Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

بالعزلة وثقافة الخلايا Epicardial الأولية المستمدة من عينات من قلب الكبار والأجنة البشرية

doi: 10.3791/57370 Published: April 24, 2018

Summary

ابيكارديوم يلعب دوراً حاسما في التنمية وإصلاح القلب بتوفير عوامل النمو على الجدار احتشاء عضلة القلب وخلايا. هنا، يمكننا وصف أسلوب للثقافة البشرية خلايا epicardial الأساسية التي تمكن من دراسة ومقارنة الخصائص الإنمائية والكبار ل.

Abstract

ابيكارديوم، طبقة خلايا الظهارية تغطي عضلة القلب، له دور أساسي أثناء تطوير القلب، وكذلك في الاستجابة إصلاح القلب بعد الإصابة الدماغية. عند تنشيط، خلايا epicardial الخضوع لعملية تعرف باسم الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) لتوفير خلايا عضلة القلب تجديد. وعلاوة على ذلك، يساهم ابيكارديوم عن طريق إفراز العوامل الأساسية باراكريني. نقدر تماما إمكانات التجدد ابيكارديوم، مطلوب نموذج خلية بشرية. هنا أننا مخطط نموذج ثقافة رواية خلية استخلاص الخلايا الأولية المشتقة ابيكارديال (ابدكس) من أنسجة القلب الكبار والأجنة البشرية. لعزل ابدكس، ابيكارديوم تشريح من خارج العينة القلب ومعالجتها في تعليق خلية مفردة. المقبل، مطلي ابدكس ومثقف في أبدك المتوسطة التي تحتوي على مثبطات 5-كيناز كيه SB431542 للحفاظ على النمط الظاهري الظهارية بهم. EMT هو فعل التحفيز مع TGFβ. هذا الأسلوب يتيح، للمرة الأولى، دراسة عملية EMT epicardial البشرية في إعداد التي تسيطر عليها، وتيسر الحصول على مزيد من التبصر في سيكريتومي ابدكس التي يمكن أن تساعد في إنعاش القلب. وعلاوة على ذلك، يتيح هذا النهج الموحد للمقارنة المباشرة للسلوك ابيكارديال الكبار والجنين البشري.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ابيكارديوم، طبقة طلائي خلية واحدة أن مغلفات القلب، وذات أهمية حيوية للتنمية القلب وإصلاح (إعادة النظر في سميتس et al. 1)-تنمويا، ابيكارديوم تنشأ من الجهاز بروبيكارديال، هيكل صغير يقع في قاعدة القلب النامية. حول التنموية يوم E9.5 في الماوس، والحمل بعد 4 أسابيع في الإنسان، تبدأ الخلايا ترحيل من هذا الهيكل قرنبيط ويغطي عضلة القلب النامية2. حالما يتم تشكيل طبقة واحدة من خلايا الظهارية، يخضع جزء من الخلايا epicardial الظهارية الانتقالية الوسيطة (EMT). خلال EMT، خلايا تفقد خصائصها الظهارية، مثل الالتصاقات خلية خلية، والحصول النمط الظاهري الوسيطة التي يعطيها القدرة على ترحيل في عضلة القلب النامية. شكلت الخلايا المشتقة ابيكارديال (ابدكس) يمكن أن تفرق في العديد من أنواع خلايا القلب بما في ذلك الخلايا الليفية وخلايا العضلات الملساء، ويحتمل أن تكون كارديوميوسيتيس وخلايا بطانية3، رغم التمايز الأخير اثنين الخلية السكان لا يزال خاضعا للمناقشة (استعرض في سميتس et al. 4). وعلاوة على ذلك، يوفر ابيكارديوم إشارات paracrine مفيدة لعضلة القلب لتنظيم النمو والأوعية الدموية5،6،،من78. وقد أثبتت الدراسات المتعددة أن تشكيل epicardial البصر يؤدي إلى عيوب التنموية في عضلة القلب9،10والمفرج11والتوصيل نظام12، إذ تؤكد الأساسية مساهمة ابيكارديوم إلى تشكيل القلب.

على الرغم من أن في قلب الكبار موجودة ابيكارديوم كطبقة نائمة، فإنه يصبح تنشيط عند الاسكيمية13. ويجمل تنشيط epicardial بعد إصابة العديد من العمليات الموصوفة للتنمية القلب، بما في ذلك انتشار و EMT14، أن كان أقل كفاءة. من المثير للاهتمام، على الرغم من أن الآلية الدقيقة ليست مفهومة تماما، ابيكارديال المساهمة في إصلاح يمكن تحسينه من خلال العلاج مع، مثلاً، β4 ثيموسين15 أو تعديل مرناً VEGF-أ16، أسفر عن القلب يحسن وظيفة بعد احتشاء عضلة القلب. ولذلك يعتبر ابيكارديوم مصدر خلية مثيرة لاهتمام لتعزيز إصلاح الذاتية للقلب المصاب.

وكثيراً ما يرد موجز لها آليات التنمية القلب أثناء الإصابة، على الرغم من أن بطريقة أقل كفاءة. بحثاً عن المنشطات ابيكارديال، فمن بالغ الأهمية أن نتمكن من تحديد ومقارنة القدرات الكاملة ابيكارديوم الجنين والكبار. وعلاوة على ذلك، من المهم من وجهة نظر علاجية، أنه، بالإضافة إلى التجارب على الحيوانات، نتقدم بالمعرفة فيما يتعلق برد ابيكارديوم البشرية. هنا، يمكننا وصف طريقة لعزل وثقافة الكبار والجنين epicardial المشتقة الخلايا البشرية (ابدكس) في مورفولوجيا مثل الخلايا الظهارية وحمل EMT. مع هذا النموذج، ونحن نهدف إلى استكشاف ومقارنة سلوك الخلية epicardial الكبار والجنين.

والميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو استخدام المواد ابيكارديال البشرية، التي لم تدرس جيدا. الأهم من ذلك، ينص البروتوكول ثقافة العزلة وخلية وصف أسلوب موحد واحد لاشتقاق كلا ابدكس cobble الأجنة والبالغين، مما يتيح إجراء مقارنة مباشرة بين هذه المصادر الخلية اثنين. بالإضافة إلى ذلك، منذ ابيكارديوم يتم عزل استناداً إلى موقعها، تكفل أن الخلايا هي فعلا ابيكارديالي المشتقة17.

في حين تم إنشاء أساليب العزلة أبدك البشرية سابقا، هذه تعتمد في الغالب على بروتوكولات ثمرة حيث يتم مطلي قطعة من أنسجة القلب أو ابيكارديال على خلية ثقافة طبق18،19. وبالتالي يحدد هذا النهج على وجه التحديد للخلايا التي تفقد جزئيا على النمط الظاهري الظهارية من أجل ترحيل، والتي أكثر عرضه للخضوع EMT عفوية. في البروتوكول الحالي، تتم معالجتها في ابيكارديوم أولاً إلى حل وحيد خلية الذي يسمح ابدكس معزولة للحفاظ على دولته الظهارية. ولذلك يوفر هذا الأسلوب نموذجا صلبا في المختبر لدراسة epicardial EMT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

كل التجارب مع عينات الأنسجة البشرية أقرتها لجنة الأخلاقيات المركز الطبي بجامعة ليدن، ويتفق مع "إعلان هلسنكي". يتم تنفيذ كافة الخطوات مع المعدات المعقمة في تدفق ثقافة الخليوي مجلس الوزراء.

1-الأعمال التحضيرية

  1. إعداد متوسطة أبدك بخلط دولبيكو للمتوسطة تعديل النسر (دميم منخفضة-الجلوكوز) والمتوسطة 199 (M199) بنسبة 1:1. أضف إبطال الحرارة 10% مصل بقرى الجنين (FBS، الحرارة غير نشط لمدة 25 دقيقة في 56 درجة مئوية) والملحق مع 100 البنسلين يو/مليلتر وستربتوميسين 100 ملغ/مل. قبل الحارة المتوسطة أبدك في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  2. قبل الحارة التربسين 0.25%/EDTA (1:1) في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  3. معطف الآبار مع الجيلاتين. إضافة 0.1% جيلاتين/برنامج تلفزيوني لكل بئر واحتضان لوحات لمدة 15 دقيقة على الأقل في 37 درجة مئوية. ويرد في الجدول 1المبادئ التوجيهية للوحة الثقافة الخلية المطلوبة. بعناية إزالة جميع السوائل قبل طلاء الخلايا.
  4. إعداد حل أسهم من 10 مم SB431542 (SB)، تضعف في [دمس] (تحذير). جعل 50 ميليلتر مختبرين في أنابيب الطرد المركزي البوليبروبيلين مخروطية الشكل السفلي، مثل أنابيب ايبندورف، وتخزينها في-20 درجة مئوية. لاحظ أنه يمكن أن يكون مذاب مختبرين SB مرة واحدة فقط.

2-استرجاع وتخزين العينات قلب الكبار والجنين

  1. تخزين اذينات الكبار البشرية مباشرة عند إزالة أثناء عملية جراحية في أنبوب 50 مل مع 15 مل دميم الجلوكوز العالية التي تحتوي على 10% FBS و 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 100 مغ/مل عند 4 درجة مئوية. بشكل عام من 3-5 سم في حجم العينات ويمكن تخزين تصل إلى 48 ساعة بعد التشريح.
  2. تخزين قلوب الأجنة التي تم الحصول عليها من مواد الإجهاض الاختيارية في المتوسط أبدك عند 4 درجة مئوية تصل إلى 24 ساعة بعد عزلة. لهذا البروتوكول، واستخدام العينات مع عمر الحملي بين 12-22 أسبوعا. علما بأن قلب كله يمكن أن تستخدم لعزل ابيكارديوم.

3-عزل طبقة ابيكارديال

  1. تدفق الصفحي مجلس الوزراء، تحضير طبق زراعة خلايا 100 ملم مع برنامج تلفزيوني ومكان معالجة تجميعية منفصلة (~ 200 ميليلتر) لبرنامج تلفزيوني في الغطاء. ملء أنبوب 15 مل مع 5 مل المعالجون مسبقاً أبدك المتوسطة.
  2. وضع الأنسجة في الطبق خلية ثقافة مليئة ببرنامج تلفزيوني. تأكد من أن الأنسجة هو مبلل كثيرا أثناء الإجراء.
  3. استخدام ستيريوميكروسكوبي، إزالة قدر من طبقة ابيكارديال من عينة الأنسجة قدر الإمكان يسقط استخدام الملقط.
    ملاحظة: يمكن التعرف ابيكارديوم كطبقة رقيقة جداً وشفافة محكم انضمت إلى خارج القلب (الشكل 1A). في محاولة لتجنب التلوث مع epicardial الأنسجة الدهنية والأوعية الدموية منذ هذا سوف تعوق العزلة.
  4. جمع قطع من الأنسجة ابيكارديال في الحبرية من برنامج تلفزيوني على الغطاء.
  5. قطع الأنسجة ابيكارديال إلى قطع صغيرة (0.5 مم3) استخدام مشرط (الشكل 1B)، أو باستخدام نصائح حادة من ملقط صغير. ملاحظة أن القطع يجب أن تكون قادرة على تمرير P1، 000 بيبيت نصيحة (الخطوة 3، 6).
  6. أضف 1 مل التربسين للأنسجة ابيكارديال وجمع القطع والتربسين مع P1، 000 بيبيت تلميح. نقل الأنسجة في أنبوب 1.5 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي (الشكل 1).
  7. احتضان الأنبوبة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، بينما تهز ~ 60 لفة في الدقيقة.
  8. إزالة الأنبوب من حوض ماء، وتنظيف الجزء الخارجي الأنبوب مع الإيثانول 70%.
  9. تسمح الأنسجة تنزل إلى الجزء السفلي من الأنبوب (الشكل 1) ونقل المادة طافية تحتوي على خلايا ابيكارديال إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 5 مل أبدك المتوسطة لإلغاء تنشيط التربسين عناية.
  10. تجديد الأنسجة المتبقية في الأنبوب الطرد المركزي المخروطية مع التربسين 1 مل، وتخلط بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
  11. كرر الخطوة 3، 3، 7 إلى 10 مرتين. في الخطوة الأخيرة، بعد ما مجموعة 30 دقيقة من حضانة التربسين، نقل المادة طافية والأنسجة ابيكارديال المتبقية في أنبوب يحتوي على أبدك المتوسطة.
  12. عندما يتم جمع كافة الخلايا في المتوسط أبدك، بلطف تمرير التعليق عن طريق حقنه 10 مل بإبرة قياس 19 في أنبوب 15 مل جديدة أن تنأى ميكانيكيا بالخلايا (الشكل 1E).
    ملاحظة: تأكد من مجانسة التعليق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً قبل تمرير الحل عن طريق الإبرة لمنع الإبرة الحصول على إعاقة.
  13. للمزيد ننأى بالخلايا، كرر الخطوة 3.12 بإبرة قياس 21.
  14. ضع مصفاة خلية 100 ميكرومتر على رأس أنبوب 50 مل ونقل متوسطة تحتوي على خلايا ابيكارديال على مصفاة استخدام ماصة 10 مل لإزالة كافة كتل المتبقية (الشكل 1F).
  15. أغسل مصفاة لجمع الخلايا المتبقية من بيبيتينج 5 مل أبدك المتوسطة إلى المصفاة.
  16. بيبيت تعليق خلية من أنبوب 50 مل في أنبوب 15 مل. منذ بالوعة الخلايا إلى الجزء السفلي من الأنبوب، اهتز الحل بلطف قبل بيبيتينج.
    ملاحظة: في حين أن هذه الخطوة ليست ضرورية، أنبوب أصغر الإيدز التصور بيليه بعد الطرد المركزي.
  17. الطرد المركزي في 200 غ س لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (الشكل 1).
  18. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية (الشكل 1 ح) في وحدة التخزين المطلوب من أبدك المتوسطة (الجدول 1).
    ملاحظة: للجنين ابدكس، مباشرة استخدام أبدك المتوسطة التي تحتوي على 10 ميكرون من مثبط كيناز ALK5 (أبدك + س). يمكن مطلي خلايا البالغين دون SB أثناء مرور أول.
  19. لوحة تعليق خلية على لوحات الثقافة الجيلاتين المغلفة (1I الشكل). يعتمد حجم البئر على حجم العينة الأنسجة ابيكارديال (الجدول 1). علما أن كونفلوينسي المنخفضة سوف تحفز حدوث EMT.
  20. وضع الخلايا في الحاضنة لمالا يقل عن 48 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 للسماح للخلايا لإرفاق لوحة الثقافة.

4-ثقافة ابدكس

  1. تجديد المتوسطة أبدك + SB على الأقل كل 3 أيام.
  2. فحص الخلايا على الأقل كل 3 أيام باستخدام المجهر. عندما تصل الخلايا إلى كونفلوينسي، أيعند لوحة الثقافة مغطى تماما بالخلايا، وممر الخلايا بنسبة 1:2 سطحية. ملاحظة يمكن أن يستغرق التوصل إلى كونفلوينسي ~ 5-10 أيام.
    1. نضح المتوسطة استخدام نظام الشفط أو بيبيت مع، مثلاً، بيبيت زجاج.
    2. غسل الخلايا بعناية عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني للخلايا. بلطف دوامة اللوحة ونضح برنامج تلفزيوني.
    3. إضافة التربسين اللوحة. تدوير بلطف لوحة لتغطية كافة الخلايا مع التربسين واحتضان لوحة لمدة 1 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: استخدم التربسين قليلاً قدر الإمكان (إشارة: لوحة 200 ميليلتر الواحدة من 6 جيدا جيدا)
    4. انقر فوق لوحة ميكانيكيا فصل الخلايا من الجزء السفلي من اللوحة. استخدام المجهر للتحقق بصريا إذا فصل الخلايا. إذا لم يكن الأمر كذلك، احتضان لوحة الثقافة الخلية دقيقة إضافية.
    5. إضافة وحدة التخزين المطلوبة من أبدك + SB المتوسطة للخلايا وريسوسبيند من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، ونقل تعليق خلية لوح جيلاتين مغلفة ثقافة جديدة.
      ملاحظة: بشكل عام، الخلايا يمكن أن يوضع في مورفولوجيا حصاة كبيرة تصل إلى مرور 8.

5-تحريض EMT في ابدكس

  1. للحث على EMT، ننأى بالخلايا مع التربسين ونقل الخلايا إلى الجيلاتين جديدة مغلفة بابار في نسبة 1:2 سطحية في المتوسط أبدك + بينالي الشارقة، كما هو موضح في 4، واحتضان لمالا يقل عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5% CO2.
  2. الاختيار إذا كونفلوينسي من 50-70%، وإذا ابدكس مورفولوجيا حصاة كبيرة.
    ملاحظة: كونفلوينسي يؤثر على قدرة ابدكس على الخضوع EMT.
  3. نضح المتوسطة من الخلايا، وتغسل الخلايا بعناية مع برنامج تلفزيوني (راجع الخطوة 4.2.1-4-2-2).
  4. تنشيط الخلايا مع 1 نانوغرام/مل TGFβ3 في المتوسط أبدك ووضعها في حاضنة في 37 درجة مئوية، 5% CO2 لمدة 5 أيام. علما بأن خلال التحفيز، وليس لديه المتوسطة أبدك التي تحتوي على TGFβ3 أن تتجدد.
  5. رصد الخلايا يوميا. بعد 5 أيام، يتم التعرف على الخلايا التي خضع EMT بالتشكل على شكل محور الدوران (الشكل 2A).
  6. الثقافة على شكل شوكي ابدكس وفقا للطريقة الموضحة في 4 دون SB أو TGFβ بالإضافة إلى المتوسطة أبدك. لاحظ أنه بشكل عام، يمكن مثقف ابدكس على شكل المغزل حتى مرور 20.
  7. التحقق من صحة وقوع EMT مع تلطيخ إيمونوفلوريسسينت باستخدام أجسام مضادة ضد αSMA علامات الوسيطة أو فيمنتين أو فالويدين للكشف عن تشكيل ألياف الأكتين و الإجهاد (الشكل 2)، أو باستخدام qRT PCR EMT-المتعلقة الجينات ( مثل، WT1، بيريوستين، Col1A1، αSMA، N-كادهيرين، MMP3، الحلزون، سبيكة) (الشكل 2 و الجدول 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

هنا، فإننا مخطط بروتوكولا مباشرة عزل ابدكس من الكبار والجنين القلب الأنسجة البشرية (الشكل 1). هذا البروتوكول يستفيد من موقع يمكن الوصول بسهولة ابيكارديوم في خارج القلب (الشكل 1A). تلوين لصوان القلب بعد تشريح يوضح أنه يتم إزالة ابيكارديوم WT1 + حين يظل الكامنة سوبيبيكارديال المصفوفة خارج الخلية والأنسجة احتشاء عضلة القلب سليمة (1J الشكل). وقد أجريت توصيف واسعة النطاق من قبل، مما يدل على أن ابدكس التعبير عن علامات ابيكارديال، مثلاً، ALDH1A2، TBX18، KRT8، KRT19 وعدم التعبير الأخرى أنواع الخلايا المقيمة في قلب، مثلاً، PECAM1، ISL1، CD34، و TNNT2. 17

الكبار (الرقم ك 1) والجنين (الشكل 1 لتر) ابدكس مثقف حضور المعرض مثبط SB431542 كيناز ALK5 مورفولوجيا حصاة كبيرة. ومع ذلك، تبعاً لشروط المانحين، والثقافة، يمكن الخضوع للجنين ابدكس EMT رغم وجود س. ب. وهذا يمكن أن يؤدي في الخلايا على شكل عمود الدوران داخل سكان الخلايا حصاة كبيرة (انظر الأسهم في الشكل 1 لتر). يرجى أن يكون على علم بأن عزل الخلايا على شكل حصاة كبيرة من الأنسجة الجنينية ليس ممكناً دائماً، وقد ينتج عن اشتقاق خلايا على شكل المغزل معظمها. حيث تنمو هذه الخلايا بشكل أسرع، سوف سرعة كسا أنواع الخلايا الأخرى.

يمكن فعل EMT التي تفرخ مع TGFβ320 لمدة 5 أيام في خلايا الكبار والجنين على حد سواء، كما يتبين من مرحلة انتقالية واضحة مورفولوجية للخلايا على شكل محور الدوران (الشكل 2A). كما هو موضح باستخدام عنصر التحكم غير المعالجة ("فارغ")، ستخضع ابدكس الجنين EMT عفوية عند إزالة بينالي الشارقة، بينما سيخضع ابدكس الكبار فقط EMT عند التحفيز مع TGFβ3. للتحقق من صحة EMT، كانت ابدكس إيمونوستينيد مع العضلات الملساء ألفا أكتين (αSMA)، علامة الوسيطة (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، أكد EMT في ابدكس الكبار باستخدام PCR قرت downregulation إظهار علامة epicardial WT1 و upregulation علامات mesenchymal بوستن، αSMA، 1A1 الكولاجين، MMP3، ونون-كادهيرين (الشكل 2). ويتم نشر تجارب شاملة فيما يتعلق بالكبار والجنين EMT epicardial قبل17.

الأنسجة اكتب جيدا منطقة نمو الخلية (سم2) حجم متوسط (mL) بالإضافة لبينالي الشارقة
الجنين 24 1.9 0.5 مباشرة
الكبار الصغيرة (< 4 سم) 12 3.8 1 بعد مرورش 1
الكبار كبير 6 9.6 2 بعد مرورش 1
(> 4 سم)

الجدول 1: مبادئ توجيهية لتحديد لوحة الثقافة الخلية المناسبة. ويعتمد حجم جيدا المطلوبة على كمية الخلايا ابيكارديال معزولة. يمكن استخدام هذه المبادئ التوجيهية كقاعدة عامة لتحديد لوحة الثقافة الخلية المناسبة.

الجينات التسلسل
WT1 إلى الأمام ضريبة تحويل العملة كاج جا TGC ATG تيراغرام لجنة التنسيق الإدارية
عكس WT1 TCT تأت ع وافق به السواقين TCC GC
ن-كادهيرين إلى الأمام كاج لجنة التنسيق الإدارية GAC التقييم القطري المشترك الجميح للسيارات AGC الجميح للسيارات
ن-كادهيرين عكس الائتلاف ACA الائتلاف ع AGG هيئة مكافحة الفساد الجميح للسيارات المنسوجات والملابس
بوسطن إلى الأمام GGA السواقين كاج AAA لجنة مكافحة الإرهاب أغا جي تي
عكس بوسطن السواقين TGA GGA AGG TGC ﻷعمالهم AG
الأمام SMA سی GGA أكاديمية صرفة GAC TCA AA
عكس SMA جا GGA آتا دول مجلس التعاون الخليجي ACG AG لجنة مكافحة الإرهاب
MMP3 إلى الأمام تج ATG سی ATG القط AAG
عكس MMP3 كاج تج AAA CTG القط CGA
COL1A1 إلى الأمام القطري جا جا CTG م م ع القط كاج CA
عكس COL1A1 كجك القط CGA قانون محكمة الاستئناف الإدارية عبدالله محكمة الاستئناف الإدارية
جابده إلى الأمام AGC CAC المنسوجات والملابس كاج بنا ج هيئة مكافحة الفساد
عكس جابده دول مجلس التعاون الخليجي الجهاز المركزي للمحاسبات تاك GAC الجهاز المركزي للمحاسبات مراقبة الحركة الجوية ج
B2M إلى الأمام هيئة مكافحة الفساد CTG صرفة TCA التقييمات CCC CT
عكس B2M بنا ATG تاك TCT CGA TCC كاك تي

الجدول 2: تسلسل التمهيدي المستخدمة للتحقق من صحة EMT في ابدكس- تسلسل الإشعال إلى الأمام وعكس تستخدم qRT-PCR لتحديد التعبير عن EMT عدة تتعلق بالجينات في ابدكس الكبار.

Figure 1
الشكل 1 : عزل Epicardial اشتقاق خلايا (ابدكس)- ديبيكتيد (A) هو صوان الكبار إزالتها من قلب الإنسان مع طبقة رقيقة خارجي غشائي، ابيكارديوم، الذي يتم إزالته. السهم الأسود يشير إلى ابيكارديوم. (ب--أنا) تمثيل مرئي لطريقة العزل ابدكس. السهم الأسود يشير إلى بيليه الخلية. (ي) إيمونوفلوريسسينت تلطيخ من صوان قلب مع أو بدون تشريح ابيكارديوم. شريط الحجم: صور الممثل 50 ميكرومتر. (K) من اثنين مختلفة الكبار أبدك العزلة مثقف مع صور اثنين مختلفة الجنين أبدك العزلة مثقف مع الأسود SB. أسهم الممثل SB. (L) تشير إلى الوسيطة مثل الخلايا في الجنين الثقافة أبدك. شريط الحجم: 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : التحقق EMT في تعليم الكبار والجنين Epicardial تستمد الخلايا البشرية (ابدكس)- ابدكس الكبار والجنين مثقف مع بينالي الشارقة، لا تعامل (فارغة) أو حفز مع TGFβ3 لمدة 5 أيام. (أ) صور الممثل الميداني مشرق. شريط الحجم: 200 ميكرومتر. (ب) Immunostaining DAPI و αSMA. شريط الحجم: 100 ميكرومتر-(ج) مرناً مستويات EMT-المتصلة الجينات، وتحدد في ابدكس الكبار باستخدام PCR قرة. تم تطبيع القيم المقاسة للتعبير جابده و B2M. قيم يصور على أنه يعني + SD 2 ^-ΔΔct (n = 2). المختصرات: الورم WT1:Wilms '1, MMP3: مصفوفة أية 3، POSTN:Periostin، αSMA: ألفا"العضلات الملساء أكتين"، Col1A1:Collagen 1A1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

هنا يصف لنا البروتوكول مفصلاً لعزل وثقافة الخلايا epicardial الأولية المستمدة من قلوب الكبار والأجنة البشرية. وقد وصف واسع النطاق لهذه الخلايا المنشورة سابقا17. وقد أظهرنا أنه يمكن الحفاظ على كل أنواع الخلايا كالخلايا الظهارية مثل حصاة كبيرة عند مثقف مع مثبط كيناز ALK5 SB431542. EMT جزء لا يتجزأ من تفعيل ابيكارديال في فيفو خلال كل من التنمية واستجابة ما بعد الإصابة. EMT يمكن دراستها باستخدام هذا الأسلوب بالإضافة إلى ذلك TGFβ. الأهم من ذلك، لاحظنا سابقا أن الجنين ابدكس سرعة الخضوع EMT عفوية عند إزالة بينالي الشارقة، بينما ابدكس الكبار فقط الخضوع EMT عند التحفيز17. دراسة هذه العمليات في ابدكس الجنين يمكن أن تساعد في فهم كيفية تنشيط ابيكارديوم الكبار على النحو الأمثل بعد الضرر.

طريقة عرض يعتمد على المواد المريض، والتي يتم الحصول عليها أثناء عملية جراحية. ولذلك، يمكن أن يتوقع المرء العديد من الاختلافات في حالة المواد معزولة، وأما بسبب تقلب المريض أو السرعة التي يتم تجميع المواد في المسرح التشغيل. هذا الاختلاف قد يفسر الاختلافات في الإجراء: 1) كيف بسهولة يمكن تشريح ابيكارديوم من عضلة القلب، 2) تمسك الخلايا المعزولة باللوحة، 3) القدرة على منع أو الخضوع EMT، وسرعة انتشار 4). وبصفة عامة، عزل سريع الأفضل لبقاء الخلية. النقطة الحرجة الرئيسية هو تقشير ابيكارديوم من عضلة القلب. إذا كان ابيكارديوم بشدة الالتزام بالانسجة الكامنة، يمكن أن تساعد علاج قبل 15 دقيقة من أنسجة القلب مع التربسين لإزالة ابيكارديوم شكل أكثر سهولة. وعلاوة على ذلك، فعالية العلاج التربسين يعتمد على عدة عوامل، بما في ذلك النشاط التربسين وتكوين الأنسجة. ولذلك، إذا لوحظ انخفاض عائد، يمكن تعديل الوقت الحضانة مع التربسين. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان مرئياً لا بيليه الخلية بعد الغزل إلى أسفل، الحل قد لا يكون تم تماما فصل قبل تشغيل من خلال عامل تصفية. خلط الحل قبل تمرير الحل عن طريق المحاقن أو استخدام إضافية، يمكن أن تكون مفيدة فصل الخلايا حقنه أصغر. حجم جيدا لبذر ابدكس ينبغي النظر بعناية لتمكين الخلايا للحفاظ على دولته الظهارية. ويعطي الجدول 1 مؤشرا، ولكن واحدة يمكن أن تحيد عن هذا المبدأ التوجيهي عندما، على سبيل المثال، يمكن استخدام سوى جزء صغير من قلب الجنين والطلاء في أصغر جيدا أكثر ملاءمة.

حيث سيخضع الخلايا الجنينية EMT فورا دون س. ب17، ينبغي دائماً تكون مطلي ابدكس الجنين مع SB. ومع ذلك، ابدكس الكبار تميل إلى الاحتفاظ بهم مورفولوجيا الظهارية ولذلك يمكن أن يكون مطلي دون SB خلال ح 48 أول الممر الأول، تعزيز الالتزام الخلية. بعد مرور أول، تستزرع ابدكس الكبار والجنين على حد سواء بشكل مستمر مع بينالي الشارقة لمنع EMT عفوية. وباﻹضافة إلى ذلك، خلية منخفض الكثافة مشغل هام ل EMT. ولذلك ينبغي ابدأ مثقف ابدكس أدناه كونفلوينسي 50%. من ناحية أخرى، إذا كان المطلوب هو EMT، تأكد من أن ابدكس هي لا تبذر كثيفة جداً، والبقاء تحت كونفلوينسي 70%. على الرغم من أن هذا البروتوكول يستخدم TGFβ3، يمكن أن يستحث التحفيز مع TGFβ1 و-2 EMT في ابدكس، وكذلك (الملاحظات غير منشورة).

في هذا البروتوكول، ويتم تقسيم الخلايا مباشرة دون الغزل إلى أسفل، حيث نلاحظ بقاء خلية السفلي عند استخدام أجهزة الطرد المركزي. ولذلك، من الضروري استخدام كميات منخفضة من التربسين لضمان أن التعطيل عند إضافة المتوسطة المحتوية على مصل.

بعد مقاطع ~ 6-8، ابدكس مع مورفولوجيا الظهارية أما سوف تتوقف عن النمو أو سيخضع EMT عفويا. ولذلك، للتجارب، ونحن نستخدم المرصوفة ابدكس بين سن 3 ومرور 6. وفي المقابل، ابدكس مع مورفولوجيا الوسيطة أقل عرضه للخطر ويمكن أن تكون مثقف حتى مرور 20. في التجارب، بيد أننا لم يسبق لهم استخدام المغزل ابدكس بعد مرورال 10.

منذ ابيكارديوم الموجود في خارج القلب ومن السهل فصل الأنسجة الكامنة، صحة الخلايا واضح، وفرصة لتلوث كبيرة منخفضة. على الرغم من أن الأنسجة الدهنية أو الأوعية الدموية عصا في بعض الأحيان إلى طبقة epicardial معزولة، غالبية هذه الخلايا لن تمر في المصفاة أثناء العزلة، وخلاف ذلك لا يمكن البقاء على قيد الحياة في ثقافة الخلية أبدك. وعلاوة على ذلك، كما سبقت الإشارة إلى ذلك، باستخدام المواد البشرية يوفر نموذجا فريداً للتحقيق في سلوك الخلية البشرية ابيكارديال. ومن المعروف، على سبيل المثال، ابيكارديال الأنسجة الدهنية يختلف بين الأنواع، وإذ تؤكد ضرورة الخلية epicardial البشرية نماذج21.

تجدر الإشارة إلى أن تم الحصول على اذينات القلب أثناء الجراحة في قلوب مريضة، والتالي الاختلافات في المرض والأدوية المستخدمة، والسن ونوع الجنس من الجهة المانحة قد تؤثر في إمكانية تكرار نتائج التجارب. ولذلك ينبغي إجراء تجارب على العزلة عدة الحصول على نتائج صحيحة وتسمح الصلبة الاستنتاجات التي يمكن استخلاصها. وعلاوة على ذلك، اعتماداً على السؤال البحثي، واحد يمكن أن تختار خصيصا للاستخدام فقط ابيكارديوم من المرضى الذين يعانون من الأمراض الدماغية أو المرضى الذين يعانون من مرض صمامات القلب غير الدماغية، التي من المتوقع أن تتصرف بشكل مختلف.

وقد اقترح أن الرجفان ابيكارديوم قد يكون لها خصائص متميزة من طين ابيكارديوم2، وبذلك الاستجواب إذا ابيكارديوم المستمدة من صوان قلب أذينية يوفر نموذجا صالحاً للسلوك ابيكارديال. وفي هذا السياق، من المهم أن نشير إلى أنه تعذر العثور على الاختلافات بين الجنين أذينية والبطين المستمدة من ابدكس (بيانات غير منشورة). ومع ذلك، باستخدام ابيكارديوم من البطين الكبار البشرية ستكون المصدر الخلية في نهاية المطاف للتحقق من هذا. حتى الآن، جمع عينات كبيرة من البشرية البطينين الكبار لعزل أبدك الغازية عاليا للمريض، وحاليا ولذلك لا مجديا في هذا المستشفى.

لاحظنا أن بينالي الشارقة ليست دائماً كافية لمنع EMT، أساسا في ابدكس الجنين. عندما ابدكس الجنين الخضوع EMT حضور بينالي الشارقة، يمكننا استبعادها من التجارب. نتيجة لذلك، يتم تحديد الخلايا المستخدمة لإجراء تجارب لقدرتها على الاحتفاظ النمط الظاهري الظهارية ردا على س. ب. نحن افترض أن الخلايا الجنينية يمكن بالفعل يتجاوز عتبة معينة عملية EMT، وهذا التثبيط مع SB ليست قادرة على وقف هذا.

هذا نموذج الخلية epicardial قد العديد من التطبيقات، حيث يمكن أن يحقق في كل من البلدان النامية وابيكارديوم الكبار. في المختبر لدينا، نحن نركز على تحسين الاستجابة التجدد epicardial بعد الضرر القلب. يمكن استخدام ابدكس الكبار لاختبار المركبات الذي حمل EMT، تهدف إلى إيجاد دواء علاجية محتملة لاستجابة التجدد يحسن من ابيكارديوم. وباﻹضافة إلى ذلك، فمن الممكن لقياس العوامل التي يفرزها ابدكس على الفهم باراكريني إشارات إلى (re) توليد عضلة القلب. وعلاوة على ذلك، نظراً لأننا لاحظنا أن الجنين ابدكس هم أكثر عرضه للخضوع EMT عفويا بالمقارنة مع ابدكس الكبار، نحن التحقيق في الخلافات بين ابدكس الجنين والكبار. تحديد الآلية الأساسية لزيادة تنشيط الجنين يمكن أن توفر تلميحاً تحسين التنشيط ابيكارديال في قلب الكبار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا البحث معتمد من قبل "منظمة هولندا" للعلمية البحثية (جمعية البحث العلمي الهولندية) (يني 016.146.079) وزمالة "أبحاث لومك" على كل من هيئة علماء المسلمين، ومؤسسة بونتيوس لومك (MJG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX Gibco 21885-025
Medium 199  Gibco 31150-022
Fetal Bovine Serum  Gibco 10270-106
Trypsin 0.25% Invitrogen 25200-056
Penicillin G sodium salt Roth HP48
Streptomycin sulphate Roth HP66
Trypsin 1:250 from bovine pancreas Serva 37289
EDTA Sigma E4884
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890
Culture plates 6 well Greiner bio-one 657160
Culture plates 12 well Corning 3512
Culture plates 24 well Greiner bio-one 662160
SB 431542 Tocris 1614
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Merck 102931
100-1000µL Filtered Pipet Tips Corning 4809
10-ml pipet Greiner bio-one 607180
5-ml pipet Greiner bio-one 606180
Cell culture dish 100/20 mm Greiner bio-one 664160
PBS Gibco 10010056 Or home-made and sterilized
Eppendorf tubes 1.5 mL Eppendorf 0030120086
15-ml centrifuge tubes Greiner bio-one 188271
50-ml centrifuge tubes Greiner bio-one 227261
10 mL Syringe Becton Dickinson 305959
Needles 19 Gauge Becton Dickinson 301700
Needles 21 Gauge Becton Dickinson 304432
EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm Greiner bio-one 542000
TGFβ3  R&D systems 243-B3
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle Sigma A2547 
Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Invitrogen A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen A12379
Equipment
Name Company Catalog Number Comments
Pipet P1,000 Gilson F123602
Pipet controller Integra 155 015
Stereomicroscope Leica M80
Inverted Light Microscope Olympus CK2
Centrifuge Eppendorf 5702
Waterbath GFL 1083

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate. Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).
  2. Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development. Development. 142, (21), 3630-3636 (2015).
  3. Zhou, B., Ma, Q., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454, (7200), 109-113 (2008).
  4. Smits, A., Riley, P. Epicardium-Derived Heart Repair. Journal of Developmental Biology. 2, (2), 84-100 (2014).
  5. Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor. Developmental Biology. 250, (1), 198-207 (2002).
  6. Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Developmental Dynamics. 228, (2), 161-172 (2003).
  7. Lavine, K. J., Yu, K., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Developmental Cell. 8, (1), 85-95 (2005).
  8. Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Developmental biology. 255, (2), 334-349 (2003).
  9. Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Developmental Dynamics. 233, (4), 1454-1463 (2005).
  10. Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49, (4), 606-616 (2010).
  11. Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns. Circulation Research. 96, (5), (2005).
  12. Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).
  13. van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PloS one. 7, (9), e44692 (2012).
  14. Zhou, B., Honor, L. B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. The Journal of clinical investigation. 121, (5), 1894-1904 (2011).
  15. Smart, N., Bollini, S., et al. De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury. Nature. 474, (7353), 640-644 (2011).
  16. Zangi, L., Lui, K. O., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31, (10), 898-907 (2013).
  17. Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation. Stem Cell Research & Therapy. 7, (1), 1-12 (2016).
  18. Clunie-O'Connor, C., Smits, A. M., et al. The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).
  19. Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro. Stem Cells. 25, (2), 271-278 (2007).
  20. Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGFβ-signaling and WT1. Basic research in cardiology. 106, (5), 829-847 (2011).
  21. Chechi, K., Richard, D. Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue. International Journal of Obesity Supplements. 5, (Suppl 1), S28-S34 (2015).
بالعزلة وثقافة الخلايا Epicardial الأولية المستمدة من عينات من قلب الكبار والأجنة البشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dronkers, E., Moerkamp, A. T., van Herwaarden, T., Goumans, M. J., Smits, A. M. The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens. J. Vis. Exp. (134), e57370, doi:10.3791/57370 (2018).More

Dronkers, E., Moerkamp, A. T., van Herwaarden, T., Goumans, M. J., Smits, A. M. The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens. J. Vis. Exp. (134), e57370, doi:10.3791/57370 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter