.
  14. Pellets uløselig saken av sentrifugering for 5 min på 12.000 × g og 4 ° C. Overføre nedbryting til en ny 50 mL tube.
  15. Måle phage konsentrasjonen av spektrofotometer (OD268 = 1.0 for en løsning av 5 X 1012 phage/mL).
  16. Justere phage konsentrasjonen til 5 X 1012 phage/mL i 1 X PBS med 10% ultrapure glyserol.
  17. Aliquot 1 mL av phage løsning per 1.5-mL microcentrifuge tube. Bruk bibliotekene umiddelbart for panorering eller lagre på-80 ° C.

5. kvalitetsvurdering av Protein A / L direkte bindende ELISA analysen og sekvensering

  1. Tilfeldig plukke 96 enkelt kolonier på LB/carb plate fra trinn 4.7.3 i en 96-dyp godt kultur plate inneholder 800 μL 2YT/carb i hver brønn. Inkuber for 3-4 h på 37 ° C med skjelvende på 1000 rpm OD600 = 0,4 0,8.
  2. Tilsett 100 μL av M13KO7 (1 X 1011 cfu/mL) hver brønn av en 96-dyp godt kultur plate med en flerkanals pipette. Ruge på 37 ° C med skjelvende på 1000 rpm 1t.
  3. Tilsett 100 μL av 2YT som inneholder 10 X konsentrasjonen av kanamycin (500 μg/mL) hver brønn med en flerkanals pipette. Ruge over natten på 37 ° C med skjelvende på 1000 rpm.
  4. Oppløse protein L til 1 µg/mL i 1 X PBS. Lag 3/4 av brønnene i en 384-vel høy protein-bindende polystyren plate med 30 µL/godt av protein L løsningen. Ruge over natten på 4 ° C.
  5. Kast overnatting protein L belegg løsningen fra trinn 5.4. Legge til 50 µL av M-PBST (den blokkerer løsningen) til alle brønnene i 384-vel høy protein-bindende polystyren platen med en flerkanals pipette. Inkuber platene på en microplate shaker 1t på RT.
  6. Nedspinning overnatting kulturen fra trinn 5.3 i en dyp 96-brønnen plate 3000 x g i 10 min på 4 ° C. Phage er nedbryting.
  7. Kast blokkerer løsningen fra trinn 5.5. Legge til 15 μL M-PBST og 15 μL av hver phage supernatant (trinn 5.6) 3 av protein L belagt som tre eksemplarer og 1 ikke-belagt godt negativ kontroll med en flerkanals pipette. Ruge på RT 1t med skjelvende på 200 rpm.
  8. Kaste det phage løsningen. Vaske platen 6 ganger med 80 μL PBST av en automatisert plate skive.
  9. Legg 15 μL M-PBST og 15 μL av Protein A-HRP (1:1, 500 fortynnet i 1 X PBS) hver brønn med en flerkanals pipette, og ruge på RT 1t med skjelvende på ca 200 rpm.
  10. Kast Protein A-HRP/M-PBST løsningen. Vaske platen 6 ganger med 80 μL PBST.
  11. Legg TMB-substratet (30 μL/vel) med en flerkanals pipette og ruge for 2-3 minutter til fargen utvikler. Stopp reaksjon med 1,0 M H3PO4 (30 μL/vel).
  12. Lese platene spektrofotometrisk ved 450 nm. Positiv kloner er definert som de som viser en gjennomsnittlig forholdet mellom OD450 absorbansen protein L brønner til M-PBST også større enn 3.0.
  13. I en 96-dyp Vel, infisere 50 μL av SS320 i 2YT/tet på loggen fase med 5 μL den samme phage brukes for ELISA (trinn 5.6) for 30 min på RT.
  14. Legg 950 μL 2YT/carb i 96-deep godt fra trinn 5.13 og ruge over natten på 37 ° C med skjelvende på 1000 rpm.
  15. Pakk ut phagemid DNA av mini prep DNA utvinning. Bruke oppstrøms primerne av VL (5'-TCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTA-3 ") og VH (5'-GACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCG-3") for sekvensen analyse å anslå variasjonen i biblioteket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Følgende flytdiagram for Fab biblioteket bygging (se figur 1), vi forberedt M13KO7 hjelper phage pre infisert E. coli SS320 electro-kompetent celler. Effektiviteten av disse electro-kompetent cellene er beregnet som 2 X 109 cfu/µg når Fab phagemid ryggraden for biblioteket bygging ble brukt (Figur 4).

Uracil innlemmelse effektiviteten ble ved sammenligning av titer i både E. coli CJ236 og E. coli SS320 celler kontrollert. E. coli CJ236 og E. coli SS320 cellene var infisert av phage skjuler dU-ssDNA. E. coli SS320 er enzymer (dUTPase og uracil glycosylase) som kan redusere uracil inneholder DNA, mens E. coli CJ236 mangler disse enzymer og ikke svekke uracil inneholder DNA. For å oppnå en akseptabel uracil innlemmelse effektivitet, må titers fra E. coli CJ236 være minst 104 ganger høyere enn fra E. coli SS320. Ellers øker vill-type befolkningen i konstruert antistoffer biblioteket på grunn av ineffektiv uracil innlemmelse. Figur 5 viste at titer fra E. coli CJ236 er ca 3 X 105 ganger høyere enn fra E. coli SS320, som indikerer en effektiv uracil innlemmelse i phage ssDNA.

Neste, vi forberedt og utdraget dU-ssDNA. DU-ssDNA renhet kontrolleres av agarose gel geleelektroforese (figur 6). Oligonucleotide-rettet mutagenese ble gjennomført og effektiviteten av dU-ssDNA konvertering til CCC-DNA ble evaluert (figur 6). Tre produkter med lavere motilitet enn dU-ssDNA kan visualiseres på gel inkludert raskeste kjører bandet (CCC-dsDNA), midt svak bandet (nicked band) og laveste-kjører bandet (strand-fortrenges DNA).

Etter electroporation i E. coli SS320, biblioteket størrelse ble beregnet fra overnatting inkubasjon platen (se trinn 4.7.5). Gjennomsnittlig biblioteket størrelse var 5 X 109 fra like føljetong fortynninger på LB/carb plater (figur 7). Den beregnede størrelsen på dette trinnet kan imidlertid inneholde phage som ikke vise produksjonslokaler både på grunn av en frameshift eller stoppe codon eller vise misfolded produksjonslokaler både. Sekvensering og ELISA ble brukt til å beregne funksjonelle mangfoldet av konstruert bibliotek. 96 tilfeldig plukket enkelt kloner ble sendt for sekvensering analyse. Tabell 4 viser at 90 av de 96 tilfeldig plukket enkelt Klonene var vellykket sekvensert, som inneholder 70 kloner uten en tidlig stopp codon (53 kloner med minst én CDR mutant) og 17 kloner med vill-type sekvensen og 20 kloner med en tidlig stopp codon på ulike regioner. I 70 kloner er muterte CDRH1, CDRH2, CDRH3 og CDRL3 50%, 57%, 53% og 56%, henholdsvis, mens mutant med minst én CDR er 76%. I de 20 Klonene med en tidlig stopp codon (90%), ble tidlig stopp codon hovedsakelig avledet fra frameshift i oligonucleotide mutagenese primere, inkludert 45% (CDRH1), 10% (CDRH2), 15% (CDRH3) og 20% (CDRL3).

Å oppdage visning av riktig foldet produksjonslokaler både, et protein A / L basert ELISA var ansatt som det er kjent at protein A og protein L kan gjenkjenne riktig folding av VH rammen og VL rammeverk, henholdsvis17,18. Med sekvensering analysen viste ELISA-analysen i tre eksemplarer (Figur 8) at 20 clones med en tidlig stopp codon var alle negative mens 17 kloner med en vill-type sekvens var alle positive når positivt forholdet var empirisk satt til 3.0. For 53 clones med minst én CDR mutant var 43 kloner positiv i ELISA mens 10 kloner var negativ. Dette betyr at de fleste kloner ble også kastet mens CDRs fra 10 kloner kan ha skadevirkninger Fab folding. Totalt 43 kloner av 90 kloner (48%) ble også kastet og inneholdt minst ett CDR mutant. Dermed funksjonelle aminosyre mangfoldet av konstruert biblioteket basert på protein A / L ELISA og sekvensen ble anslått til 2,4 X 109 (dvs., 48% av 5 X 10-9).

Figure 1
Figur 1: oversikt over phage vises Fab biblioteket byggingen. Phage vises Fab biblioteket byggingen følger en grunnleggende serie trinn. Det innebærer utarbeidelse av høy effektivitet electro-kompetent bakterielle celler, utvinning av dU-ssDNA, Kunkels metode basert oligonucleotide-rettet mutagenese, electroporation og beregning av phage Fab biblioteket størrelse, funksjonelle evaluering av protein A / L ELISA og DNA sekvens analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Phagemid-arkitekturen for bygging Fab biblioteket. De grunnleggende funksjonene i phagemid ryggraden består av opprinnelsen til single-strandet (f1 ori) og dobbelttrådet (dsDNA ori) DNA replikering og en ampicillin/carbenicillin motstand genet (AmpR). Fab vises, under kontroll av alkalisk fosfatase selskapet (PhoA), phagemid inneholder en bicistronic kassett til stasjonen uttrykk og sekresjon av: lys kjeden (Langbane) som består av et sekret signal, VL (variable regionen av lys), CL (konstant regionen av lys), og C-terminalen flagg tag; og tunge kjede (HC) som består av sekret signal, VH (variable regionen av tunge kjeden) og CH1 (konstant region 1 av tunge kjeden) smeltet sammen med en p3 phage mindre pels protein. Forsamlingen av lys kjeden og tunge kjeden Fab i E. coli periplasm styrer visning av Fab på phage overflaten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: skjematisk Kunkels metode basert oligonucleotide-rettet mutagenese. I denne protokollen brukte vi Kunkels metoden for å forberede dU-ssDNA mal. Oligonucleotides for CDRH1, CDRH2, CDRH3 og CDRL3 med designet mangfold fosforylert, herdet til malen og brukes til å konvertere ss-DNA til CCC-dsDNA. Etter electroporation i E. coli SS320 electro-kompetent celler, heteroduplex DNA er reparert vill-type eller mutant skjemaet. Av uracil i vill type strand, reparasjonsprosessen favoriserer skjemaet mutant, og dermed skjemaet mutant dominerer biblioteket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Anslag over M13KO7 pre infisert E. coli SS320 electro-kompetent cell effektivitet. En phagemid ryggraden vektor ble brukt til å sjekke electroporation effektiviteten av kompetente cellene. Formel for å beregne effektiviteten er som følger: anta at M er hvor gjennomsnittlig kolonien regnet fra mest utvannet fold 10N (N er 1-8) i duplikat. E. coli SS320 effektivitet fra LB/carb plate tilsvarer M X 10N + 3 cfu/µg. Effektiviteten av elektro-kompetent cellene er rundt 2 X 109 cfu / µg. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Vurdering av uracil innlemmelse i ssDNA av phage infeksjon med E. coli CJ236 og E. coli SS320 celler. Basert på Kunkels metode, uracil innlemmelse effektiviteten kontrolleres av sammenligning av phage infeksjon titer i både E. coli CJ236 og E. coli SS320 celler. Formelen for beregning av titer er som følger: anta at M er hvor gjennomsnittlig kolonien regnet fra mest utvannet fold 10N (N er 1-10), og at titer fra E. coli CJ236 eller E. coli SS320 er lik M X 10N + 2 cfu/mL. Effektiviteten av uracil innlemmelse kan estimeres fra titer forholdet E. coli CJ236 og E. coli SS320. Titer i E. coli CJ236 ble 9 X 1012 cfu/mL titer i E. coli SS320 3 X 107 cfu/mL. Titer forholdet E. coli CJ236 og E. coli SS320 var 3 X 105. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: konvertering av dU-ssDNA til CCC-DNA av oligonucleotide-rettet mutagenese. Etter oligonucleotide-rettet mutagenese, effektiviteten til dU-ssDNA konvertering til CCC-DNA ble evaluert. dU-ssDNA ble helt konvertert til dsDNA. Dominerende bandet er CCC-dsDNA mens det er en mindre del av nicked dsDNA og strand-fortrenges DNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Phage titrering for beregning av biblioteket størrelse. Etter electroporation i E. coli SS320, ble biblioteket størrelse anslått av føljetong fortynninger på LB/carb plater. Formelen for beregning av størrelsen er som følger: ta M er hvor gjennomsnittlig kolonien regnet fra mest utvannet fold 10N fra en 2YT/Carb plate (N er 1-8), størrelsen er lik 2 M X 10N + 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: Protein A / L direkte bindende phage ELISA. Protein L kan gjenkjenne rammen av godt foldet kappa lys kjeden VL og protein en kan gjenkjenne rammen av godt foldet tunge kjeden VH. Binding av Fab med protein L og A angir riktig folding av både tung kjetting og lys kjeden. I korthet, protein L i tre eksemplarer og kontrollen negative M-PBST ble belagt til platen, Fab phage supernatants fra forskjellige kloner ble inkubert med protein L og M-PBST, så etter vask, protein A-HRP ble brukt til å fange bundet Fab phage. Phage ELISA opplesninger viste 90 tilfeldig plukket kloner med vellykkede sekvensering avlesning. En terskelverdi line representerer klone som positive var empirisk definert hvor forholdet mellom OD450 absorbansen verdien fra protein L (gjennomsnitt på tre eksemplarer med feilfelt) versus negativ kontroll var mer enn 3.0. Tre grupper basert på sekvensering analyse ble vist, tilsvarer en mutant uten stopp codon i rødt (53 kloner), vill-type (WT) i blå (17 kloner) og mutant med stopp codon i grønt (20 kloner). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Reagens oppsett Komponent Beløp kommentarer/beskrivelse
2YT medium Gjærekstrakt 10 g Legge ultrapure vann utgjør volumet til 1,0 L, justere pH 7.0, autoclave.
Tryptone 16 g
NaCl 5 g
2YT øverste agar Gjærekstrakt 10 g Legg ultrapure vann for å gjøre opp volumet til 1,0 L og justere pH 7.0, varme å oppløse, autoclave.
Tryptone 16 g
NaCl 5 g
Granulert agar 7.5 g
2YT/carb/cmp medium Carbenicillin 100 μg/mL
Chloramphenicol 10 μg/mL
2YT/carb/kan/uridine medium Carbenicillin 100 μg/mL
Kanamycin 50 μg/mL
Uridine 0,25 μg/mL
2YT/carb/tet medium Carbenicillin 100 μg/mL
Tetracycline 10 μg/mL
2YT/carb medium Carbenicilin 100 μg/mL
2YT/kan medium Kanamycin 50 μg/mL
2YT/kan/tet medium Kanamycin 50 μg/mL
Tetracycline 10 μg/mL
2YT/tet medium Tetracycline 10 μg/mL
2YT/cmp medium Chloramphenicol 10 μg/mL
LB middels agar Gjærekstrakt 5 g Legge ultrapure vann utgjør volumet til 1,0 L, justere pH 7.0, autoclave. LB agar, legge til 20 g granulert agar, autoclave.
Tryptone 10 g
NaCl 10 g
LB/carb plater LB agar 1L
Carbenicillin 100 μg/mL
LB/tet plater LB agar 1 L
Tetracycline 10 μg/mL
LB/cmp plater Chloramphenicol 10 μg/mL
LB/kan plater Kanamycin 50 μg/mL
SOC medium Gjærekstrakt 5 g Legge til ultrapure vann for å lage opp volumet til 1,0 L og justere pH 7.0, autoclave.
Tryptone 20 g
NaCl 0,5 g
KCl 0.2 g
2,0 M MgCl2 5.0 mL
1,0 M glukose 20 mL
Superbroth medium Tryptone 12 g Legg til ultrapure vann til 900 mL, autoklav, legge til 100 mL autoklaveres 0,17 M KH2PO4, 0,72 M K2HPO4.
Gjærekstrakt 24 g
Glyserol 5 mL
Superbroth kan/tet medium Kanamycin 50 μg/mL
Tetracycline 10 μg/mL
1 X PBS NaCl 137 mM Justere pH til 7.2, autoclave.
KCl 3 mM
Na2HPO4 8 mM
KH2PO4 1.5 mM
TAE/agarose gel TAE buffer
Agarose 1% (w/v)
GelRed 1:10000 (v/v)
TMB-substratet TMB 50% (v/v)
H2O2 peroxidase substrat 50% (v/v)
M-PBST buffer 1 X PBS 100 ml
Tween-20 0,05% (v/v)
IKKE-fett pulverisert melk 5% (v/v)
5 X PEG/NaCl PEG-8000 20% (w/v) Legg ultrapure vann utgjør volumet 1L og autoclave.
NaCl 2.5 M
PBST buffer 1 X PBS 1 L 0.22 μm filter-sterilisere.
Tween-20 0,05% (v/v)
10 x TM buffer MgCl2 0.1 M Justere pH til 7.5.
Tris 0,5 M
1.0 mM HEPES, pH 7.4 1,0 M HEPES 4.0 mL 0.22 μm filter-sterilisere.
Ultrapure vann 4.0 L
10% (v/v) ultrapure glyserol Ultrapure glyserol 100 ml 0.22 μm filter-sterilisere.
Ultrapure vann 900 mL
Ultrapure vann H20 Dnase-gratis, Rnase-fri, Pyrogen-fri.

Tabell 1: Reagens oppsett.

Table 2
Tabell 2: CDR forskjeller og mutagenese primere. DNA-sekvenser av regionene CDR å være mutert vises i rødt; sekvenser er formatert med IUPAC nukleotid koden. "X" angir tri-nukleotid fra en blanding som er utformet for å inneholde ulike aminosyre sett; "n" angir forskjellige antall X. fem primere med et annet antall X ble brukt til å spre CDRL3 eller CDRH3, henholdsvis, å generere variabel lengde på CDRL3 og CDRH3. De øvrige tallene er definert av IMGT nomenklaturen. Klikk her for å laste ned denne tabell.

Kunkels metode basert mutagenese
Reaksjon 1. Oligonucleotide fosforylering med T4 polynucleotide kinase
Komponent Beløp Siste
mutagene oligonucleotides 0,6 μg
10 x TM buffer 2 ΜL 1 X
10 mM ATP 2 ΜL 1 mM
100 mM DTT 1 ΜL 5 mM
T4 polynucleotide kinase (10 U/μL) 2 ΜL 20 U
Ultrapure H20 Opptil 20 μL
Reaksjon innstillingen
Trinn 1. 37 ° C i 1 time
Reaksjon 2. Avspenning av oligonucleotides i malen
Komponent Beløp Siste
dU-ssDNA mal 20 μg 20 μg
10 x TM buffer 25 ΜL 1 X
fosforylert CDRH1 oligonucleotides 20 ΜL 0,6 μg
fosforylert CDRH2 oligonucleotides 20 ΜL 0,6 μg
fosforylert CDRH3 oligonucleotides 20 ΜL 0,6 μg
fosforylert CDRL3 oligonucleotides 20 ΜL 0,6 μg
Ultrapure H20 Opptil 250 μL
Reaksjon innstillingen
Trinn 1. 90 ° C i 3 min
Trinn 2. 50 ° C i 5 min
Trinn 3. 20 ° C i 5 min
Reaksjon 3. Enzymatisk syntese av CCC-dsDNA
Komponent Beløp Siste
glødet oligonucleotides/mal blandinger 250 ΜL
10 mM ATP 10 ΜL 346 µM av hver nucleotide
dNTP blanding (25 mM av hver nucleotide) 10 ΜL 865 µM av hver nucleotide
100 mM DTT 15 ΜL 5 mM
T4 DNA ligase 1 ΜL 30 Weiss enheter
T7 DNA utvalg 3 ΜL 30 U
Reaksjon innstillingen
Trinn 1. 20 ° C for overnatting

Tabell 3: Prosedyrer og komponenter i Kunkels metode basert reaksjon.

Gruppe Klone nummer Regionen Prosent
Ingen tidlig stopp codon 70 CDRH1 mutasjon 50% (35/70)
CDRH2 mutasjon 57% (40/70)
CDRH3 mutasjon 53% (37/70)
CDRL3 mutasjon 56% (39/70)
Minst én CDR mutasjon 76% (53/70)
Tidlig stopp codon 20 CDRH1 defekt 45% (9/20)
CDRH2 defekt 10% (2/20)
CDRH3 defekt 15% (3/20)
CDRL3 defekt 20% (4/20)
Andre feil 10% (2/20)

Tabell 4: Sekvens analyse av CDRH1, CDRH2, CDRH3 og CDRL3 fra syntetiske Fab biblioteket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For å konstruere høy diversitet, phage vises Fab biblioteker, kvalitetskontroll er sjekk poeng nødvendig for å overvåke forskjellige stadier i byggeprosessen, inkludert kompetansen til elektro-kompetent celler, kvaliteten på malen dU-ssDNA, effektiviteten av CCC-dsDNA syntese, titer etter electroporation, Fab bretting og aminosyre mangfoldet av CDRs av sekvens analyse av Fab-phage kloner.

Høy kapasitet og renhet av dU-ssDNA er viktig for høy mutagenese rente. I vår erfaring, kan phage induksjon ved 25 ° C over natten gi mer dU-ssDNA enn fra phage induksjon på 37 ° C over natten. Dette er i samsvar med en tidligere rapport19. Om ssDNA utvinning inneholdt den første plasmider Spin kit (QIAprep) MLB for phage lyse og bindende. Senere ble MLB avviklet med ukjent årsak og erstattet av PB. Vi fant at avkastningen av dU-ssDNA er mye lavere PB behandling sammenlignet med som fra MLB behandling. I denne protokollen brukte vi en reagens kalt UT-MLB20 erstatte MLB og fant avkastningen av dU-ssDNA er lik som i første Spin Kit.

Som CDRH3 og CDRL3 er de forskjelligste delene antigen anerkjennelse21, å innføre et skreddersydd mangfold med et bestemt sett med aminosyre kombinasjoner og forholdstall, og å fjerne redundans partiskhet og stopp-kodon introdusert av degenerert kodon som NNK (N, ekvimolare av en/c/G/T; K, ekvimolare G/t), trimer codon phosphoramidite-baserte oligonucleotides22 med nøyaktig én trimer codon tilsvarer ett bestemt aminosyre ble utformet for CDRH3 og CDRL3. Videre ble variable lengder av CDRH3 og CDRL3 oligonucleotides brukt til å øke forskjeller.

Etter enzymatisk syntese av CCC-dsDNA, vanligvis tre band er observert av agarose gel geleelektroforese og band bør være klart uten smøre. Blant dem er raskeste kjører bandet CCC-dsDNA som kan gi en høy Mutasjonshastigheten (rundt 80%) etter electroporation23. Laveste-kjører bandet er strand-fortrenges DNA som oppstår fra iboende strand-forskyvning aktiviteten til T7 DNA utvalg og har en lav mutasjon rate (20%)23. Midtre svak bandet er nicked DNA etter forlengelse på grunn av utilstrekkelig T4 DNA ligase aktivitet eller utilstrekkelig oligonucleotide fosforylering.

En liten sekvensering prøve pool ble brukt til å beregne biblioteket mangfoldet om ikke nøyaktig24. For å beregne det virkelige mangfoldet nøyaktig, kan neste generasjons sekvensering (NGS) være et godt alternativ i gruvedrift mangfold dybden av konstruert biblioteket25. I praksis, på grunn av gjeldende utfordringer NGS teknologi inkludert Les lengde, nøyaktighet, pris og høy gjennomstrømning, sekvensering av Fab phage biblioteket i denne protokollen med lengden på rundt 950 bp omfatter CDRH1, CDRH2, CDRH3 og CDRL3 er ikke oppnåelig; Det er imidlertid mulig å anslå scFv (rundt 700 bp) bibliotek mangfold innen millioner24,25. En annen viktig standard evaluere mangfoldet av konstruert bibliotek er å bruke biblioteket panorere mot mange forskjellige typer antigener og beregne positive kloner fanget ettersom biblioteket mangfold er direkte korrelert med vellykket rate av antigen panorering26. Høy gjennomstrømning utvalg plattform er godt egnet for dette formålet og leserne kan se en detaljert protokoll rapportert av Miersch et al. 27

Teoretisk kan phage vises syntetiske antistoff biblioteker med skreddersydd mangfold brukes til å målrette alle antigen og dermed har bred programmer. Foreløpig stole selskaper inkludert Cambridge antistoff teknologi (CAT), MedImmune, Genentech, Dyax, Bioinvent, Pfizer og MorphoSys tungt på phage skjermen plattformer for terapeutisk antistoff utvikling28. Videre har mange phage vise kjernen teknologipatenter utløpt29. Dette vil utvilsomt frigjøre maksimal potensialet i phage vises antistoff teknologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Frederic Fellouse fra Sidhu lab for kritiske kommentarer Kunkels metode basert syntetisk Fab phage biblioteket konstruksjon. Forfatterne takker fru Alevtina Pavlenco og andre medlemmer fra Sidhu lab for verdifull hjelp forberede høyeffektive electro-kompetent E. coli celler og høy kvalitet dU-ssDNA. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant No.: 81572698, 31771006) til DW og ved ShanghaiTech University (Grant No.: F-0301-13-005) til laboratoriet av antistoff Engineering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
1.0 M H3PO4 Fisher AC29570
1.0 M Tris, pH 8.0 Invitrogen 15568-025
10 mM ATP Invitrogen 18330-019
100 mM dithiothreitol Fisher BP172
100 mM dNTP mix GE Healthcare 28-4065-60 solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP.
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-76-02
50X TAE Invitrogen 24710030
Agarose Fisher BP160
Carbenicillin, carb Sigma C1389 100 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL.
Chloramphenicol, cmp Sigma C0378 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Invitrogen AM9620G
Granulated agar VWR J637-500G
H2O2 peroxidase substrate Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-65-02
K2HPO4 Sigma 795488
Kanamycin, kan Fisher AC61129 50 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL.
KH2PO4 Sigma P2222
Na2HPO4 Sigma 94046
NaCl Alfa Aesar U19C015
Nanodrop Fisher ND2000C
NaOH Fisher SS256 ! CAUTION NaOH causes burns.
NON-Fat Powdered Milk Sangon Biotech A600669
PEG-8000 Fisher BP233
Protein A-HRP conjugate Invitrogen 101123
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 22704
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28706
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
Recombinant Protein L Fisher 77679
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203S
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T7 DNA polymerase New England Biolabs M0274S
Tetracycline, tet Sigma T7660 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
Tryptone Fisher 0123-07-5
Tween-20 Sigma P2287
Ultrapure glycerol Invitrogen 15514-011
Uridine Sigma U3750 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL.
Yeast extract VWR DF0127-08
Name Company Catalog Number Comments
Strains
E.coli CJ236 New England Biolabs E4141 Genotype: dut-  ung-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA.
E.coli SS320 Lucigen 60512 Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production.
M13KO7 New England Biolabs N0315S
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.2-cm gap electroporation cuvette BTX
96-well 2mL Deep-well plates Fisher 278743
96-well Maxisorp immunoplates Nunc 151759
Baffled flasks Corning
Benchtop centrifuge Eppendorf 5811000096
Centrifuge bottles Nalgene
ECM-630 electroporator BTX
Magnetic stir bars Nalgene
Thermo Fisher centrifuge Fisher
High speed shaker TAITEK MBR-034P
Microplate shaker QILINBEIER QB-9002
Liquid handler for 96 and 384 wells RAININ
Mutil-channel pipette RAININ E4XLS
Amicon concentrator Merck UFC803096

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. (2017).
  2. Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9, (2), 167-181 (2017).
  3. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, (5517), 495-497 (1975).
  4. Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21, (11), 966-973 (1999).
  5. Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34, (12), 960-969 (2016).
  6. Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253, (18), 6551-6560 (1978).
  7. Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228, (4705), 1315-1317 (1985).
  8. Sidhu, S. S. Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. CRC Press. (2005).
  9. Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, (16), 8950-8954 (2000).
  10. Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8, (7), 1177-1194 (2016).
  11. Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2, (12), 682-688 (2006).
  12. Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
  13. Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, (2), 488-492 (1985).
  14. Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
  15. Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425, (4), 803-811 (2013).
  16. Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27, (1), 55-77 (2003).
  17. Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9, (8), 679-687 (2001).
  18. Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, (10), 5399-5404 (2000).
  19. Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58, (1), 10-17 (2012).
  20. Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
  21. Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31, (3), 169-217 (1994).
  22. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22, (25), 5600-5607 (1994).
  23. Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Second Edition, CRC Press. 157-180 (2006).
  24. Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12, (5), e0177574 (2017).
  25. Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring? Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
  26. Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81, (4), 645-670 (1979).
  27. Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492 (2015).
  28. Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16, (5), 3675-3700 (2011).
  29. Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics - the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28, (5), 538-544 (2011).
Byggingen av syntetisk Phage vises Fab biblioteket med skreddersydd mangfold
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S., Sidhu, S. S., Hou, S. c., Wu, D. Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity. J. Vis. Exp. (135), e57357, doi:10.3791/57357 (2018).More

Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S., Sidhu, S. S., Hou, S. c., Wu, D. Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity. J. Vis. Exp. (135), e57357, doi:10.3791/57357 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter