Summary
O epicárdio desempenha um papel crucial no desenvolvimento e na reparação do coração, fornecendo células e fatores de crescimento da parede miocárdica. Aqui, descrevemos um método de cultura primária Epicárdica células de origem humana que permite o estudo e a comparação de suas características de adultas e de desenvolvimento.
Abstract
O epicárdio, uma camada de células epiteliais, cobrindo o miocárdio, tem um papel essencial durante o desenvolvimento cardíaco, bem como na resposta de reparação do coração após lesão isquêmica. Quando ativado, Epicárdica células passam por um processo conhecido como epiteliais de transição mesenquimal (EMT) para fornecer células para a regeneração do miocárdio. Além disso, o epicárdio contribui através da secreção de fatores essenciais parácrina. Para apreciar plenamente o potencial regenerativo do epicárdio, um modelo de célula humana é necessário. Aqui podemos delinear um modelo de cultura celular novela para derivar células derivadas Epicárdica primárias (EPDCs) de tecido cardíaco humano adulto e fetal. Para isolar EPDCs, o epicárdio é dissecado do lado de fora do espécime coração e transformado em uma suspensão de célula única. Em seguida, EPDCs são chapeados e cultivadas em meio de EPDC contendo o inibidor da 5-quinase ALK SB431542 para manter seu fenótipo epitelial. EMT é induzida pela estimulação com TGFβ. Este método permite, pela primeira vez, o estudo do processo de EMT Epicárdica humana em um ambiente controlado e facilita a ganhar mais conhecimento no secretome de EPDCs que pode ajudar na regeneração do coração. Além disso, esta abordagem uniforme permite a comparação direta do comportamento humano adulto e fetal Epicárdica.
Introduction
O epicárdio, uma camada epitelial de célula única que envelopes o coração, é de vital importância para o desenvolvimento cardíaco e reparação (revisto em Smits et al 1). desenvolvente, epicárdio surge a partir do órgão de proepicardial, uma pequena estrutura localizada na base do coração em desenvolvimento. Em torno do desenvolvimento dia E9.5 no rato e 4 semanas pós-concepção em humanos, células começam a migrar a partir desta estrutura de couve-flor e cubra o desenvolvimento do miocárdio2. Uma vez que é formada uma camada única de células epiteliais, uma parte das células Epicárdica sofre epitelial de transição mesenquimal (EMT). Durante EMT, células perdem suas características epiteliais, tais como aderências célula-célula e obter um fenótipo mesenquimal que lhes dá a capacidade de migrar para o miocárdio em desenvolvimento. As células derivadas Epicárdica formadas (EPDCs) podem se diferenciar em vários tipos de células cardíacas, incluindo fibroblastos, células musculares lisas e potencialmente cardiomyocytes e células endoteliais3, embora a diferenciação destes últimos dois celular as populações continua a ser objecto de debate (revisto em Smits et al 4). Além disso, o epicárdio fornece sinais de parácrina instrutivo para o miocárdio para regular o seu crescimento e vascularização5,6,7,8. Vários estudos têm demonstrado que a deficiente formação Epicárdica leva a defeitos no desenvolvimento de músculo cardíaco9,10, vasculatura11e condução sistema12, enfatizando o essencial contribuição do epicárdio para a formação do coração.
Embora no coração adulto epicárdio está presente como uma camada de dormente, ele torna-se reativado após isquemia13. Pós-lesão Epicárdica reativação recapitula a vários dos processos descritos para desenvolvimento cardíaco, incluindo proliferação e EMT14, embora menos eficientemente. Curiosamente, embora o mecanismo exato não é totalmente compreendido, a contribuição Epicárdica para reparar pode ser melhorada por tratamento com, por exemplo, Timosina β415 ou modificado de RNAm de VEGF-A16, resultando em cardíaco melhorou função após infarto do miocárdio. O epicárdio, portanto, é considerado uma interessante fonte de célula para realçar reparar endógena do coração ferido.
Mecanismos de desenvolvimento cardíaco são frequentemente instaurados durante a lesão, embora de forma menos eficiente. Em busca de ativadores epicárdica, é primordial que podemos determinar e comparar a capacidade total do epicárdio fetal e adulto. Além disso, do ponto de vista terapêutico, é importante que, além de experiências com animais, estendemos conhecimentos sobre a resposta do epicárdio humana. Aqui, descrevemos um método para isolar e cultura adultas e fetais Epicárdica derivadas células humanas (EPDCs) em uma célula epitelial--como morfologia e induzir EMT. Com este modelo, pretendemos explorar e comparar o comportamento de célula Epicárdica adulto e fetal.
A principal vantagem deste protocolo é o uso de material humano epicárdico, que não tem sido exaustivamente estudado. Importante, o protocolo de cultura de isolamento e celular descrito fornece um único método uniforme para derivar Ambos EPDCs godo fetal e adulto, permitindo uma comparação direta entre essas fontes de duas células. Além disso, desde que o epicárdio é isolado com base em sua localização, assegura-se que as células são na verdade epicardially derivada de17.
Embora métodos de isolamento humanos EPDC tenham sido criados anteriormente, estas principalmente dependem de protocolos de consequência natural, onde os pedaços de tecido cardíaco ou epicárdico são banhados em uma cela cultura prato18,19. Esta abordagem desse modo seleciona especificamente para as células que parcialmente perder seu fenótipo epitelial para migrar, e que são mais propensas a se submeter a EMT espontânea. No protocolo atual, o epicárdio é primeiro transformado em uma solução única célula que permite as EPDCs isolados manter seu estado epitelial. Este método fornece, portanto, um modelo sólido em vitro para estudar Epicárdica EMT.
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Protocol
Todos os experimentos com amostras de tecido humano foram aprovados pelo Comitê de ética do centro médico da Universidade de Leiden e está em conformidade com a declaração de Helsinque. Todas as etapas são executadas com equipamentos esterilizados em um fluxo de cultura de células do armário.
1. preparações
- Prepare o suporte de EPDC pela mistura de Dulbecco médio da águia modificado (DMEM baixa-glicose) e meio 199 (M199) em uma proporção de 1:1. Adicionar inactivados por calor 10% de soro fetal bovino (FBS, calor inativado por 25 min a 56 ° C) e completar com 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 mg/mL. Pré-aquecer o meio EPDC em banho maria a 37 ° C.
- Pré-aquecer a tripsina 0.25%/EDTA (1:1) em banho maria a 37 ° C.
- Revestimento de poços com gelatina. Adicione 0,1% gelatina/PBS a cada poço e incubar as placas durante pelo menos 15 minutos a 37 ° C. Diretrizes para a placa de cultura de células necessárias estão resumidas na tabela 1. Cuidadosamente retire todo fluido antes de chapear pilhas.
- Prepare uma solução stock de 10 mM SB431542 (SB), diluída em DMSO (cuidado). Faça 50 alíquotas µ l em tubos de centrífuga de polipropileno de fundo cónico, como tubos de Eppendorf e armazená-los a-20 ° C. Observe que alíquotas SB podem ser descongeladas apenas uma vez.
2. recuperação e armazenamento de espécimes de coração adulto e Fetal
- Armazenar o humanas adultas aurículas diretamente em cima da remoção durante a cirurgia em um tubo de 50 mL com 15 mL DMEM alta-glicose contendo 10% FBS, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 mg/mL a 4 ° C. As amostras são geralmente 3-5 cm de tamanho e podem ser armazenadas até 48 h após a dissecação.
- Armazenar o coração fetal obtida a partir de material de aborto eletivo em EPDC meio a 4 ° C até 24 h após o isolamento. Para este protocolo, use amostras com uma idade gestacional entre 12-22 semanas. Observe que o coração inteiro pode ser usado para a isolação do epicárdio.
3. isolamento da camada Epicárdica
- No fluxo laminar, preparar um prato de cultura celular-100-mm com PBS e coloque uma gota separada (~ 200 µ l) de PBS na tampa. Encha um tubo de 15 mL com 5 mL de meio de EPDC previamente aquecido.
- Coloque o tecido na cultura de pilha prato cheio de PBS. Certifique-se de que o tecido é umedecido com frequência durante o procedimento.
- Usando um estereomicroscópio, retire o máximo da camada Epicárdica de amostra de tecido quanto possível por descascar usando fórceps.
Nota: O epicárdio pode ser reconhecido como uma camada muito fina, transparente, firmemente aderida à parte externa do coração (figura 1A). Tente evitar contaminação com epicárdico tecido adiposo e vasos sanguíneos, pois isto vai dificultar o isolamento. - Recolha pedaços de tecido epicárdico em gota de PBS sobre a tampa.
- Corte o tecido epicárdico em pedaços pequenos (0,5 mm3) usando um bisturi (figura 1B), ou usando as pontas afiadas de pequenas pinças. Note que as peças devem ser capazes de passar um P1, ponta da pipeta 000 (passo 3.6).
- Adicione 1 mL de tripsina no tecido Epicárdica e recolher os pedaços e tripsina com um P1, 000 ponta da pipeta. Transferi o tecido em um tubo de centrifuga conico de 1,5 mL (Figura 1).
- Incube o tubo em banho-maria 37 ° C por 10 min, agitando a ~ 60 rpm.
- Retire o tubo do banho-maria e limpe o exterior do tubo com etanol a 70%.
- Permitir que o tecido afundar até o fundo do tubo (Figura 1) e transferir cuidadosamente o sobrenadante contendo células Epicárdica para o tubo de 15 mL contendo 5 mL de meio de EPDC para inactivar a tripsina.
- Repor o tecido restante no tubo de centrifuga conico com tripsina 1 mL e misture suavemente pipetando acima e para baixo.
- Repita a etapa 3.7 a 3.10 duas vezes. Na etapa final, depois de um total de 30 min. de incubação de tripsina, transferi tanto o sobrenadante e o restante tecido epicárdico no tubo contendo meio EPDC.
- Quando todas as células são coletadas em média EPDC, gentilmente passe a suspensão por meio de uma seringa de 10 mL com uma agulha de calibre 19 para um novo tubo de 15 mL para dissociar mecanicamente as células (Figura 1E).
Nota: Certifique-se de homogeneizar a suspensão pipetando para cima e para baixo antes de passar a solução através da agulha para evitar que a agulha ficar obstruída. - Para ainda mais dissociar as células, repita a etapa 3.12 com uma agulha de calibre 21.
- Coloque um filtro de célula de 100 µm em cima de um tubo de 50 mL e transferir a mídia que contém as células Epicárdica para o filtro usando uma pipeta de 10 mL para remover todos os restantes grupos (Figura 1F).
- Lave o filtro para coletar células residuais pipetando 5 mL de meio de EPDC para o filtro.
- A suspensão de células do tubo de 50 mL em um tubo de 15 mL de pipeta. Uma vez que as células afundam até o fundo do tubo, agite a solução antes de pipetagem.
Nota: Enquanto este passo não é necessário, um tubo mais pequeno auxilia a visualização do sedimento após centrifugação. - Centrifugar a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente (Figura 1).
- Remover o sobrenadante e ressuspender as células (Figura 1 H) no volume necessário de médio EPDC (tabela 1).
Nota: Para EPDCs fetais, use diretamente a médio EPDC contendo 10 µM do inibidor quinase ALK5 (EPDC + SB). Células adultas podem ser chapeadas sem SB durante a primeira passagem. - A suspensão de células em placas de cultura a gelatina revestida (Figura 1I) da placa. O tamanho do poço depende do tamanho da amostra de tecido Epicárdica (tabela 1). Observe que a confluência de baixa irá induzir a ocorrência de EMT.
- Coloca as pilhas na incubadora pelo menos 48 h a 37 ° C, 5% de CO2 para permitir que as células anexar a placa de cultura.
4. cultura de EPDCs
- Reabastecer o meio EPDC + SB pelo menos a cada 3 dias.
- Inspecione as células pelo menos a cada 3 dias usando o microscópio. Quando as células chegam a confluência, isto é, quando a placa de cultura é inteiramente coberta com células, passagem das células em uma proporção de 1:2 superfície. Note que, atingindo a confluência pode demorar ~ 5-10 dias.
- Aspire o meio usando uma pipeta ou um sistema de aspiração com, por exemplo, uma pipeta de vidro.
- Lave cuidadosamente as células adicionando PBS para as células. Suavemente a placa do redemoinho e aspire a PBS.
- Adicione tripsina à placa. Gire suavemente o prato para cobrir todas as células com tripsina e incubar a placa por 1 min a 37 ° C.
Nota: Usar como tripsina pequena quanto possível (indicação: 200 µ l por alvéolo de um 6 placa bem) - Bata a placa para separar mecanicamente as células da parte inferior da placa. Use o microscópio para verificar visualmente se as células têm destacado. Se não, incubar a placa de cultura de células para um minuto a mais.
- Adicionar o volume necessário de meio EPDC + SB para as células, resuspenda pipetando para cima e para baixo e a suspensão de células de transferência para uma nova placa de cultura de gelatina revestida.
Nota: em geral, as células podem ser mantidas em uma morfologia de paralelepípedos até passagem 8.
5. indução de EMT em EPDCs
- Para induzir a EMT, dissocia as células com tripsina e transferência das células para Nova gelatina revestido poços em uma proporção de 1:2 superfície médio EPDC + SB, conforme descrito em 4 e incubam durante pelo menos 24 h a 37 ° C, 5% de CO2.
- Cheque se Confluencia é 50-70% e se EPDCs têm uma morfologia de paralelepípedos.
Nota: Confluência afeta a capacidade de EPDCs de se submeter a EMT. - Aspire o meio das células e lavar as células cuidadosamente com PBS (ver passo 4.2.1 - 4.2.2).
- Estimulam as células com 1 ng/mL TGFβ3 médio EPDC e colocá-los em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO2 por 5 dias. Observe que durante a estimulação, o meio EPDC contendo TGFβ3 não tem de ser reposta.
- Monitore as células diariamente. Depois de 5 dias, as células que foram submetidos a EMT são reconhecidas por uma morfologia fusiforme (Figura 2A).
- Cultura fusiformes EPDCs de acordo com o método descrito em 4 sem adição de SB ou TGFβ ao meio EPDC. Note que em geral, fusiformes EPDCs podem ser cultivadas até passagem 20.
- Validar a ocorrência de EMT com coloração imunofluorescente usando anticorpos contra o αSMA mesenquimais marcadores ou vimentina ou pela faloidina para detectar a formação de fibras de estresse de F-Actina (Figura 2B), ou usando qRT-PCR para os genes relacionados com EMT ( por exemplo,, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-caderina, MMP3, caracol, lesma) (Figura 2 e tabela 2).
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Representative Results
Aqui, nós esboçamos um protocolo simples para isolar EPDCs de humano adulto e fetal tecido cardíaco (Figura 1). Este protocolo tira proveito da localização facilmente acessível do epicárdio do lado de fora do coração (figura 1A). Coloração da orelha coração após dissecação demonstra que o epicárdio WT1 + é removido enquanto o subjacente subepicardial da matriz extracelular e o tecido do miocárdio permanecem intactas (Figura 1J). Caracterização extensiva foi realizada antes, demonstrando que EPDCs expressar marcadores epicárdica, por exemplo, ALDH1A2, TBX18, KRT8, KRT19 e falta de expressão de outros tipos de células do coração-residente, por exemplo, PECAM1, ISL1, CD34 e TNNT2. 17
Tanto adulto (Figura 1 K) e fetal (Figura 1 L) EPDCs cultivadas na presença de ALK5 show de inibidor SB431542 quinase uma morfologia de paralelepípedos. No entanto, dependendo das condições do doador e cultura, EPDCs fetais podem sofrer EMT apesar da presença de SB. Isso pode resultar em células fusiformes dentro da população de células de paralelepípedos (veja as setas na Figura 1 L). Esteja ciente de que o isolamento de células em forma de paralelepípedo de tecido fetal nem sempre é viável e pode resultar na derivação de principalmente células fusiformes. Uma vez que estas células crescem mais rápido, eles serão rapidamente overgrow outros tipos de células.
EMT pode ser induzida por incubação com TGFβ320 por 5 dias em células de adultas e fetais, como demonstrado por uma transição clara morfológica de células fusiformes (Figura 2A). Como ficou demonstrado com o controle sem tratamento ("vazio"), EPDCs fetais passará por EMT espontânea após a remoção do SB, enquanto EPDCs adultos só passará por EMT após estimulação com TGFβ3. Para validar a EMT, EPDCs foram immunostained com actina de músculo liso-alfa (αSMA), um marcador mesenquimal (Figura 2B). Além disso, a EMT foi confirmado em adultos EPDCs usando qRT-PCR apresentando downregulation do marcador epicárdico WT1 e upregulation dos marcadores mesenquimais POSTN, αSMA, colágeno 1A1, MMP3 e N-caderina (Figura 2). Experiências abrangentes sobre EMT Epicárdica adulto e fetal são publicadas antes17.
| Tecido | Tipo de bem | Área de crescimento celular (cm2) | Volume de meio (mL) | Adição de SB |
| Fetal | 24 | 1.9 | 0,5 | Diretamente |
| Adulto pequeno (< 4cm) | 12 | 3.8 | 1 | Depois de 1 passagem dest |
| Adulto grande | 6 | 9.6 | 2 | Depois de 1 passagem dest |
| (> 4 cm) |
Tabela 1: orientação para selecionar a placa de cultura de célula apropriada. O tamanho bem necessário depende da quantidade de Epicárdica células isoladas. Estas diretrizes podem ser usadas como uma regra geral para selecionar a placa de cultura de célula apropriada.
| Gene | Sequência de |
| WT1 em frente | CAG CTT GAA TGC ATG ACC TG |
| Reverse WT1 | TAT TCT GTA TTG GGC TCC GC |
| Caderina-N para a frente | CAG ACC GAC CCA AAC AAC DE AGC |
| N-caderina reverso | GCA GCA ACA GTA AGG ACA AAC ATC |
| POSTN para a frente | GGA GGC AAA CAG CTC AGA GT |
| POSTN reversa | GGC TGA GGA AGG TGC TAA AG |
| SMA para a frente | CCG GGA GAA AAT GAC TCA AA |
| SMA reverso | GAA GGA ATA CCG ACG CTC AG |
| MMP3 para a frente | TGG ATG CCG GATO ATG AAG |
| MMP3 reversa | CAG AAA TGG CTG GATO CGA |
| COL1A1 para a frente | CCA GAA GAA CTG GTA GATO CAG CA |
| COL1A1 reversa | CGC GATO ATO CGA AAT GGG AAT |
| GAPDH para a frente | AGC CAC ATC GCT CAG ACA C |
| GAPDH reverso | GCC CAA TAC GAC CAA ATC C |
| B2M para a frente | ACA CTG AAT TCA CCC CCA CT |
| B2M reversa | GCT TAC ATG TCT CGA TCC CAC T |
Tabela 2: sequências de Primer usadas para validação de EMT em EPDCs. Sequências de primers para diante e reversos usados para qRT-PCR para determinar que a expressão de vários EMT relacionados genes em EPDCs adultos.
Figura 1 : Isolamento de epicárdico derivado de células (EPDCs). (A) Depicted é uma orelha adulta removida do coração humano com uma fina camada membranosa externa, o epicárdio, que é removido. A seta preta aponta para o epicárdio. (B-Eu) Representação visual do método de isolamento de EPDCs. A seta preta aponta para o centrifugado. (J) coloração imunofluorescente da orelha coração, com e sem dissecação do epicárdio. Barra de escala: 50 µm. (K) representante fotos de dois diferentes isolamentos de EPDC adultos cultivadas com fotos representativas de SB (L) de dois diferentes isolamentos de EPDC fetais cultivadas com setas SB Black indicam células mesenquimais em fetal Cultura EPDC. Barra de escala: 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Validação de EMT no adulto e fetal Epicárdica derivado células humanas (EPDCs). EPDCs adultos e fetais foram cultivadas com SB, não tratada (vazio) ou estimularam com TGFβ3 durante 5 dias. Fotos de campo brilhante representante do (A). Barra de escala: (B) 200 µm. imunocoloração para DAPI e αSMA. Barra de escala: 100 µm. (C) os níveis do mRNA de genes relacionados com EMT, determinados em adultos EPDCs usando qRT-PCR. Valores medidos foram normalizados para GAPDH e B2M expressão. Valores são retratados como média + SD 2 ^-ΔΔct (n = 2). Abreviaturas: Tumor de WT1:Wilms 1, MMP3: matriz metaloproteinase 3, POSTN:Periostin, αSMA: alfa actina de músculo liso, Col1A1:Collagen 1A1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui descrevemos um protocolo detalhado para isolar e cultura primárias Epicárdica células derivadas de corações humanos adultas e fetais. Extensa caracterização dessas células tem sido publicado anteriormente17. Mostramos que os dois tipos de células podem ser mantidos como células epiteliais de paralelepípedos, como quando cultivadas com o inibidor de quinase ALK5 SB431542. EMT é parte integrante da ativação epicárdico na vivo durante o desenvolvimento e a resposta pós-lesão. EMT pode ser estudada usando esse método por adição de TGFβ. Importante, observamos anteriormente que EPDCs fetais rapidamente passam por EMT espontânea quando SB é removida, enquanto EPDCs adultos apenas se submeter a EMT após estimulação17. Estudar estes processos em EPDCs fetais pode ajudar na compreensão de como ativar otimamente o epicárdio adulto após danos.
O método apresentado baseia-se no material de paciente, que é obtido durante a cirurgia. Portanto, pode-se esperar várias variações no estado do material isolado, que são ou devido à variabilidade do paciente ou a velocidade em que o material é coletado no teatro operacional. Esta variação pode explicar diferenças no procedimento: 1) como facilmente pode ser dissecado o epicárdio do miocárdio, 2) a adesão de células isoladas para a placa, 3) a capacidade de prevenir ou se submeter a EMT e velocidade 4) proliferação. Em geral, um isolamento rápido é preferível para a sobrevivência da pilha. O principal ponto crítico está descascando o epicárdio do miocárdio. Se o epicárdio é fortemente aderido ao tecido subjacente, um 15min pré-tratamento do tecido cardíaco com tripsina pode ajudar a remover o epicárdio mais facilmente. Além disso, a eficácia do tratamento tripsina depende de vários fatores, incluindo a atividade de tripsina e a composição do tecido. Portanto, se for observado um baixo rendimento, o tempo de incubação com tripsina pode ser ajustado. Além disso, se não centrifugado é visível após girando para baixo, a solução pode não ter sido completamente dissociada antes de executar através do filtro. Misturar a solução antes de passagem a seringa com a solução ou usando um extra, seringa menor poderia ser útil para dissociar as células. O tamanho bom para semeadura EPDCs deve ser considerado com cuidado para permitir que as células a manter seu estado epitelial. A tabela 1 dá uma indicação, mas um pode desviar essa diretriz, quando, por exemplo, pode ser usada apenas uma pequena parte do coração fetal e chapeamento em um bem menor é mais conveniente.
Desde que as células fetais passará por EMT imediatamente sem SB17, EPDCs fetais devem sempre ser revestidas com SB. No entanto, EPDCs adultos tendem a manter sua morfologia epitelial e, portanto, podem ser revestidos sem SB durante o primeiro 48 h da primeira passagem, para promover a adesão celular. Após a primeira passagem, EPDCs adultos e fetais são continuamente cultivadas com SB para evitar EMT espontânea. Além disso, a densidade celular baixa é um gatilho importante para EMT. EPDCs nunca devem ser cultivadas abaixo confluência de 50%. Por outro lado, se EMT é desejado, certifique-se que EPDCs não são semeados muito densa e ficar abaixo de 70% de confluência. Embora este protocolo utiliza TGFβ3, estimulação com TGFβ1 e -2 pode induzir EMT em EPDCs também (observações não publicadas).
Neste protocolo, as células dividem-se diretamente sem girando para baixo, já que observamos uma baixa sobrevivência da pilha quando usando a centrífuga. Portanto, é indispensável utilizar volumes baixos de tripsina que garantam a sua desativação em meio contendo soro é adicionado.
Após passagens de ~ 6-8, EPDCs com uma morfologia epitelial também param de crescer ou passará por EMT espontaneamente. Portanto, vamos usar para experimentos, godo EPDCs entre passagem 3 e 6 de passagem. Em contraste, EPDCs com uma morfologia mesenquimal são menos vulneráveis e podem ser cultivadas até passagem 20. Em experimentos, no entanto, nós nunca usamos do eixo EPDCs após a passagem deth 10.
Desde que o epicárdio está localizado na parte externa do coração e é fácil de separar do tecido subjacente, a autenticidade das células é evidente, e a chance de contaminação significativa é baixa. Embora o tecido adiposo ou vasos sanguíneos às vezes ficar para a camada Epicárdica isolada, a maioria dessas células não passará o filtro durante o isolamento e caso contrário, não pode sobreviver na cultura de pilha EPDC. Além disso, como mencionei antes, usar material humano fornece um modelo exclusivo para investigar o comportamento humano célula Epicárdica. É conhecido que, por exemplo, epicárdico tecido adiposo é diferente entre as espécies, enfatizando a necessidade de célula humana Epicárdica modelos21.
Deve notar-se que as aurículas do coração foram obtidas durante a cirurgia em corações doentes, e, portanto, as diferenças em doença, medicação usada, idade e sexo do doador podem influenciar a reprodutibilidade dos experimentos. Experiências, portanto, devem ser realizadas em vários isolamentos para obter resultados válidos e permitem conclusões sólidas para serem desenhados. Além disso, dependendo da questão de investigação, um pode escolher especificamente usar somente o epicárdio de pacientes com doença isquêmica ou pacientes com doença valvular não-isquêmica, que esperam que se comportem de forma diferente.
Tem sido sugerido que epicárdio atrial pode ter características distintas do ventrículo epicárdio2, desse modo, questionando se epicárdio derivado da aurícula atrial coração fornece um modelo válido para comportamento epicárdico. Neste contexto, é importante salientar que não encontramos diferenças entre fetal atrial e ventriculares derivado EPDCs (dados não publicados). No entanto, usar o epicárdio do ventrículo adulto humano seria a fonte de final de célula para verificar isso. Ainda, coletando espécimes grandes dos ventrículos adultos humanos para isolamento EPDC é altamente invasivo para o paciente e, portanto, atualmente não é viável neste hospital.
Observamos que SB nem sempre é suficiente para prevenir a EMT, principalmente em EPDCs fetais. Quando EPDCs fetais passam por EMT na presença de SB, podemos excluí-los de experimentos. Como consequência, as células usadas para experimentos são Selecionadodas por sua capacidade de manter um fenótipo epitelial em resposta a SB. Nós hypothesize que células fetais já podem ser além de certo limite no processo de EMT, e essa inibição com SB não é capaz de parar com isso.
Este modelo de celular Epicárdica tem diversas aplicações, desde o desenvolvimento e o epicárdio adulto podem ser investigados. Em nosso laboratório, focamos na melhoria da resposta regenerativa Epicárdica após danos cardíacos. EPDCs adultos podem ser usados para testar compostos que induzem a EMT, com o objetivo de encontrar uma droga potencial terapêutica para uma resposta regenerativa melhorou de epicárdio. Além disso, é possível medir fatores secretados por EPDCs de compreender a parácrina sinalizando para o (re) gerando o miocárdio. Além disso, uma vez que observamos que EPDCs fetais são mais propensas a se submeter a EMT espontaneamente em relação ao adultos EPDCs, investigamos as diferenças entre os EPDCs fetais e adultos. Determinar o mecanismo subjacente de ativação fetal aumentada poderia fornecer uma sugestão para melhorar a ativação Epicárdica no coração adulto.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa é suportada pela organização do Países Baixos para investigação científica (NWO) (VENI 016.146.079) e uma bolsa de pesquisa LUMC tanto para AMS e LUMC Bontius Stichting (MJG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
| Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
| Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
| Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
| Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
| Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
| 10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
| Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
| Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet controller | Integra | 155 015 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Waterbath | GFL | 1083 |
References
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