Summary
Epicardium ממלאת תפקיד מכריע ההתפתחות והתיקון של הלב על ידי מתן תאים גורמי גדילה לדופן שריר הלב. כאן, אנו מתארים שיטה לתאי epicardial ראשי האדם תרבות המאפשרת את המחקר והשוואה בין המאפיינים שלהם למבוגרים ובעיות התפתחותיות.
Abstract
Epicardium, שכבת תאים אפיתל כיסוי שריר הלב, יש תפקיד חיוני במהלך התפתחות הלב, כמו גם התגובה תיקון הלב לאחר פציעה איסכמי. כאשר מופעלת, תאים epicardial עוברים תהליך המכונה אפיתל המעבר mesenchymal (החובשים) כדי לספק לתאי שריר הלב ההתחדשות. יתר על כן, epicardium תורמת באמצעות הפרשת גורמים חיוניים paracrine. כדי להעריך את פוטנציאל הרגנרציה של epicardium, דרושה דוגמנית התא האנושי. כאן אנחנו חלוקה לרמות מודל תרבות תא הרומן לנבוע ראשי תאים נגזר epicardial (EPDCs) ברקמת הלב האנושי למבוגרים ו עוברית. כדי לבודד EPDCs, epicardium גזור מבחוץ של הדגימה הלב, מעובד להשעיה תא בודד. בשלב הבא, EPDCs מצופה, תרבותי EPDC בינוני המכיל את המדכא 5-קינאז ALK SB431542 לשמור על פנוטיפ אפיתל שלהם. החובשים הנגרמת על ידי גירוי עם TGFβ. שיטה זו מאפשרת, לראשונה, חקר התהליך של החובשים epicardial אנושית בסביבה מבוקרת, ומקל צובר יותר על בסיס secretome של EPDCs עשוי לסייע הלב התחדשות. יתר על כן, גישה אחידה זו מאפשרת השוואה ישירה ההתנהגות האנושית למבוגרים ו עוברית epicardial.
Introduction
Epicardium, שכבת האפיתל תא בודד מעטפות הלב, הוא בעל חשיבות פיתוח הלב ותיקון (נבדקה בסמיתס. ואח 1). נכה, epicardium נובע העוגב proepicardial, מבנה קטן הממוקם בבסיס הלב המתפתח. סביב יום התפתחותית E9.5 העכבר ולאחר 4 שבועות תפיסה פוסט-אנוש, התאים להתחיל להעביר מתוך מבנה כרובית ולכסות את שריר הלב המתפתח2. ברגע נוצרת שכבה תא אפיתל בודד, חלק מהתאים epicardial עובר אפיתל המעבר mesenchymal (החובשים). במהלך אמבולנס, תאים לאבד את מאפייני האפיתל שלהם, כגון תאים תאים הדבקויות, ולקבל הפנוטיפ mesenchymal אשר נותן להם את היכולת להעביר לתוך שריר הלב המתפתח. התאים נגזר epicardial בנוי (EPDCs) יכולים להתמיין מספר סוגי תאים הלב כולל fibroblasts, תאי שריר חלק, ואת פוטנציאל cardiomyocytes תאי אנדותל3, למרות בידול של האחרונים שני תא האוכלוסיות נותר כפוף הדיון (נבדקה בסמיתס. et al. 4). יתרה מכך, epicardium מספק אותות paracrine מאלף אל שריר הלב כדי לווסת את הצמיחה ואת vascularization5,6,7,8. מחקרים רבים הוכיחו כי היווצרות epicardial לקוי מוביל ליקויים התפתחותיים-שריר הלב9,10, להערכת11, הולכה מערכת12, תוך שימת דגש ארומטיים התרומה של epicardium את היווצרות של הלב.
למרות בלב למבוגרים epicardium קיים כשכבה רדום, זה הופך להפעיל על איסכמיה13. Epicardial הפעלה מחדש לאחר פציעה recapitulates מספר התהליכים המתוארים לפיתוח לב, כולל הפצת החובשים14, אם כי פחות ביעילות. מעניין, למרות המנגנון המדויק אינה מובנת במלואה, התרומה epicardial לתקן ניתן לשפר על ידי טיפול עם, למשל, β4? ואת מוכנה15 או שונו VEGF-A mRNA16, וכתוצאה מכך יושבחו דום לב פונקציה לאחר אוטם שריר הלב. Epicardium ולכן היא נחשבת מקור תא מעניינים לשיפור ותיקון אנדוגני של הלב הפצוע.
מנגנוני התפתחות הלב הם לעתים קרובות recapitulated במהלך פציעה, אם כי באופן פחות יעיל. בחיפוש אחר מפעילים epicardial, זה בעל חשיבות עליונה. כי אנחנו יכולים לקבוע ולהשוות לקיבולת המלאה של epicardium העובר ואת למבוגרים. יתר על כן, מנקודת מבט טיפולית, זה חשוב, בנוסף לניסויים בבעלי חיים, אנו להרחיב ידע לגבי התגובה של epicardium האנושית. כאן, אנו מתארים שיטה לבודד, תרבות למבוגרים ו עוברית epicardial נגזר תאים אנושיים (EPDCs) במורפולוגיה אפיתל תאים דמויי, כדי לעודד את החובשים. במודל זה, אנו שואפים לחקור ולהשוות בהתנהגות התא epicardial למבוגרים ו עוברית.
היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא השימוש של חומר epicardial האנושי, אשר לא נחקרה ביסודיות. חשוב, פרוטוקול תרבות המתואר, בידוד ותא מספק שיטה אחידה אחת להפיק שני EPDCs חלוק עוברית, למבוגרים, המאפשרים השוואה ישירה בין מקורות שני תאים אלה. בנוסף, מאז epicardium הוא מבודד בהתבסס על המיקום שלו, זה מובטחת כי התאים נמצאים למעשה נגזרת epicardially17.
בעוד האדם שיטות בידוד EPDC הוקמו בעבר, אלה בעיקר להסתמך על פרוטוקולים תוצר איפה פיסות רקמת לב או epicardial הם מצופה על18,19מאכל התרבות התא. גישה זו בוחר ובכך במיוחד עבור תאים זה חלקית לאבד פנוטיפ אפיתל שלהם על מנת להעביר, ו זה נוטים יותר עוברים החובשים ספונטנית. בפרוטוקול הנוכחי, epicardium שהוא מעובד תחילה פתרון תא בודד אשר מאפשר את EPDCs מבודד לשמור על מצב אפיתל שלהם. שיטה זו מספקת ולכן מודל מוצק במבחנה ללמוד החובשים epicardial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ניסויים עם דגימות רקמה אנושית אושרו על ידי ועדת האתיקה של המרכז הרפואי של אוניברסיטת ליידן, תואמת הצהרת הלסינקי. כל השלבים מתבצעות עם ציוד סטרילי בתוך זרם תרבות תא ארון.
1. תכשירים
- הכן EPDC בינוני על ידי ערבוב של Dulbecco של הנשר ששונה בינונית (DMEM נמוך-גלוקוז), בינוני 199 (M199) על יחס 1:1. להוסיף 10% חום להשבית סרום שור עוברית (FBS, החום לא פעיל במשך 25 דקות ב- 56 ° C) והשלמה עם פניצילין U/mL 100, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין. לחמם את המדיום EPDC באמבט מים 37 º C.
- לחמם טריפסין 0.25%/EDTA (1:1) בתוך אמבט מים 37 º C.
- המעיל וולס עם ג'לטין. להוסיף ג'לטין 0.1% / PBS מכל קידוח, דגירה הלוחות למשך לפחות 15 דקות ב 37 º C. הנחיות לצלחת תרבות תא נדרש מסוכמים בטבלה1. הסר בזהירות את כל הנוזלים לפני ציפוי תאים.
- להכין מלאי פתרון של 10 מ מ SB431542 (SB), מדולל דימתיל סולפוקסיד (זהירות). להפוך 50 µL aliquots צינורות פוליפרופילן צנטריפוגה התחתון חרוט, כמו צינורות גלאים, ואחסן אותם ב-20 ° C. שימו לב כי SB aliquots יכול להיות הקרת פעם אחת בלבד.
2. אחזור ואחסון של הלב העוברי ובגירים דגימות
- לאחסן האנושי למבוגרים auricles ישירות על הסרת במהלך ניתוח בצינור 50-mL עם 15 מ"ל DMEM גבוהה-גלוקוז המכיל 10% FBS, פניצילין U/mL 100 ו- 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין ב 4 º C. בדרך כלל 3-5 ס מ גודל ודוגמאות ניתן לאחסן עד 48 שעות לאחר ניתוח.
- חנות ליבם עוברי המתקבל הפלה בחירה בחומר EPDC בינוני ב 4 ° C עד 24 שעות לאחר בידוד. עבור פרוטוקול זה, השתמש דגימות עם עידן הריונית בין שבועות 12-22. שימו לב כי ניתן להשתמש בלב שלם עבור בידוד של epicardium.
3. בידוד של השכבה Epicardial
- בזרימה שכבתית cabinet, להכין תבשיל 100-מ מ תא-תרבות עם PBS ולמקם droplet נפרד (~ 200 µL) ל- PBS במכסה. למלא צינור 15-מ ל מ ל מראש ומחוממת EPDC בינונית.
- המקום הרקמה לתוך המנה תרבית תאים מלאים PBS. ודא כי הרקמה הוא לחלח לעתים קרובות במהלך ההליך.
- שימוש של stereomicroscope, להסיר כל כך הרבה של השכבה epicardial מהרקמה ככל האפשר על ידי מתקלפת זה באמצעות מלקחיים.
הערה: epicardium ניתן לזהות כמו שכבה דקה מאוד, שקוף בחוזקה דבקה החיצוני של הלב (איור 1 א'). נסה להימנע זיהום עם רקמת שומן epicardial וכלי הדם, מאז זה ה"בלתי הבידוד. - לאסוף את חתיכות רקמה epicardial ה-droplet של PBS על המכסה.
- חותכים את הרקמה epicardial לחתיכות קטנות (0.5 מ מ3) באמצעות אזמל (איור 1B), או באמצעות קצות חדה מלקחיים קטנים. שימו לב כי החלקים צריך להיות מסוגל להעביר עם P1, pipet 000 עצה (שלב 3.6).
- להוסיף 1 מ"ל של טריפסין הרקמה epicardial, לאסוף את השברים טריפסין עם P1, 000 pipet עצה. להעביר את הרקמה לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 1.5-mL (איור 1C).
- דגירה הצינורית בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, תוך כדי טלטול-~ 60 סל ד.
- הסר את הצינור לאמבט מים, ולנקות החיצוני של הצינור עם 70% אתנול.
- לאפשר את הרקמה לשקוע לתחתית הצינור (איור 1D) ולהעביר בזהירות את תגובת שיקוע המכיל תאים epicardial אל הצינור 15-mL המכיל 5 מ"ל בינוני EPDC כדי להשבית את טריפסין.
- לחדש את הרקמה שנותרה בצינור צנטריפוגה חרוט עם טריפסין 1 מ"ל ומערבבים על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה.
- חזור על שלב 3.7 כדי 3.10 פעמיים. בשלב הסופי, לאחר סך של 30 דקות של דגירה טריפסין, להעביר את תגובת שיקוע והן את הרקמה epicardial הנותרים לתוך הצינור המכיל EPDC בינונית.
- כאשר כל התאים נאספים EPDC בינוני, בעדינות עוברים ההשעיה מזרק 10-mL עם מחט 19-מד לתוך צינור 15-mL החדש מכנית מביצועם התאים (איור 1E).
הערה: הקפד homogenize התליה על-ידי pipetting למעלה ולמטה עוברים גם הפתרון המחט כדי למנוע את המחט מקבל נחסמת. - בהמשך מביצועם התאים, חזור על שלב 3.12 עם מחט 21-מד.
- מניחים מסננת תא 100-מיקרומטר על גבי צינור 50-mL ולהעביר את המדיום המכילות את התאים epicardial על גבי מסננת באמצעות פיפטה של 10-mL כדי להסיר כל גושים שנותרו (איור 1F).
- לשטוף את מסננת כדי לאסוף תאים שיורית מאת pipetting בינוני EPDC מ על גבי מסננת.
- Pipet התליה תא מהצינור 50-mL לתוך צינור 15-mL. מאז התאים שוקעים לתחתית הצינור, לנער את הפתרון בעדינות לפני pipetting.
הערה: במהלך השלב זה לא הכרחי, צינור יותר קטן עזרי ויזואליזציה של בגדר לאחר צנטריפוגה. - צנטריפוגה-200 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (איור 1 ג'י).
- הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא (איור 1 H) בהיקף הנדרש EPDC בינוני (טבלה 1).
הערה: עבור העובר EPDCs, להשתמש ישירות EPDC בינוני המכיל 10 מיקרומטר של המדכא קינאז ALK5 (EPDC + SB). יכול להיות מצופה תאים בוגרים ללא SB במהלך המעבר הראשון. - צלחת התליה תא על תרבות ג'לטין מצופה הלוחות (איור 1I). הגודל של הבאר תלוי בגודל של דגימת הרקמות epicardial (טבלה 1). שימו לב כי confluency נמוך יניעו את המופע של החובשים.
- מקם את התאים בחממה לפחות 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 כדי לאפשר את התאים לצרף הצלחת תרבות.
4. תרבות של EPDCs
- לחדש את המדיום EPDC + SB לפחות כל 3 ימים.
- לבדוק את התאים לפחות כל 3 ימים באמצעות המיקרוסקופ. כאשר התאים מגיעים confluency, דהיינו, כאשר לוח תרבות מכוסה עם תאים, המעבר את התאים על יחס שטח של 1:2. שימו לב כי להגיע confluency יכול לקחת ~ 5-10 ימים.
- האחות המדיום באמצעות pipet או מערכת השאיפה עם, למשל, pipet זכוכית.
- לשטוף את התאים בקפידה על-ידי הוספת PBS לתאים. בעדינות מערבולת את הצלחת, מחוק לגמרי מגניב.
- הוסף טריפסין לצלחת. סובב בעדינות את הצלחת לכסות את כל התאים עם טריפסין, דגירה את הצלחת. בשביל 1 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
הערה: השתמש כמו טריפסין קטן ככל האפשר (אינדיקציה: µL 200 לאדם טוב של 6 טוב צלחת) - הקש את הצלחת לנתק באופן מכני את התאים מהחלק התחתון של הלוח. השתמש במיקרוסקופ כדי בדיקה חזותית אם התאים יש מנותק. אם לא, תקופת דגירה לצלחת תרבות תא של רגע מיותר.
- להוסיף נפח בינוני EPDC + SB הנדרש לתאים, resuspend על ידי pipetting למעלה ולמטה, להעביר התליה תא צלחת חדשה של תרבות ג'לטין מצופה.
הערה: באופן כללי, תאים יכולים להישמר מורפולוגיה המרוצף עד המעבר 8.
5. אינדוקציה של החובשים ב- EPDCs
- לזירוז החובשים, לנתק את התאים עם טריפסין והעברת התאים לג'לטין חדש מצופה בארות על יחס 1:2 משטח EPDC + SB בינוני, כפי שמתואר 4 ולאחר תקופת דגירה של פחות 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
- הסימון אם confluency הוא 50-70%, ואם EPDCs מורפולוגיה המרוצף.
הערה: Confluency משפיע על היכולת של EPDCs לעבור החובשים. - האחות המדיום מתאי ולשטוף את התאים בזהירות עם PBS (ראה שלב 4.2.1 - 4.2.2).
- לעורר תאים עם 1 ng/mL TGFβ3 EPDC בינוני ומניחים בתוך אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 במשך 5 ימים. שימו לב כי במהלך גירוי, המדיום EPDC המכיל TGFβ3 אין המיועדים לחידוש מלאי.
- נטר את התאים מדי יום. לאחר 5 ימים, תאים שעברו החובשים מזוהים עם מורפולוגיה בצורת כישור (איור 2 א).
- תרבות בצורת פלך EPDCs על פי השיטה המתוארת ב- 4 ללא תוספת של SB או TGFβ למדיום EPDC. שימו לב: באופן כללי, פלך בצורת EPDCs יכול להיות מחונן עד מעבר 20
- לאמת את המופע של החובשים עם צביעת immunofluorescent באמצעות נוגדנים נגד סמנים mesenchymal αSMA או Vimentin או phalloidin כדי לזהות את היווצרות F-אקטין מתח סיבים (איור 2B), או באמצעות PCR לרביעיית עבור גנים הקשורים החובשים ( למשל, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-קדהרין, MMP3, חילזון, שבלול) (איור 2C ו לטבלה 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן, אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול פשוטה כדי לבודד EPDCs מן האדם למבוגרים ו עוברית ברקמת הלב (איור 1). פרוטוקול זה מנצל מיקום נגיש epicardium בצד החיצוני של הלב (איור 1 א'). כתמים auricle הלב לאחר ניתוח מדגים כי WT1 + epicardium מוסר בעוד מטריצה חוץ-תאית subepicardial הבסיסית של רקמת שריר הלב להישאר ללא שינוי (איור 1J). אפיון מקיף בוצעה בעבר, הוכחת כי EPDCs להביע סמנים epicardial, למשל, ALDH1A2, TBX18, KRT8, KRT19 וחוסר ביטוי של אחרים סוגי תאים שוכנת בלב, למשל, PECAM1, ISL1, CD34 ו TNNT2. 17
מבוגר (איור 1 ג) והן EPDCs (איור 1 L) העובר תרבותי בנוכחות ALK5 קינאז מעכב SB431542 הצג של מורפולוגיה המרוצף. עם זאת, בהתאם לתנאי התורם ואת התרבות, EPDCs העובר ניתן לעבור החובשים למרות נוכחותם של SB. התוצאה יכולה להיות בצורת כישור תאים בתוך אוכלוסיית תאים קאבלסטון (ראה חצים באיור1 L). שימו לב כי הבידוד של תאים בצורת המרוצף של רקמה עוברית אינה תמיד אפשרית, עלול לגרום ההטיה של בעיקר בצורת פלך בתאים. מאז תאים אלה גדלים מהר יותר, הם במהירות והדבר סוגי תאים אחרים.
החובשים יכולה להיגרם על ידי המקננת עם TGFβ320 במשך 5 ימים בתאי העובר והן למבוגרים, כפי שמתואר על ידי מעבר ברור מורפולוגי בצורת פלך בתאים (איור 2 א). כפי שמתואר עם הפקד אינו מטופל ("ריק"), EPDCs העובר יעבור החובשים ספונטנית על הסרה של SB, בעוד EPDCs למבוגרים בלבד יעבור החובשים על גירוי עם TGFβ3. כדי לאמת את החובשים, EPDCs היו immunostained עם שריר חלק-אלפא אקטין (αSMA), סמן mesenchymal (איור 2B). יתר על כן, החובשים אושרה EPDCs למבוגרים באמצעות לרביעיית-PCR downregulation מראה של סמן epicardial WT1 וקולטנים upregulation של סמנים mesenchymal POSTN, αSMA, 1A1 קולגן, MMP3, N-קדהרין (איור 2C). ניסויים מקיפים לגבי החובשים epicardial למבוגרים ו עוברית מתפרסמים לפני17.
| רקמה | סוג טוב | אזור גידול התא (2ס מ) | נפח בינוני (mL) | תוספת של SB |
| עוברית | 24 | 1.9 | 0.5 | ישירות |
| מבוגר קטן (< 4 ס מ) | 12 | 3.8 | 1 | לאחר המעברst 1 |
| מבוגר גדול | 6 | 9.6 | 2 | לאחר המעברst 1 |
| (> 4 ס מ) |
טבלה 1: מנחה לבחירת לצלחת התרבות תאים מתאים. גודל טוב הנדרש תלוי בסכום של epicardial תאים מבודדים. קווים מנחים אלה יכולים לשמש כלל אצבע כדי לבחור את הצלחת התרבות תאים מתאים.
| ג'ין | רצף |
| WT1 קדימה | חטיבתי CTT גה TGC ATG ACC TG |
| WT1 הפוך | בלשכת המידע לתיירים TCT GTA TTG GGC TCC GC |
| N-קדהרין קדימה | חטיבתי ACC GAC המרכז לאמנות עכשווית AAC AGC AAC |
| N-קדהרין הפוכה | GCA GCA ACA GTA AGG ACA להתחייבויותיו AAC |
| POSTN קדימה | לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה GGC AAA חטיבתי CTC אגא GT |
| POSTN הפוך | GGC TGA לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה AGG TGC TAA AG |
| SMA קדימה | CCG לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה גה AAT GAC TCA AA |
| SMA הפוכה | גה לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה אתא GCC ACG CTC AG |
| MMP3 קדימה | TGG ATG CCG החתול ATG AAG |
| MMP3 הפוך | חטיבתי AAA TGG CTG החתול CGA |
| COL1A1 קדימה | המרכז לאמנות עכשווית גה גה CTG GTA החתול חטיבתי CA |
| COL1A1 הפוך | CGC החתול מעשה CGA AAT GGG AAT |
| GAPDH קדימה | אילנה CAC ATC GCT חטיבתי ACA C |
| GAPDH הפוך | GCC סי טק GAC לפנות לסוכנות ATC C |
| B2M קדימה | ACA CTG AAT TCA המרכז לאמנות עכשווית CCC CT |
| B2M הפוכה | GCT טק ATG TCT CGA TCC CAC T |
בטבלה 2: פריימר רצפים שימוש עבור אימות של החובשים ב- EPDCs. רצפים של תחל ואחורה המשמש לרביעיית-PCR כדי לקבוע שהביטוי של החובשים מספר הקשורים גנים EPDCs למבוגרים.
איור 1 : בידוד של Epicardial נגזר תאים (EPDCs). (א) Depicted הוא auricle למבוגרים להסיר מן הלב האנושי עם שכבה חיצונית דקה עלי הלוואי קרומיים, epicardium, אשר יוסר. מצביע החץ השחור epicardium. (B-אני) ייצוג ויזואלי של שיטות בידוד EPDCs. מצביע החץ השחור בגדר התא. (J) Immunofluorescent מכתים של auricle לב עם או בלי דיסקציה של epicardium. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר (K) נציג תמונות של שני שונים למבוגרים EPDC ומשום תרבותי עם תמונות SB. (L) נציג של שני שונים בעובר EPDC ומשום תרבותי עם SB. שחור החצים מצביעים על mesenchymal, כמו תאים עוברית EPDC תרבות. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : אימות של החובשים בתאי אדם מבוגר ו עוברית Epicardial נגזר (EPDCs). EPDCs למבוגרים ו עוברית היו בתרבית עם SB, אינם מטופלים (ריק) או מגורה עם TGFβ3 במשך 5 ימים. (א) שדה בהיר נציג תמונות. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. (B) Immunostaining דאפי, αSMA. סרגל קנה מידה: 100 mRNA רמות מיקרומטר. (C) של גנים הקשורים החובשים, נקבע EPDCs למבוגרים באמצעות לרביעיית-PCR. ערכים נמדד היו מנורמל לביטוי GAPDH ו B2M. ערכים מתוארים אומר + SD 2 ^-ΔΔct (n = 2). קיצורים: הגידול של WT1:Wilms 1, MMP3: מטריקס מטאלו-פרוטאינאז 3, POSTN:Periostin, αSMA: אלפא אקטין שריר חלק, Col1A1:Collagen 1A1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן נתאר של פרוטוקול מפורט כדי לבודד והתרבות תאים epicardial הראשית נגזר לבבות אדם מבוגר ו עוברית. אפיון מקיף של תאים אלה כבר שפורסמו בעבר17. אנחנו הראו כי שני סוגי תאים יכול להישמר כתאי אפיתל ריצוף דמוי כאשר תרבותי עם החומר המדכא קינאז ALK5 SB431542. החובשים הוא חלק בלתי נפרד של הפעלת epicardial ויוו במהלך הפיתוח והן התגובה לאחר פציעה. החובשים יכולים להילמד בשיטה זו על-ידי תוספת של TGFβ. חשוב לציין, הבחנו בעבר כי EPDCs העובר עוברים במהירות החובשים ספונטנית כאשר SB מוסר, בעוד EPDCs למבוגרים בלבד עוברים החובשים על גירוי17. ללמוד תהליכים אלה ב- EPDCs העובר עשויים לסייע להבין כיצד להפעיל בצורה אופטימלית את epicardium למבוגרים לאחר נזק.
השיטה הציג מסתמך על החומר המטופל, אשר מתקבל במהלך הניתוח. לכן, יש לצפות מספר וריאציות במצב של החומר מבודדים, אשר עקב השתנות המטופל או את המהירות שבה החומר נאסף בתיאטרון ההפעלה או. וריאציה זו עשוי להסביר הבדלים בהליך: 1) בקלות יכול להיות גזור את epicardium של שריר הלב, 2) דבקותה של תאים בודדים לצלחת, 3) את היכולת למנוע או עוברים החובשים, ואת מהירות התפשטות 4). באופן כללי, בידוד מהיר עדיפה על הישרדות cell. הנקודה העיקרית היא פילינג את epicardium של שריר הלב. אם epicardium בחום דבקה הרקמה הבסיסית, טיפול קדם 15-מין של רקמת הלב עם טריפסין יכול לעזור להסיר את epicardium בקלות רבה יותר. יתר על כן, היעילות של הטיפול טריפסין תלויה במספר גורמים, לרבות הפעילות טריפסין, ההרכב של הרקמה. לכן, אם תשואה נמוכה נצפית, זמן הדגירה עם טריפסין יכול להיות מותאם. בנוסף, אם אין גלולה תא גלוי לאחר ספינינג למטה, הפתרון אולי לא יש כבר לגמרי הפומבית לפני הפעלת דרך המסנן. ערבוב הפתרון לפני הפתרון עובר המזרק או שימוש נוסף, מזרק קטן יכול להיות שימושי מביצועם התאים. גודל טוב עבור זריעת EPDCs להתייחס בזהירות כדי לאפשר תאים לשמור על מצב אפיתל שלהם. טבלה 1 נותן אינדיקציה, אבל ניתן לסטות מן הנחייה זו כאשר, לדוגמה, ניתן להשתמש רק חלק קטן של פעימות לב העובר, ציפוי ב קטן יותר טוב נוח יותר.
מאז תאים עוברית יעבור החובשים מיד ללא SB17, EPDCs העובר צריך תמיד להיות מצופה SB. עם זאת, EPDCs למבוגרים נוטים לשמור על מורפולוגיה אפיתל שלהם, ולכן יכול להיות מצופה ללא SB במהלך ה 48 הראשון של הקטע הראשון, כדי לקדם את הדבקות תא. לאחר המעבר הראשון, הן למבוגרים והן העוברי EPDCs ברציפות מתורבתים עם SB כדי למנוע החובשים ספונטנית. בנוסף, צפיפות נמוכה תא היא בגורם מפעיל חשוב עבור החובשים. EPDCs צריך ולכן לעולם לא להיות מחונן מתחת confluency 50% מצד שני, אם החובשים רצוי, ודא כי EPDCs הן לא נזרע גם בצפיפות, להישאר מתחת 70% confluency. על פי פרוטוקול זה מנצל TGFβ3, גירוי עם TGFβ1 ו-2 יכול לגרום החובשים ב EPDCs גם כן (תצפיות שלא פורסמו).
ב פרוטוקול זה, תאים מתפצלים ישירות מבלי ספינינג, מאחר שאנו צופים של הישרדות התא התחתון בעת שימוש לצנטריפוגה. לכן, חיוני להשתמש כמויות נמוכות של טריפסין כדי להבטיח את הביטול שלה בעת הוספת סרום המכיל בינוני.
לאחר מעברים ~ 6-8, EPDCs עם מורפולוגיה אפיתל גם יפסיקו לגדול או יעבור החובשים באופן ספונטני. לכן אנו משתמשים לניסויים, חלוק EPDCs בין מעבר 3. ומעבר 6. לעומת זאת, EPDCs עם מורפולוגיה mesenchymal פגיעים פחות והוא יכול להיות בתרבית עד מעבר 20. בניסויים, עם זאת, מעולם לא השתמשנו ציר EPDCs לאחר המעבר 10בתאנון .
מאז epicardium מוצג בחלק החיצוני של הלב, כדי להפריד בין רקמות הבסיסית, האותנטיות של התאים ניכרת, הסיכוי לזיהום משמעותי הוא נמוך. למרות רקמת שומן או כלי הדם לפעמים מקל על השכבה epicardial מבודדים, הרוב המכריע של תאים אלה לא יעבור את מסננת בתקופת הבידוד, אחרת לא יכולה לשרוד בתרבות תא EPDC. יתר על כן, כפי שהוזכר קודם לכן, שימוש בחומר האנושי מספק מודל ייחודי לחקור התנהגות אנושית תא epicardial. ידוע כי, למשל, רקמת שומן epicardial הוא שונה בין המינים, תוך הדגשת הצורך האנושי תא epicardial מודלים21.
יצוין כי auricles הלב התקבלו במהלך הניתוח על חולה לב, ולכן הבדלי מחלה, תרופות בשימוש, גיל ומין של התורם עשוי להשפיע על הפארמצבטית הניסויים. כדאי לכן לבצע ניסויים ומשום מספר כדי להשיג תוצאות חוקי ולאפשר מסקנות מוצק. יתר על כן, בהתאם שאלת המחקר, אחד יכול לבחור במיוחד להשתמש רק epicardium בחולים עם מחלת איסכמי או חולים עם וחריגות-איסכמי, אשר צפויים להתנהג אחרת.
יש סוברים כי epicardium פרפור ייתכן יש מאפיינים ברורים של החדר epicardium2, ובכך מפקפק אם epicardium נגזר auricle פרפור הלב מספק מודל תקף להתנהגות epicardial. בהקשר זה, חשוב לציין כי לא נמצאו הבדלים בין עוברי פרפור, חדרית נגזר EPDCs (נתונים שלא פורסמו). עם זאת, באמצעות epicardium מן הנוזלים למבוגרים האנושי יהיה המקור האולטימטיבי תא כדי לאמת זאת. ובכל זאת, איסוף דגימות גדולות של אדם מבוגר החדרים לבידוד EPDC הוא פולשני ביותר עבור המטופל, ולכן כיום לא ריאלי בבית החולים הזה.
הבחנו כי SB הוא לא תמיד מספיק כדי למנוע אמבולנס, בעיקר ב EPDCs בעובר. כאשר EPDCs העובר עוברים החובשים בנוכחות SB, אנו מסירים אותם מן הניסויים. כתוצאה מכך, התאים המשמש ניסויים ייבחרו על יכולתם לשמור על פנוטיפ אפיתל בתגובה SB. אנו משערים כי תאים עוברית כבר יכול להיות מעבר לסף מסוים בתהליך של החובשים, כי עיכוב עם SB אינו מסוגל לעצור את זה.
מודל זה תא epicardial יש מספר יישומים, שכן הן בפיתוח והן את epicardium למבוגרים יכול ייחקרו. במעבדה שלנו, אנו מתמקדים שיפור ההיענות משובי epicardial לאחר נזק הלב. EPDCs למבוגרים יכול לשמש לבדיקת תרכובות אשר זירוז אמבולנס, במטרה למצוא תרופה טיפולית פוטנציאל עבור מענה משובי ameliorated של epicardium. בנוסף, זה ניתן למדוד גורמים מופרש על ידי EPDCs כדי להבין את paracrine למנהיגנו (re) יצירת שריר הלב. יתר על כן, מאז הבחנו כי העובר EPDCs נוטים יותר עוברים החובשים באופן ספונטני בהשוואה למבוגרים EPDCs, אנחנו חוקרים את ההבדלים בין EPDCs העובר ואת למבוגרים. קביעת מנגנון הבסיסית של הפעלת עוברי מוגבר יכול לספק רמז לשיפור ההפעלה epicardial בלב למבוגרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי הולנד הארגון עבור מדעי למחקר (בתחרות) (VENI 016.146.079), LUMC מחקר לאגודה גם AMS, וגם Stichting Bontius LUMC (MJG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
| Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
| Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
| Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
| Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
| Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
| 10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
| Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
| Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet controller | Integra | 155 015 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Waterbath | GFL | 1083 |
References
- Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate. Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).
- Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development. Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).
- Zhou, B., Ma, Q., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).
- Smits, A., Riley, P. Epicardium-Derived Heart Repair. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).
- Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor. Developmental Biology. 250 (1), 198-207 (2002).
- Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).
- Lavine, K. J., Yu, K., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).
- Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).
- Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).
- Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns. Circulation Research. 96 (5), (2005).
- Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).
- van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PloS one. 7 (9), e44692 (2012).
- Zhou, B., Honor, L. B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).
- Smart, N., Bollini, S., et al. De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury. Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).
- Zangi, L., Lui, K. O., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).
- Clunie-O'Connor, C., Smits, A. M., et al. The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).
- Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).
- Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGFβ-signaling and WT1. Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).
- Chechi, K., Richard, D. Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue. International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).
