Summary
Epicardium играет решающую роль в развитии и ремонт сердца, предоставляя клетки и факторы роста к стенке миокарда. Здесь мы описываем метод культуры клеток человека первичной эпикардиальной который позволяет исследование и сравнение характеристик их развития и взрослых.
Abstract
Epicardium, слой эпителиальных клеток, охватывающих миокарда, играет важную роль во время развития сердца, а также в ответе ремонт сердца после ишемического повреждения. При активации, эпикардиальной клетки претерпевают процесс, известный как эпителиального мезенхимальных перехода (EMT) предоставлять клеток к регенерации миокарда. Кроме того epicardium вносит через секреции основных паракринными факторов. В полной мере оценить регенеративный потенциал epicardium, требуется модель клеток человека. Здесь мы приводим романа ячеечная модель культуры для получения первичных клеток эпикардиальной производных (EPDCs) от человека взрослых и плода сердечной ткани. Чтобы изолировать EPDCs, epicardium расчлененный извне сердце образца и перерабатывается в одну ячейку подвеска. Далее EPDCs покрытием и культивировали в EPDC среде, содержащей ALK ингибитор 5-киназы SB431542 для поддержания их эпителиального фенотип. EMT индуцируется стимуляции с TGFβ. Этот метод позволяет, в первый раз, изучение процесса человеческого эпикардиальной EMT в контролируемых условиях и облегчает набирает больше проницательности в secretome EPDCs, которые могут помочь регенерации сердца. Кроме того этот единообразный подход позволяет для прямого сравнения эпикардиальной поведения человека взрослых и плода.
Introduction
Epicardium, эпителиального пласта одной ячейки, что конверты сердца, имеет жизненно важное значение для развития сердечной и ремонт (обзор в Смитс et al. 1). вследствие порока развития, epicardium возникает от proepicardial орган, маленькая структура, расположенный на базе развивающихся сердца. Вокруг развития день E9.5 в мыши и 4 недели после зачатия в человека клетки начинают мигрировать из этой структуры цветная капуста и охватывают развивающихся миокарда2. Как только на одной эпителиальных клеток образуется слой, часть эпикардиальной клеток проходит эпителиальных мезенхимальных перехода (EMT). В ходе EMT клетки теряют их эпителиального характеристики, такие как ячеек спайки и получить мезенхимальных фенотип, который дает им способность мигрировать в развивающихся миокарда. Сформированные эпикардиальной производных клетки (EPDCs) могут дифференцироваться в нескольких типов сердечных клеток, включая фибробласты, клетки гладких мышц и потенциально кардиомиоцитов и эндотелиальных клеток3, хотя дифференциация последних двух ячеек населения остается предметом обсуждения (обзор в Смитс и др. 4). Кроме того, epicardium обеспечивает поучительным паракринными сигналы в миокарде регулировать ее роста и васкуляризация5,6,,78. Многочисленные исследования показали, что нарушение эпикардиальной формирования приводит к пороков в сердечной мышцы9,10, сосудистую11и проведение системы12, подчеркивая основные вклад epicardium к формированию сердца.
Хотя в самом взрослых epicardium присутствует как спящие слой, он становится возобновлена после ишемии13. После травмы эпикардиальной реактивации резюмирует некоторые из процессов описал для сердца развития, включая распространение и EMT14, хотя и менее эффективно. Интересно хотя точный механизм не поняты, эпикардиальной вклад ремонт может быть улучшена путем обращения с, например, Thymosin β415 или изменение VEGF-А мРНК16, что приводит к улучшенное сердечной функция, после инфаркта миокарда. Epicardium поэтому считается интересный источник клеток для повышения внутреннего ремонта потерпевшего сердца.
Механизмы развития сердца часто изъятый во время травмы, хотя и в менее эффективным способом. Поисках эпикардиальной активаторы важно, что мы можем определить и сравнить на полную мощность плода и взрослых epicardium. Кроме того с терапевтической точки зрения, важно, что, помимо экспериментов на животных, мы расширить знания относительно реакции человеческого epicardium. Здесь мы описываем метод, чтобы изолировать и культуры взрослых и плода эпикардиальной производных клетки человека (EPDCs) в морфологии как эпителиальных клеток и побудить EMT. С этой моделью мы стремимся изучить и сравнить поведение взрослых и плода эпикардиальной клеток.
Основным преимуществом этого протокола является использование эпикардиальной материала человека, который не были тщательно изучены. Важно отметить, что описанные изоляции и клетки культуры протокол обеспечивает один единый метод для получения обоих EPDCs плода и взрослых булыжником, позволяя прямое сравнение между этими двумя клетки источниками. Кроме того поскольку epicardium изолирован, основанный на ее расположении, обеспечивается что клетки являются на самом деле epicardially производных17.
В то время как человека методы изоляции EPDC были созданы ранее, эти основном полагаются на протоколы нарост, где кусочки ткани, сердца или эпикардиальной покрыты на клетки культуры блюдо18,19. Этот подход таким образом выбирает специально для клетки, частично теряют их эпителиального фенотипом для миграции, и что более подвержены проходят самопроизвольно EMT. В текущем протоколе epicardium сначала обрабатывается в одну ячейку решение, которое позволяет изолированных EPDCs для поддержания их эпителия. Таким образом, этот метод обеспечивает твердых в vitro модель для изучения эпикардиальной EMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты с образцами тканей человека были утверждены Комитетом по этике медицинский центр Университета Лейдена и соответствует Хельсинкской декларации. Все действия выполняются с стерильных оборудования в потоке культуры клеток кабинета.
1. Подготовка
- Подготовка среднего EPDC, смешивая Дульбекко изменение орла среднего (DMEM низким глюкозы) и среда 199 (M199) в соотношении 1:1. Добавить 10% тепла инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС, тепла, инактивированная 25 мин на 56 ° C) и дополнить с 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мг/мл. Предварительно теплой среде EPDC в ванну воды 37 ° C.
- Предварительно теплой трипсина 0.25%/EDTA в ванну воды 37 ° C (1:1).
- Герб скважин с желатином. Добавить 0,1% желатина/PBS в каждой скважине и инкубировать пластины для по крайней мере 15 минут при 37 ° C. В таблице 1кратко излагаются руководящие принципы для плиты культуры необходимые ячейки. Осторожно удалите все жидкости до гальванических клеток.
- Подготовьте раствор 10 мм SB431542 (SB), разбавляют в ДМСО (осторожно). Сделать 50 мкл аликвоты в полипропиленовые пробирок коническое дно, как Eppendorf трубы и хранить их при-20 ° C. Обратите внимание, что SB аликвоты можно разморозить только один раз.
2. получение и хранение образцов взрослых и плода сердца
- Хранить человека взрослых ушных раковин непосредственно после удаления во время операции в 50-мл пробирку с 15 мл DMEM высокой глюкозы, содержащие 10% FBS, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мг/мл при 4 ° C. Образцы, как правило, 3-5 см в размерах и может храниться до 48 часов после вскрытия.
- Храните сердца плода, полученные из факультативных аборта материала в EPDC среде при температуре 4 ° C до 24 ч после изоляции. Для этого протокола используйте образцы с гестационного возраста между 12-22 недель. Обратите внимание, что всем сердцем может использоваться для изоляции epicardium.
3. изоляция эпикардиальной слоя
- В Шкаф ламинарный поток подготовить 100-мм клеток культуры блюдо с PBS и место отдельные капли (~ 200 мкл) PBS в крышке. Заполните 15 мл с подогретым среднего EPDC 5 мл.
- Место ткани в культуре клеток блюдо, заполнены с PBS. Убедитесь, что ткань смачивают часто во время процедуры.
- С помощью стереомикроскопом, удалите столько эпикардиальной слоя из образца ткани как можно скорее, слезать с помощью щипцов.
Примечание: Epicardium может быть признано как очень тонкий, прозрачный слой жестко придерживаться вне сердца (рис. 1A). Старайтесь избегать загрязнения с эпикардиальной жировой ткани и кровеносных сосудов, поскольку это будет препятствовать изоляции. - Соберите кусочки эпикардиальной ткани в капли PBS на крышке.
- Вырежьте эпикардиальной ткани на мелкие кусочки (30,5 мм) с помощью скальпеля (рис. 1B) или острый советы малых щипцами. Обратите внимание, что части должны быть в состоянии пройти P1, 000 наконечник пипетки (шаг 3,6).
- Добавьте 1 mL трипсина эпикардиальной ткани и собирать куски и трипсина с P1, 000 наконечник пипетки. Передача ткани в 1,5 мл конические центрифуги трубку (рис. 1 c).
- Инкубируйте трубку в водяной бане 10 минут, 37 ° C при встряхивании в ~ 60 об/мин.
- Снять трубку из водяной бани и Очистите наружную трубу с 70% этиловом спирте.
- Разрешить ткани опускаться на дно трубки (рис. 1 d) и тщательно передачи супернатанта, содержащий эпикардиальной клетки для 15-мл пробирку, содержащую 5 мл EPDC среднего для инактивации трипсина.
- Пополнять оставшиеся ткани в конической пластиковых пробирок с 1 мл трипсина и смешайте нежно закупорить вверх и вниз.
- Повторите шаг 3.7 в 3.10 два раза. На заключительном этапе после всего 30 минут инкубации трипсина, передача супернатант и оставшиеся эпикардиальной ткани в пробирку, содержащую среднего EPDC.
- Когда все клетки собраны в EPDC среде, мягко пройти подвеска через шприц 10 мл с 19-иглы в новой 15-мл пробирку для механически отделить клетки (Рисунок 1E).
Примечание: Не забудьте гомогенизировать подвеска, закупорить вверх и вниз перед передачей решение через иглу, чтобы предотвратить получение помешано иглы. - Для дальнейшего отмежеваться клетки, повторите шаг 3.12 с иглой 21-го калибра.
- Место стрейнер ячейки 100 мкм на вершине 50 мл и передаче носитель, содержащий эпикардиальной клетки на сито с помощью пипетки 10-мл, чтобы удалить все оставшиеся сгустки (Рисунок 1F).
- Промойте фильтр для сбора остаточной клетки, закупорить среднего EPDC 5 мл на сито.
- Накапайте суспензии клеток с 50 мл трубки в 15 мл. Поскольку клетки опускаться на дно трубки, осторожно встряхните решение перед закупорить.
Примечание: Хотя этот шаг не является необходимым, трубу меньшего средства визуализации гранул после центрифугирования. - Центрифуга на 200 x g 5 мин при комнатной температуре (рис. 1 g).
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток (рис. 1 H) в необходимый объем EPDC среды (Таблица 1).
Примечание: Для плода EPDCs, непосредственно используйте EPDC носитель, содержащий 10 мкм ингибитора киназы ALK5 (EPDC + SB). Взрослые клетки может быть покрытием без SB во время первого прохода. - Пластина суспензию клеток на желатин покрытием культуры пластины (рис. 1I). Размер также зависит от размера образца эпикардиальной ткани (Таблица 1). Обратите внимание, что низкая confluency вызовет возникновение EMT.
- Место клетки в инкубаторе для по крайней мере 48 ч при 37 ° C, 5% CO2 разрешить клетки, чтобы прикрепить к пластине культуры.
4. Культура EPDCs
- Пополнение EPDC + SB среднего по крайней мере каждые 3 дня.
- Проверьте ячейки по крайней мере каждые 3 дня, используя микроскоп. Когда клетки confluency, то есть, когда пластина культуры полностью покрыты клетки, проход клетки в соотношении 1:2 поверхности. Обратите внимание, что достигнув confluency можно взять ~ 5-10 дней.
- Аспирационная средство, с помощью пипетки или системы аспирации, например, стеклянные пипетки.
- Тщательно вымойте клетки путем добавления PBS в клетки. Аккуратно водоворот пластину и аспирационная PBS.
- Добавление трипсина к пластине. Осторожно поверните пластину для покрытия всех клеток с трипсина и инкубировать пластину за 1 мин при температуре 37 ° C.
Примечание: Использовать как мало трипсина максимально (индикация: 200 мкл на хорошо 6 хорошо пластины) - Нажмите пластины механически отделить клетки из нижней части пластины. Используйте Микроскоп визуально проверить, если отдельные клетки. Если нет, то инкубации пластину культуры клеток для дополнительных минут.
- Добавьте необходимый объем EPDC + SB среднего клетки, Ресуспензируйте, закупорить вверх и вниз и передачи суспензию клеток к новой плите культуры желатин покрытием.
Примечание: В общем, клетки могут храниться в морфологии булыжник до прохода 8.
5. индукция EMT в EPDCs
- Чтобы побудить EMT, разбить ячейки с трипсина и передачи клетки к новым желатин покрытием скважин в соотношении 1:2 поверхности в среде EPDC + SB, как описано в 4 и инкубировать в течение 24 часов при 37 ° C, 5% CO2.
- Проверка если confluency является 50-70% и если EPDCs булыжником морфологии.
Примечание: Confluency влияет на способность EPDCs пройти EMT. - Аспирационная среднего из клеток и вымыть клетки тщательно с PBS (см. шаг 4.2.1 - 4.2.2).
- Стимулируют клетки с 1 нг/мл TGFβ3 в EPDC среде и поместите их в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO2 на 5 дней. Обратите внимание, что во время стимуляции, среднего EPDC, содержащих TGFβ3 не должны быть пополнен.
- Ежедневно контролировать клетки. После 5 дней клетки, которые прошли EMT распознаются веретеновидной формы морфологии (рис. 2A).
- Культура веретеновидной формы EPDCs по методу, описанному в 4 без добавления SB или TGFβ в EPDC среде. Обратите внимание, что в целом, веретеновидной формы EPDCs может быть культивировали до прохода 20.
- Проверка вхождения ЕМТ с immunofluorescent окрашивание с помощью антител против αSMA мезенхимы маркеры или виментин или Фаллоидин обнаружить формирования F-актина стресс волокон (рис. 2B), или qRT ПЦР для ЕМТ связанных генов ( например, РК1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-Кадгерины, MMP3, Улитка, слизень) (рис. 2 c и Таблица 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы приводим простой протокол для изоляции EPDCs от человека взрослых и плода сердечной ткани (рис. 1). Этот протокол использует легко доступном месте epicardium на внешней стороне сердца (рис. 1A). Пятнать ушных раковин сердца после рассечения демонстрирует, что РК1 + epicardium удаляется в то время как основной subepicardial внеклеточного матрикса и миокарда ткани остаются нетронутыми (Рисунок 1J). Обширные характеристика была проведена раньше, демонстрируя, что EPDCs Экспресс эпикардиальной маркеров, например, ALDH1A2, TBX18, KRT8, KRT19 и отсутствие выражение других типов клеток сердца резидентов, например, PECAM1, ISL1, CD34 и TNNT2. 17
Взрослый (Рисунок 1 K) и плода (рис. 1 L) EPDCs культивировали в присутствии ALK5 киназы ингибитора SB431542 шоу булыжником морфологии. Однако в зависимости от условий доноров и культуры, плода EPDCs можно пройти EMT несмотря на присутствие SB. Это может привести к веретеновидной формы клеток в составе населения булыжником клеток (см. стрелки на рисунке 1 Л). Имейте в виду, что изоляция булыжник образный клетки от плода ткани не всегда осуществимо и может привести к расчёту основном веретеновидной формы клеток. Поскольку эти клетки растут быстрее, они будут быстро зарастают другие типы клеток.
EMT может быть вызвана инкубации с TGFβ320 на 5 дней в как взрослых, так и плода клетки, как продемонстрировано четких морфологических переход к веретеновидной формы клеток (рис. 2A). Как продемонстрировал с необработанной управления («пустой»), плода EPDCs будет проходить спонтанное EMT после удаления SB, в то время как взрослых EPDCs будет только пройти EMT после стимуляции с TGFβ3. Чтобы проверить EMT, EPDCs были immunostained с альфа гладких мышц актина (αSMA), маркер мезенхимы (рис. 2B). Кроме того было подтверждено EMT в взрослых EPDCs, используя qRT ПЦР показаны Даунрегуляция эпикардиальной маркера РК1 и upregulation мезенхимальных маркеров POSTN, αSMA, коллаген 1A1, MMP3 и N-Кадгерины (рис. 2 c). Всеобъемлющие эксперименты о взрослых и плода эпикардиальной EMT публикуются до17.
| Ткани | Ну типа | Зона роста клеток (2см) | Объем среднего (мл) | Добавление SB |
| Плода | 24 | 1.9 | 0.5 | Прямо |
| Взрослый маленький (< 4 см) | 12 | 3.8 | 1 | После прохождения 1st |
| Взрослый большой | 6 | 9.6 | 2 | После прохождения 1st |
| (> 4 см) |
Таблица 1: руководство для выбора пластину культуры соответствующей ячейки. Требуется хорошо размер зависит от количества эпикардиальной изолированных клеток. Эти руководящие принципы могут использоваться как правило выбрать пластину культуры соответствующей ячейки.
| Джин | Последовательность |
| РК1 вперед | CAG CTT ГАА ТГК ГПТ АКК TG |
| РК1 реверс | TAT TCT GTA TTG GGC TCC GC |
| N-Кадгерины вперед | CAG АКК GAC ОСО AAC СМЖЛ AAC |
| N-Кадгерины реверс | GCA ГЦА ACA GTA ОБЩ ACA AAC УВД |
| POSTN вперед | GGA GGC AAA CAG КТК АГА GT |
| Реверс POSTN | GGC TGA GGA ОБЩ ТГК TAA AG |
| SMA вперед | CCG GGA ГАА AAT GAC TCA AA |
| SMA реверс | ГАА GGA ATA GCC ACG КТК AG |
| MMP3 вперед | CCG CAT ATG ATG TGG AAG |
| Реверс MMP3 | CAG AAA TGG КТГ CAT CGA |
| COL1A1 вперед | ОСО ГАА ГАА КТГ GTA CAT CAG CA |
| Реверс COL1A1 | CGC CAT АКТ CGA AAT GGG AAT |
| GAPDH вперед | AGC CAC УВД GCT CAG ACA C |
| Реверс GAPDH | GCC УГА TAC GAC УГА ATC C |
| B2M вперед | ACA КТГ AAT TCA КХЦ ОСО CT |
| B2M реверс | GCT TAC ATG TCT CGA TCC CAC T |
Таблица 2: грунтовка последовательностей, используемых для проверки EMT в EPDCs. Последовательности прямых и обратных грунты, используемых для qRT ПЦР для определения выражение несколько EMT связанных генов в взрослых EPDCs.
Рисунок 1 : Изоляция эпикардиальной производные ячейки (EPDCs). (A) изображенные является Взрослый ушных раковин, удалены из сердца человека с тонким слоем внешний мембранным, epicardium, который будет удален. Черная стрелка указывает на epicardium. (B-я) Визуальное представление метода изоляции EPDCs. Черная стрелка указывает на ячейку Пелле. (J) Immunofluorescent окрашивание сердце предсердие с и без вскрытия epicardium. Линейки: 50 µm. (K) представитель фотографии двух различных взрослых EPDC изоляции, культивируемых с SB. (L) представитель фотографии двух различных плода EPDC изоляции, культивируемых с SB. черные стрелки указывают мезенхимы подобных клеток плода EPDC культура. Линейки: 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Проверка EMT в взрослых и плода эпикардиальной получены клетки человека (EPDCs). Взрослых и плода EPDCs были культивируемых с SB, не лечить (пусто) или стимулировали с TGFβ3 на 5 дней. (A) представитель светлые области изображения. Линейки: 200 µm. (B) иммуноокрашивания для DAPI и αSMA. Линейки: 100 µm. (C) уровни mRNA ЕМТ связанных генов, определяется в взрослых EPDCs с помощью qRT ПЦР. Измеренные значения были нормализованы GAPDH и B2M выражение. Значения изображаются как mean + SD 2 ^-ΔΔct (n = 2). Сокращения: WT1:Wilms опухоли 1, MMP3: матрицы металлопротеиназы 3, POSTN:Periostin, αSMA: альфа гладких мышц актина, Col1A1:Collagen 1A1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем подробный протокол для изоляции и культуры первичной эпикардиальной клетки, полученные от человеческих сердцах взрослых и плода. Обширные характеристики этих клеток был ранее опубликованный17. Мы показали, что оба типы клеток можно сохранить как клетки эпителия булыжник как когда культивируемых с ингибитора киназы ALK5 SB431542. EMT является неотъемлемой частью эпикардиальной активации в vivo во время разработки и ответ после травмы. EMT могут быть изучены с помощью этого метода путем добавления TGFβ. Важно отметить, что мы ранее отметил, что плода EPDCs быстро проходят самопроизвольно EMT, когда SB удаляется, а Взрослый EPDCs только пройти EMT после стимуляции17. Изучение этих процессов в плода EPDCs может помочь в понимании того, как оптимально активировать взрослых epicardium после повреждения.
Представленный метод основывается на пациента материал, который получается во время операции. Таким образом можно ожидать несколько вариаций в состояние материала изоляции, которые являются либо из-за изменчивости пациента или скорость, с которой материал собирается в операционной театр. Этот вариант может объяснить различия в процедуре: 1) как легко epicardium может быть расчленены от миокарда, 2) соблюдение изолированных клеток к пластине, 3) возможность предотвратить или пройти EMT и скорость 4) распространения. В общем Быстрая изоляция является предпочтительным для выживания клетки. Основные критической точки пилинг epicardium от миокарда. Если epicardium строго придерживаться основной ткани, 15-мин до лечения сердечной ткани с трипсином может помочь удалить epicardium более легко. Кроме того эффективность лечения трипсина зависит от нескольких факторов, включая активность трипсина и состава ткани. Поэтому если наблюдается низкая доходность, время инкубации с трипсином может корректироваться. Кроме того если не ячейки Пелле виден после спиннинг вниз, решение может не иметь было отделить полностью перед запуском через фильтр. Смешивание решение перед передачей решение через шприц или используя дополнительную, меньше шприц может быть полезным разбить ячейки. Хорошо размер для заполнения EPDCs следует тщательно изучить, чтобы клетки для поддержания их эпителия. Таблица 1 дает указание, но один может отличаться от этого основного положения, когда, например, могут использоваться только небольшая часть сердца плода и обшивка в небольших хорошо является более удобным.
Так как Фетальные клетки будет проходить EMT немедленно без SB17, плода EPDCs всегда быть покрыт SB. Однако Взрослый EPDCs склонны поддерживать их эпителиального морфологии и поэтому может быть покрытием без SB в течение первых 48 часов первого прохода, содействовать присоединению клеток. После первого прохода как взрослых, так и плода EPDCs непрерывно культивируемых с SB для предотвращения спонтанного EMT. Кроме того плотность низкая клеток является важным толчком к EMT. EPDCs, поэтому никогда не культивировали в ниже 50% confluency. С другой стороны если EMT, убедитесь, что EPDCs не семенами слишком плотно и оставаться ниже 70% confluency. Хотя этот протокол использует TGFβ3, стимуляция с TGFβ1 и -2 может вызвать EMT в EPDCs также (неопубликованные наблюдения).
В этом протоколе клетки делятся напрямую без спиннинг вниз, поскольку мы наблюдаем Нижняя выживаемость клеток при использовании центрифуги. Таким образом крайне важно использовать низкие объемы трипсина для обеспечения его деактивации, при добавлении сыворотки содержащие среднего.
После ~ 6-8 ходов EPDCs с эпителиальными морфология либо перестанет расти или будет проходить EMT спонтанно. Таким образом, для экспериментов, мы используем булыжник EPDCs между прохода 3 и прохода 6. В отличие от EPDCs с мезенхимальных морфологии менее уязвимы и может быть культивировали до прохода 20. В экспериментах, однако, мы никогда не использовали шпинделя EPDCs после прохождения 10тыс .
Так как epicardium расположен на внешней стороне сердца и легко отделить от основной ткани, подлинность клетки очевидна, и вероятность значительного загрязнения низок. Хотя жировой ткани или кровеносных сосудов иногда палку в изолированных эпикардиальной слой, большинство этих клеток не пройдет фильтр во время изоляции и иным образом не может выжить в культуре клеток EPDC. Кроме того как упоминалось ранее, использование человеческого материала обеспечивает уникальную модель расследовать поведение клеток человека эпикардиальной. Известно, что, к примеру, жировой эпикардиальной отличается между видами, подчеркивая необходимость модели клетки человека эпикардиальной21.
Следует отметить, что предсердий сердца были получены во время операции на больные сердца, и поэтому различия в болезни, используемых лекарств, возраст и пол донора может влиять воспроизводимость экспериментов. Поэтому, эксперименты должны выполняться на нескольких изоляции, чтобы получить достоверные результаты и позволит сделать твердые выводы. Кроме того в зависимости от исследования вопроса, можно выбрать специально для того использовать только epicardium от пациентов с ишемической болезнью или пациентов с не ИБС пороки, которые, как ожидается, будут вести себя по-разному.
Было предложено, что мерцательной epicardium могут иметь различные характеристики от желудочка epicardium2, тем самым допроса, если epicardium производным от ушных раковин фибрилляции сердца обеспечивает допустимую модель для эпикардиальной поведение. В этом контексте важно отметить, что мы не смогли найти различия между плода предсердий и желудочков производные EPDCs (неопубликованные данные). Однако с помощью epicardium от человека взрослых желудочка бы конечной ячейки источник чтобы проверить это. Тем не менее собирая большие образцы человеческого взрослых желудочков для EPDC изоляции очень инвазивных для пациента и поэтому в настоящее время не возможно в этой больнице.
Мы наблюдали, что SB не всегда является достаточным для предотвращения EMT, главным образом в плода EPDCs. Когда плода EPDCs пройти EMT присутствии SB, мы исключить их из экспериментов. Как следствие за их способность поддерживать эпителиальных фенотип в ответ на SB выбраны ячейки, используемые для экспериментов. Мы предполагаем, что фетальных клеток может быть уже за пределами определенного порога в процессе EMT, и что ингибирование с SB не способна остановить это.
Эта эпикардиальной ячеечная модель имеет несколько приложений, так как могут быть исследованы как развивающихся, так и взрослых epicardium. В нашей лаборатории мы ориентируемся на улучшение эпикардиальной восстановительной реакции после повреждения сердца. Взрослый EPDCs может использоваться для проверки соединений, которые вызывают EMT, стремясь найти потенциальных лечебного препарата для ответа улучшенное восстановительной epicardium. Кроме того, это позволяет измерять факторы, выделяемый EPDCs понять паракринными сигнализации для (пере) генерации миокарда. Кроме того поскольку мы наблюдали, что плода EPDCs, более склонны проходить EMT, спонтанно по сравнению с взрослых EPDCs, мы анализируем различия между плода и взрослых EPDCs. Определение основной механизм увеличения плода активации может предоставить подсказку для улучшения эпикардиальной активации в сердце взрослого человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование поддерживается организацией Нидерланды для научных исследований (НВО) (ВЕНИ 016.146.079) и LUMC исследовательских стипендий и AMS и Stichting Bontius LUMC (MJG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
| Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
| Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
| Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
| Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
| Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
| 10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
| Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
| Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet controller | Integra | 155 015 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Waterbath | GFL | 1083 |
References
- Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate. Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).
- Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development. Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).
- Zhou, B., Ma, Q., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).
- Smits, A., Riley, P. Epicardium-Derived Heart Repair. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).
- Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor. Developmental Biology. 250 (1), 198-207 (2002).
- Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).
- Lavine, K. J., Yu, K., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).
- Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).
- Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).
- Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns. Circulation Research. 96 (5), (2005).
- Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).
- van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PloS one. 7 (9), e44692 (2012).
- Zhou, B., Honor, L. B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).
- Smart, N., Bollini, S., et al. De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury. Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).
- Zangi, L., Lui, K. O., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).
- Clunie-O'Connor, C., Smits, A. M., et al. The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).
- Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).
- Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGFβ-signaling and WT1. Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).
- Chechi, K., Richard, D. Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue. International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).
