Summary
epicardium के विकास और कोशिकाओं और रोधगलन को विकास कारकों प्रदान करके दिल की मरंमत में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । यहां, हम संस्कृति मानव प्राथमिक epicardial कोशिकाओं है कि अध्ययन और उनके विकास और वयस्क विशेषताओं की तुलना में सक्षम बनाता है एक विधि का वर्णन ।
Abstract
epicardium, एक उपकला कोशिका परत मायोकार्डियम को कवर, हृदय विकास के दौरान एक आवश्यक भूमिका है, साथ ही कोरोनरी चोट के बाद दिल की मरम्मत प्रतिक्रिया में. जब सक्रिय, epicardial कोशिकाओं एक उपकला के रूप में जाना जाता प्रक्रिया से गुजरना mesenchymal संक्रमण (EMT) के लिए कोशिकाओं को चूकने मायोकार्डियम को प्रदान करने के लिए. इसके अलावा, epicardium आवश्यक paracrine कारकों के स्राव के माध्यम से योगदान देता है । पूरी तरह से epicardium की अपक्षयी क्षमता की सराहना करते हैं, एक मानव कोशिका मॉडल की आवश्यकता है । यहां हम मानव वयस्क और भ्रूण कार्डियक ऊतक से प्राथमिक epicardial व्युत्पंन कोशिकाओं (EPDCs) प्राप्त करने के लिए एक उपंयास सेल संस्कृति मॉडल रूपरेखा । EPDCs को अलग करने के लिए, epicardium दिल नमूना के बाहर से विच्छेदित है और एक एकल सेल निलंबन में कार्रवाई की । अगले, EPDCs चढ़ाया और EPDC ALK 5-कळेनासे अवरोधक SB431542 युक्त माध्यम में संस्कृति को अपनी उपकला phenotype बनाए रखने के लिए कर रहे हैं । EMT TGFβ के साथ उत्तेजना से प्रेरित है । इस विधि में सक्षम बनाता है, पहली बार के लिए, एक नियंत्रित सेटिंग में मानव epicardial EMT की प्रक्रिया का अध्ययन, और EPDCs के secretome में और अधिक अंतर्दृष्टि पाने की सुविधा है कि हृदय पुनर्जनन सहायता कर सकते हैं । इसके अलावा, इस वर्दी दृष्टिकोण मानव वयस्क और भ्रूण epicardial व्यवहार की प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देता है ।
Introduction
epicardium, एक एकल कोशिका उपकला परत कि लिफाफे दिल, हृदय विकास और मरंमत के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है (Smits एट अल में समीक्षा की. 1). विकास, epicardium proepicardial अंग से उठता है, एक छोटे से विकासशील दिल के आधार पर स्थित संरचना । विकास दिवस के आसपास माउस में 9.5 ई, और 4 सप्ताह के बाद मानव में गर्भाधान, कोशिकाओं को इस फूलगोभी संरचना से पलायन शुरू और विकासशील मायोकार्डियम2कवर । एक बार एक एकल उपकला कोशिका परत का गठन किया जाता है, epicardial कोशिकाओं के एक हिस्से उपकला mesenchymal संक्रमण (EMT) से गुजरती है. EMT के दौरान, कोशिकाएं कोशिका-कोशिका आसंजन जैसे उनकी उपकला विशेषताओं को खो देती हैं और mesenchymal phenotype प्राप्त करती हैं जो उन्हें विकासशील मायोकार्डियम में माइग्रेट करने की क्षमता प्रदान करती हैं. गठित epicardial व्युत्पन्न कोशिकाओं (EPDCs) fibroblasts सहित कई हृदय कोशिका प्रकार में अंतर कर सकते हैं, चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं, और संभावित cardiomyocytes और endothelial कोशिकाओं3, हालांकि उत्तरार्द्ध दो सेल के भेदभाव जनसंख्या बहस के अधीन रहता है (Smits एट अल में समीक्षा की । 4). इसके अलावा, epicardium अपने विकास और vascularization5,6,7,8को विनियमित करने के लिए मायोकार्डियम को शिक्षाप्रद paracrine संकेत प्रदान करता है । कई अध्ययनों से प्रदर्शन किया है कि बिगड़ा epicardial गठन हृदय मांसपेशी9,10, vasculature11, और आचरण प्रणाली12में विकासात्मक दोषों की ओर जाता है, आवश्यक पर बल दिल के गठन के लिए epicardium का योगदान ।
हालांकि वयस्क दिल में epicardium एक निष्क्रिय परत के रूप में मौजूद है, यह13ischemia पर सक्रिय हो जाता है । Epicardial रिएक्टिवेशन पोस्ट-इंजरी recapitulates, हृदय विकास के लिए वर्णित प्रक्रियाओं के कई, जिनमें प्रसार और EMT14, यद्यपि कम कुशलता से हैं । दिलचस्प है, हालांकि सटीक तंत्र पूरी तरह से समझ में नहीं आता है, मरंमत के लिए epicardial योगदान के साथ उपचार द्वारा सुधार किया जा सकता है, जैसे, Thymosin β415 या संशोधित वीईजीएफ़-एक mRNA16, उन्नत कार्डियक में जिसके परिणामस्वरूप रोधगलन के बाद समारोह । epicardium इसलिए घायल दिल की मरंमत अंतर्जात बढ़ाने के लिए एक दिलचस्प सेल स्रोत माना जाता है ।
हृदय विकास के तंत्र अक्सर चोट के दौरान recapitulated हैं, हालांकि एक कम कुशल तरीके से । epicardial उत्प्रेरकों की खोज में, यह सर्वोपरि है कि हम निर्धारित करने और भ्रूण और वयस्क epicardium की पूरी क्षमता की तुलना कर सकते हैं । इसके अलावा, देखने के एक चिकित्सकीय बिंदु से, यह महत्वपूर्ण है कि, पशु प्रयोगों के अलावा, हम मानव epicardium की प्रतिक्रिया के बारे में ज्ञान का विस्तार । यहाँ, हम एक उपकला कोशिका की तरह आकृति विज्ञान में और EMT प्रेरित करने के लिए मानव वयस्क और भ्रूण epicardial व्युत्पन्न कोशिकाओं (EPDCs) को अलग और संस्कृति के लिए एक विधि का वर्णन. इस मॉडल के साथ, हम का पता लगाने और वयस्क और भ्रूण epicardial सेल व्यवहार की तुलना उद्देश्य ।
इस प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ मानव epicardial सामग्री का उपयोग है, जिसका गहन अध्ययन नहीं किया गया है । महत्वपूर्ण बात, वर्णित आइसोलेशन और सेल कल्चर प्रोटोकॉल दोनों भ्रूण और वयस्क कॉबल EPDCs प्राप्त करने के लिए एक समान विधि प्रदान करता है, इन दो सेल सूत्रों के बीच एक सीधी तुलना को सक्षम करने. इसके अतिरिक्त, के बाद से epicardium अपने स्थान के आधार पर पृथक है, यह सुनिश्चित किया जाता है कि कोशिकाओं वास्तव में epicardially प्राप्त कर रहे है17।
जबकि मानव EPDC अलगाव तरीकों पहले स्थापित किया गया है, ये ज्यादातर वृद्धि प्रोटोकॉल पर निर्भर जहां हृदय या epicardial ऊतक के टुकड़े एक सेल संस्कृति डिश18,19पर चढ़ाया जाता है । इस दृष्टिकोण इस प्रकार की कोशिकाओं के लिए विशेष रूप से चुनता है कि आंशिक रूप से उनके उपकला phenotype खो क्रम में माइग्रेट करने के लिए, और अधिक सहज EMT से गुजरना करने के लिए प्रवण हैं. वर्तमान प्रोटोकॉल में, epicardium पहले एक एकल कोशिका समाधान जो अलग EPDCs अपनी उपकला राज्य को बनाए रखने के लिए अनुमति देता है में संसाधित है. इस विधि इसलिए epicardial EMT अध्ययन करने के लिए एक ठोस इन विट्रो मॉडल प्रदान करता है ।
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Protocol
मानव ऊतक नमूनों के साथ सभी प्रयोगों Leiden विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया और हेलसिंकी की घोषणा के अनुरूप । सभी कदम एक कोशिका संस्कृति प्रवाह कैबिनेट में बाँझ उपकरण के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं.
1. तैयारी
- Dulbecco के संशोधित ईगल के मध्यम (DMEM कम ग्लूकोज) और मध्यम १९९ (M199) को 1:1 के अनुपात में मिलाकर EPDC माध्यम तैयार करें । जोड़ें 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS, ५६ डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए निष्क्रिय गर्मी) और १०० U/एमएल पेनिसिलिन और १०० मिलीग्राम/एमएल streptomycin के साथ पूरक । एक ३७ ° c पानी स्नान में पूर्व EPDC मध्यम गर्म ।
- पूर्व गर्म Trypsin 0.25%/EDTA (1:1) एक ३७ ° c पानी स्नान में ।
- कोट जिलेटिन के साथ कुओं । प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए ०.१% जिलेटिन/जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस से कम 15 मिनट के लिए प्लेटें मशीन । आवश्यक कक्ष culture प्लेट के लिए दिशानिर्देश तालिका 1में सारांशित किए जाते हैं । कोशिकाओं को चढ़ाना से पहले ध्यान से सभी द्रव निकालें ।
- 10 मिमी SB431542 (SB), DMSO में पतला (सावधानी) का एक शेयर समाधान तैयार करें । शंकु तल में ५० µ l aliquots बनाओ ट्यूब, Eppendorf ट्यूबों की तरह, और उंहें स्टोर-20 डिग्री सेल्सियस । ध्यान रहे कि एसबी aliquots केवल एक बार गल सकता है ।
2. पुनर्प्राप्ति और वयस्क और भ्रूण दिल नमूनों का भंडारण
- एक ५०-एमएल ट्यूब में सर्जरी के दौरान हटाने पर मानव वयस्क auricles सीधे स्टोर 15 मिलीलीटर उच्च ग्लूकोज DMEM युक्त 10% FBS, १०० U/एमएल पेनिसिलिन, और १०० मिलीग्राम/एमएल streptomycin 4 डिग्री सेल्सियस पर । नमूने आम तौर पर 3-5 सेमी आकार में हैं और विच्छेदन के बाद ४८ h तक संग्रहित किया जा सकता है ।
- भ्रूण दिल EPDC माध्यम में वैकल्पिक गर्भपात सामग्री से 4 डिग्री सेल्सियस से प्राप्त करने के लिए 24 ज अलगाव के बाद स्टोर । इस प्रोटोकॉल के लिए, 12-22 सप्ताह के बीच एक गर्भावधि उंर के साथ नमूनों का उपयोग करें । ध्यान दें कि पूरे दिल epicardium के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
3. Epicardial परत का अलगाव
- लामिना फ्लो कैबिनेट में, पंजाबियों के साथ एक १०० मिमी सेल-कल्चरल डिश तैयार करें और पंजाब के ढक्कन में एक अलग छोटी बूंद (~ २०० µ l) लगाएं । एक 15 मिलीलीटर ट्यूब को 5 मिलीलीटर पूर्व-उष्ण EPDC मध्यम से भरें ।
- सेल-कल्चरल डिश में टिशू को पंजाबियों से भर कर रखें । सुनिश्चित करें कि ऊतक अक्सर प्रक्रिया के दौरान गीला है ।
- एक stereomicroscope का प्रयोग, संभव के रूप में ऊतक के नमूने से epicardial परत के रूप में ज्यादा इसे छीलने से संदंश का उपयोग कर हटा दें ।
नोट: epicardium को बहुत पतली, पारदर्शी परत के रूप में पहचाना जा सकता है जो दिल के बाहर (चित्र 1a) का पालन करती है । epicardial वसा ऊतक और रक्त वाहिकाओं के साथ संक्रमण से बचने की कोशिश के बाद से यह अलगाव में बाधा होगी । - epicardial ऊतकों के ढक्कन पर पंजाब की छोटी बूंद में टुकड़े इकट्ठा ।
- epicardial ऊतक को छोटे टुकड़ों में काटें (०.५ mm3) एक स्केलपेल (figure 1b) का उपयोग कर, या छोटे संदंश के तीखे सुझावों का प्रयोग करें । ध्यान दें कि टुकड़े को एक P1, 000 प्लास्टिक टिप (३.६ कदम) पारित करने में सक्षम होना चाहिए ।
- epicardial ऊतक के लिए trypsin के 1 मिलीलीटर जोड़ें और एक P1, 000 प्लास्टिक टिप के साथ टुकड़े और trypsin इकट्ठा । एक १.५-एमएल शंकु केंद्रापसारक ट्यूब (चित्रा 1C) में ऊतक स्थानांतरण ।
- 10 मिनट के लिए एक ३७ ° c जल स्नान में ट्यूब मशीन, जबकि ~ ६० rpm पर मिलाते हुए ।
- पानी के स्नान से ट्यूब निकालें, और ७०% इथेनॉल के साथ ट्यूब के बाहर साफ ।
- ऊतक ट्यूब के नीचे करने के लिए सिंक करने की अनुमति दें (चित्रा 1 डी) और ध्यान से 15 एमएल EPDC trypsin को निष्क्रिय करने के माध्यम से युक्त ट्यूब के लिए epicardial कोशिकाओं युक्त supernatant हस्तांतरण ।
- 1 मिलीलीटर trypsin के साथ शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में शेष ऊतक भरपाई, और धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण ।
- दोहराएं चरण ३.७ के लिए ३.१० दो बार । अंतिम चरण में, trypsin मशीन के 30 मिनट की कुल के बाद, दोनों supernatant और शेष epicardial ऊतक EPDC मध्यम से युक्त ट्यूब में हस्तांतरण ।
- जब सभी कोशिकाओं EPDC माध्यम में एकत्र कर रहे हैं, धीरे से एक 10 मिलीलीटर एक नई 15 मिलीलीटर ट्यूब में एक 19 गेज सुई के साथ सिरिंज के माध्यम से पारित करने के लिए कोशिकाओं अलग कर देना यांत्रिक(चित्रा 1E) ।
नोट: सुई के माध्यम से समाधान पारित करने से पहले ऊपर और नीचे pipetting द्वारा निलंबन homogenize करने के लिए सुनिश्चित करें कि सुई बाधित हो रही है. - आगे कोशिकाओं अलग कर देना करने के लिए, एक 21 गेज सुई के साथ ३.१२ कदम दोहराएँ.
- एक ५०-एमएल ट्यूब के शीर्ष पर एक १००-µm सेल छलनी प्लेस और सभी शेष झुरमुट (चित्रा 1F) को दूर करने के लिए एक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर छलनी पर epicardial कोशिकाओं से युक्त माध्यम हस्तांतरण ।
- छलनी पर pipetting 5 मिलीलीटर EPDC मध्यम से अवशिष्ट कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए तनाव को धो लें ।
- प्लास्टिक ५०-एमएल ट्यूब से सेल सस्पेंशन को 15 एमएल वाली ट्यूब में डालें । के बाद से कोशिकाओं ट्यूब के नीचे करने के लिए सिंक, pipetting से पहले धीरे समाधान हिला ।
ध्यान दें: हालांकि इस कदम आवश्यक नहीं है, एक छोटे ट्यूब गोली के केंद्रापसारक के बाद एड्स दृश्य । - 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर २०० x g पर केंद्रापसारक (चित्रा 1G) ।
- supernatant निकालें और EPDC मध्यम (तालिका 1) की आवश्यक मात्रा में सेल गोली (चित्रा१) reसस्पेंड ।
नोट: भ्रूण EPDCs के लिए, सीधे ALK5 कळेनासे अवरोध करनेवाला (EPDC + SB) के 10 µ मीटर युक्त EPDC माध्यम का उपयोग करें । वयस्क कोशिकाओं को पहली यात्रा के दौरान SB के बिना चढ़ाया जा सकता है । - प्लेट जिलेटिन लेपित संस्कृति प्लेटों (चित्रा 1I) पर सेल निलंबन । अच्छी तरह का आकार epicardial ऊतक के नमूने के आकार पर निर्भर करता है (तालिका 1) । ध्यान दें कि कम प्रवाह EMT की घटना को प्रेरित करेगा ।
- ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2 पर कम से ४८ h के लिए मशीन में कोशिकाओं को संस्कृति की थाली में संलग्न करने की अनुमति के लिए कक्षों प्लेस ।
4. EPDCs की संस्कृति
- EPDC + SB मध्यम से कम हर 3 दिन की भरपाई ।
- प्रत्येक 3 दिन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं का निरीक्षण । जब कोशिकाओं को प्रवाह, अर्थात्, जब संस्कृति प्लेट पूरी तरह से कोशिकाओं के साथ कवर किया जाता है तक पहुंचने, एक 1:2 सतह अनुपात में कोशिकाओं बीतने । ध्यान दें कि पहुंच को प्रभावित ~ 5-10 दिन लग सकते हैं ।
- महाप्राण के साथ एक प्लास्टिक या एक आकांक्षा प्रणाली का उपयोग कर माध्यम है, जैसे, एक गिलास प्लास्टिक ।
- प्रकोष्ठों को पंजाबियों से जोड़कर सावधानीपूर्वक कोशिकाओं को धोएं. धीरे से थाली घूमता है और महाप्राण पंजाबियों ।
- थाली में trypsin जोड़ें । धीरे प्लेट को trypsin के साथ सभी कोशिकाओं को कवर और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए थाली मशीन को घुमाएगी ।
नोट: के रूप में संभव के रूप में छोटे trypsin का प्रयोग करें (संकेत: २०० µ एल प्रति अच्छी तरह से एक 6 प्लेट) - प्लेट को खिंचने के लिए प्लेट के नीचे से अलग करके कोशिकाओं पर टैप करें । कोशिकाओं अलग है अगर नेत्रहीन की जाँच करने के लिए माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें. यदि नहीं, तो एक अतिरिक्त मिनट के लिए सेल संस्कृति प्लेट की मशीन ।
- कोशिकाओं को EPDC + SB मध्यम की आवश्यक मात्रा जोड़ें, ऊपर और नीचे pipetting द्वारा reसस्पेंड, और एक नया जिलेटिन लेपित संस्कृति प्लेट के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण ।
नोट: सामान्य रूप में, कोशिकाओं को 8 बीतने के लिए एक cobblestone आकृति विज्ञान में रखा जा सकता है.
5. EPDCs में EMT की प्रेरण
- EMT प्रेरित करने के लिए, trypsin के साथ कोशिकाओं को अलग कर देना और EPDC में एक 1:2 सतह अनुपात में नए जिलेटिन लेपित कुओं के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण + SB माध्यम, 4 में वर्णित के रूप में, और ३७ डिग्री सेल्सियस, 5%CO2 पर कम से कम 24 घंटे के लिए मशीन ।
- यदि प्रवाह ५०-७०% है और अगर EPDCs एक cobblestone आकृति विज्ञान है की जाँच करें ।
नोट: EMT से गुजरने के लिए EPDCs की क्षमता को प्रभावित करता है । - कोशिकाओं से मध्यम महाप्राण और पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को सावधानी से धोएं (स्टेप 4.2.1-4.2.2 देखें).
- EPDC माध्यम में 1 एनजी/एमएल TGFβ3 के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित और उंहें ३७ ° c, 5% सह 5 दिनों के लिए में एक मशीन में जगह है । ध्यान रहे कि उत्तेजना के दौरान TGFβ3 युक्त EPDC माध्यम को नहीं मंगाया जाता है.
- प्रतिदिन कोशिकाओं की निगरानी करें । 5 दिनों के बाद, EMT से गुजरने वाले कक्षों को एक धुरी के आकार की आकृति विज्ञान (चित्र 2a) द्वारा पहचाना जाता है ।
- संस्कृति धुरी के आकार EPDCs के अलावा 4 में वर्णित विधि के अनुसार SB या TGFβ EPDC माध्यम के लिए । ध्यान दें कि सामांय में, धुरी के आकार का EPDCs 20 पारित करने के लिए प्रसंस्कृत किया जा सकता है ।
- mesenchymal मार्करों αSMA या Vimentin के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग दाग immunofluorescent के साथ EMT की घटना को मांय या phalloidin द्वारा F-actin तनाव फाइबर के गठन का पता लगाने के लिए (चित्रा बी), या qRT-EMT के लिए पीसीआर का उपयोग-संबंधित जीन ( उदा, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-Cadherin, MMP3, घोंघा, स्लग) (चित्रा 2c व टेबल २).
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Representative Results
यहां, हम मानव वयस्क और भ्रूण कार्डियक ऊतक (चित्रा 1) से EPDCs को अलग करने के लिए एक सीधा प्रोटोकॉल रूपरेखा । यह प्रोटोकॉल दिल के बाहर (चित्रा 1a) पर epicardium के आसानी से सुलभ स्थान का लाभ लेता है. विच्छेदन के बाद दिल auricle का दाग दर्शाता है कि WT1 + epicardium को हटा दिया गया है, जबकि अंतर्निहित subepicardial extracellular मैट्रिक्स और रोधगलन (चित्रा 1J) बरकरार रहता है । व्यापक लक्षण वर्णन से पहले प्रदर्शन किया गया है, कि EPDCs एक्सप्रेस epicardial मार्करों का प्रदर्शन, जैसे, ALDH1A2, TBX18, KRT8, KRT19 और अंय दिल की कमी की अभिव्यक्ति निवासी कोशिका प्रकार, जैसे, PECAM1, ISL1, CD34, और TNNT2 । 17
दोनों वयस्क (चित्रा १) और भ्रूण (चित्रा 1L) EPDCs ALK5 कळेनासे अवरोध करनेवाला SB431542 की उपस्थिति में कल्चरल शो एक cobblestone आकृति विज्ञान. हालांकि, दाता और संस्कृति की स्थिति पर निर्भर करता है, भ्रूण EPDCs SB की उपस्थिति के बावजूद EMT से गुजरना कर सकते हैं । यह cobblestone कोशिकाओं की जनसंख्या के भीतर धुरी के आकार का कोशिकाओं में परिणाम कर सकते हैं ( चित्रा 1Lमें तीर देखें). कृपया ध्यान रखें कि भ्रूण के ऊतकों से cobblestone के आकार की कोशिकाओं के अलगाव हमेशा संभव नहीं है, और ज्यादातर धुरी के आकार की कोशिकाओं के व्युत्पत्ति में परिणाम हो सकता है । के बाद से इन कोशिकाओं को तेजी से बढ़ने, वे तेजी से अंय प्रकार के सेल तबदील हो जाएगा ।
EMT दोनों वयस्क और भ्रूण कोशिकाओं में 5 दिनों के लिए TGFβ3 के साथ20 के साथ मशीन द्वारा प्रेरित किया जा सकता है, के रूप में धुरी के आकार की कोशिकाओं (चित्रा 2a) के लिए एक स्पष्ट रूपात्मक संक्रमण के द्वारा प्रदर्शित । के रूप में अनुपचारित नियंत्रण के साथ प्रदर्शन ("खाली"), भ्रूण EPDCs SB के हटाने पर सहज EMT से गुजरना होगा, जबकि वयस्क EPDCs केवल TGFβ3 के साथ उत्तेजना पर EMT से गुजरना होगा । EMT को मान्य करने के लिए, EPDCs अल्फा-चिकनी मांसपेशी actin (αSMA), एक mesenchymal मार्कर (चित्र बी) के साथ immunostained थे. इसके अलावा, EMT वयस्क EPDCs में पुष्टि की थी qRT-पीसीआर epicardial मार्कर WT1 और mesenchymal मार्करों POSTN, αSMA, कोलेजन 1A1, MMP3, और एन Cadherin (चित्रा 2c) के downregulation दिखा का उपयोग कर. वयस्क और भ्रूण epicardial EMT के संबंध में व्यापक प्रयोग17से पहले प्रकाशित किए जाते हैं ।
| ऊतक | अच्छी तरह से प्रकार | सेल ग्रोथ एरिया (cm2) | मध्यम (एमएल) की मात्रा | एसबी के अलावा |
| भ्रूण | 24 | १.९ | ०.५ | सीधे |
| वयस्क छोटा (< 4 cm) | 12 | ३.८ | 1 | 1st बीतने के बाद |
| वयस्क बड़े | 6 | ९.६ | 2 | 1st बीतने के बाद |
| (> 4 सेमी) |
तालिका 1: उपयुक्त कक्ष culture प्लेट का चयन करने के लिए दिशानिर्देश. आवश्यक अच्छी तरह से आकार अलग epicardial कोशिकाओं की मात्रा पर निर्भर करता है । इन दिशानिर्देशों को उपयुक्त सेल कल्चर प्लेट का चयन करने के लिए अंगूठे के नियम के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
| जीन | अनुक्रम |
| आगे WT1 | सीएजी CTT गाा TGC ATG एसीसी टीजी |
| WT1 उलटे | ताट TCT GTA TTG GGC टीसीसी GC |
| एन-Cadherin फॉरवर्ड | सीएजी एसीसी GAC सीसीए aac AGC aac |
| एन-Cadherin रिवर्स | जीसीए जीसीए ऐका जीटीए AGG ऐका AAC एटीसी |
| आगे POSTN | GGA GGC एएए सीएजी सीटीसी आगा GT |
| POSTN उलटे | GGC TGA GGA AGG TGC ताा AG |
| SMA फॉरवर्ड | CCG GGA गाा AAT GAC टीसीए एए |
| SMA रिवर्स | गाा GGA अता समझिए ACG सीटीसी एजी |
| आगे MMP3 | TGG ATG CCG बिल्ली ATG AAG |
| MMP3 उलटे | सीएजी एएए TGG CTG कैट CGA |
| आगे COL1A1 | सीसीए गाा गाा CTG GTA कैट सीएजी सीए |
| COL1A1 उलटे | CGC बिल्ली अधिनियम CGA AAT GGG AAT |
| आगे GAPDH | AGC CAC एटीसी GCT सीएजी ऐका ग |
| GAPDH उलटे | जीसीसी CAA टीएसी GAC CAA एटीसी सी |
| आगे B2M | ऐका CTG AAT टीसीए सीसीसी सीसीए सीटी |
| B2M उलटे | GCT टीएसी ATG TCT CGA टीसीसी CAC टी |
तालिका 2: EPDCs में EMT के सत्यापन के लिए प्रयुक्त प्राइमर अनुक्रम । वयस्क EPDCs में कई EMT संबंधित जीन की अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए qRT-पीसीआर के लिए इस्तेमाल फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमरों के जुगाड़.
चित्र 1 : Epicardial व्युत्पन्न कोशिकाओं का अलगाव (EPDCs). (क) चित्रित एक वयस्क auricle एक पतली बाहरी झिल्लीदार परत के साथ मानव हृदय से निकाल दिया जाता है, epicardium, जो हटा दिया जाता है । काला तीर epicardium को इंगित करते हैं । (B-I) EPDCs की आइसोलेशन विधि का दृश्य प्रतिनिधित्व । काले तीर सेल गोली को अंक । (J) Immunofluorescent के साथ एक दिल के दाग auricle और epicardium के विच्छेदन के बिना । स्केल बार: ५० µm. (K) दो अलग वयस्क EPDC अलगाव की प्रतिनिधि तस्वीरें sb के साथ संस्कृति । (L) दो अलग भ्रूण EPDC के प्रतिनिधि तस्वीरें sb के साथ कल्चरित अलगाव । काले तीर से संकेत मिलता है mesenchymal-भ्रूण में कोशिकाओं की तरह EPDC संस्कृति । स्केल बार: २०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.
चित्र 2 : मानव वयस्क और भ्रूण Epicardial व्युत्पन्न कोशिकाओं (EPDCs) में EMT का सत्यापन. वयस्क और भ्रूण EPDCs SB के साथ, इलाज नहीं (खाली) या 5 दिनों के लिए TGFβ3 के साथ प्रेरित किया गया । (एक) प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र चित्र । स्केल बार: २०० µm. (B) DAPI और αSMA के लिए Immunostaining । स्केल बार: १०० µm. (ग) EMT-संबंधी जीन का mRNA स्तर, वयस्क EPDCs का उपयोग करके qRT-पीसीआर में निर्धारित किया जाता है । मापा मूल्यों GAPDH और B2M अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत थे । मान का अर्थ + SD 2 ^-ΔΔct (n = 2) के रूप में दर्शाया गया है । संक्षिप्त: WT1: ' Wilms ट्यूमर 1, MMP3: मैट्रिक्स Metalloproteinase 3, POSTN: Periostin, αSMA: अल्फा चिकनी मांसपेशी Actin, Col1A1: कोलेजन 1A1 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
यहां हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए अलग और संस्कृति प्राथमिक epicardial मानव वयस्क और भ्रूण दिल से प्राप्त की कोशिकाओं । इन कोशिकाओं के व्यापक लक्षण वर्णन पहले17प्रकाशित किया गया है । हमें पता चला है कि दोनों कोशिका प्रकार उपकला cobblestone कोशिकाओं की तरह बनाए रखा जा सकता है जब ALK5 कळेनासे अवरोध करनेवाला SB431542 के साथ संस्कृति. EMT दोनों विकास और बाद चोट प्रतिक्रिया के दौरान vivo में epicardial सक्रियण का एक अभिन्न हिस्सा है । EMT TGFβ के अलावा इस विधि का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात, हम पहले कहा कि भ्रूण EPDCs तेजी से सहज EMT से गुजरना जब SB हटा दिया जाता है, जबकि वयस्क EPDCs केवल17उत्तेजना पर EMT से गुजरना । भ्रूण EPDCs में इन प्रक्रियाओं का अध्ययन कैसे बेहतर नुकसान के बाद वयस्क epicardium को सक्रिय करने के लिए समझने में सहायता कर सकते हैं ।
प्रस्तुत विधि रोगी सामग्री है, जो सर्जरी के दौरान प्राप्त की है पर निर्भर करता है । इसलिए, एक अलग सामग्री है, जो या तो रोगी परिवर्तनशीलता या जिस पर सामग्री ऑपरेटिंग थियेटर में एकत्र की है गति के कारण कर रहे है की स्थिति में कई बदलाव की उंमीद कर सकते हैं । इस भिन्नता की प्रक्रिया में अंतर समझा जा सकता है: 1) कितनी आसानी से epicardium को मायोकार्डियम से विच्छेदित किया जा सकता है, 2) प्लेट को पृथक कोशिकाओं के पालन, 3) को रोकने या EMT से गुजरना करने की क्षमता, और 4) प्रसार गति. सामांय में, एक त्वरित अलगाव सेल अस्तित्व के लिए बेहतर है । मुख्य महत्वपूर्ण बिंदु मायोकार्डियम से epicardium छीलने है । epicardium अंतर्निहित ऊतक का दृढ़ता से पालन किया जाता है, तो एक 15-ंयूनतम trypsin के साथ कार्डियक ऊतक के पूर्व उपचार epicardium को और अधिक आसानी से निकालने के लिए मदद कर सकते हैं । इसके अलावा, trypsin उपचार की प्रभावकारिता trypsin गतिविधि और ऊतक की संरचना सहित कई कारकों पर निर्भर करता है । इसलिए, अगर एक कम उपज मनाया जाता है, trypsin के साथ मशीन समय समायोजित किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, यदि कोई सेल गोली नीचे कताई के बाद दिखाई दे रहा है, समाधान पूरी तरह से फिल्टर के माध्यम से चलने से पहले असंबद्ध नहीं हो सकता है । सिरिंज के माध्यम से समाधान पारित करने से पहले या एक अतिरिक्त का उपयोग कर समाधान मिश्रण, छोटे सिरिंज कोशिकाओं अलग कर देना करने के लिए उपयोगी हो सकता है. EPDCs सीडिंग के लिए अच्छी तरह से आकार को सावधानी से विचार किया जाना चाहिए कोशिकाओं को सक्षम करने के लिए उनकी उपकला राज्य बनाए रखने के लिए. तालिका 1 एक संकेत देता है, लेकिन एक इस दिशानिर्देश से विचलित कर सकते हैं, जब, उदाहरण के लिए, केवल भ्रूण दिल का एक छोटा सा हिस्सा इस्तेमाल किया जा सकता है और एक छोटे से अच्छी तरह से चढ़ाना अधिक सुविधाजनक है ।
चूंकि भ्रूण कोशिकाओं को तुरंत sb के बिना EMT से गुजरना होगा17, भ्रूण EPDCs हमेशा sb के साथ चढ़ाया जाना चाहिए । हालांकि, वयस्क EPDCs अपनी उपकला आकृति बनाए रखने के लिए करते हैं और इसलिए पहले बीतने के पहले ४८ एच के दौरान SB के बिना चढ़ाया जा सकता है, सेल पालन को बढ़ावा देने के लिए. पहली यात्रा के बाद, दोनों वयस्क और भ्रूण EPDCs लगातार SB के साथ संस्कृति को सहज EMT को रोकने के हैं । इसके अलावा, कम सेल घनत्व EMT के लिए एक महत्वपूर्ण ट्रिगर है । EPDCs इसलिए ५०% से नीचे संस्कृति कभी नहीं होना चाहिए प्रवाह । दूसरी ओर, यदि EMT वांछित है, सुनिश्चित करें कि EPDCs बहुत घनी बीज नहीं हैं, और ७०% से नीचे रहने के प्रवाह । हालांकि इस प्रोटोकॉल TGFβ3 का उपयोग करता है, TGFβ1 के साथ उत्तेजना और-2 EPDCs में EMT के रूप में अच्छी तरह से प्रेरित कर सकते है (टिप्पणियों अप्रकाशित) ।
इस प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं को सीधे नीचे कताई के बिना विभाजित हैं, क्योंकि हम एक कम सेल अस्तित्व का पालन जब केंद्रापसारक का उपयोग कर । इसलिए, यह trypsin के कम मात्रा का उपयोग करने के लिए अपने निष्क्रियता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है जब सीरम युक्त मध्यम जोड़ा जाता है ।
~ 6-8 मार्ग के बाद, एक उपकला आकृति विज्ञान के साथ EPDCs या तो बढ़ बंद हो जाएगा या अनायास EMT से गुजरना होगा. इसलिए, प्रयोगों के लिए, हम गद्यांश 3 और गद्यांश 6 के बीच कॉबल EPDCs का उपयोग करते हैं । इसके विपरीत, एक mesenchymal आकृति विज्ञान के साथ EPDCs कम संवेदनशील होते है और 20 बीतने के लिए ऊपर कल्चरित किया जा सकता है । प्रयोगों में, तथापि, हम 10वें बीतने के बाद धुरी EPDCs इस्तेमाल कभी नहीं किया है ।
चूंकि epicardium दिल के बाहर स्थित है और अंतर्निहित ऊतक से अलग करने के लिए आसान है, कोशिकाओं की प्रामाणिकता स्पष्ट है, और महत्वपूर्ण संदूषण की संभावना कम है । हालांकि वसा ऊतक या रक्त वाहिकाओं कभी अलग epicardial परत करने के लिए छड़ी, उन कोशिकाओं के बहुमत अलगाव के दौरान छलनी पारित नहीं होगा, और अंयथा EPDC सेल संस्कृति में जीवित नहीं रह सकते । इसके अलावा, जैसा कि पहले उल्लेख किया है, मानव सामग्री का उपयोग कर मानव epicardial सेल व्यवहार की जांच करने के लिए एक अनूठा मॉडल प्रदान करता है। यह ज्ञात है कि, उदाहरण के लिए, epicardial वसा ऊतक प्रजातियों के बीच अलग है, मानव epicardial सेल मॉडल की आवश्यकता पर बल21.
यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हृदय auricles रोग के दिल पर सर्जरी के दौरान प्राप्त किए गए थे, और इसलिए रोग में मतभेद, इस्तेमाल किया दवा, उम्र, और दाता के लिंग प्रयोगों के reproducibility को प्रभावित कर सकते हैं । प्रयोगों इसलिए वैध परिणाम प्राप्त करने और ठोस निष्कर्ष तैयार करने की अनुमति देने के लिए कई अलगाव पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए । इसके अलावा, अनुसंधान के सवाल पर निर्भर करता है, एक विशेष रूप से केवल कोरोनरी रोग या गैर के साथ रोगियों कोरोनरी वाल्वुलर रोग है, जो अलग ढंग से व्यवहार की उंमीद कर रहे है रोगियों के साथ epicardium का उपयोग करने के लिए चुन सकते हैं ।
यह सुझाव दिया गया है कि अलिंद epicardium निलय epicardium से अलग विशेषताओं हो सकता है2, जिससे अगर epicardium अलिंद दिल auricle से व्युत्पंन epicardial व्यवहार के लिए एक वैध मॉडल प्रदान करता है पूछताछ । इस संदर्भ में, यह कहना है कि हम भ्रूण अलिंद और वेंट्रिकुलर व्युत्पंन EPDCs (अप्रकाशित डेटा) के बीच मतभेद नहीं मिल महत्वपूर्ण है । हालांकि, मानव वयस्क निलय से epicardium का उपयोग करने के लिए इस सत्यापित करने के लिए अंतिम सेल स्रोत होगा । फिर भी, EPDC अलगाव के लिए मानव वयस्क निलय के बड़े नमूनों का संग्रह रोगी के लिए अत्यधिक आक्रामक है, और इसलिए इस अस्पताल में वर्तमान में संभव नहीं है ।
हमने देखा है कि SB हमेशा EMT को रोकने के लिए पर्याप्त नहीं है, मुख्य रूप से भ्रूण EPDCs में । जब भ्रूण EPDCs SB की उपस्थिति में EMT से गुजरना, हम उंहें प्रयोगों से बाहर । एक परिणाम के रूप में, प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं को अपने SB के जवाब में एक उपकला phenotype बनाए रखने की क्षमता के लिए चुना जाता है. हम परिकल्पना है कि भ्रूण कोशिकाओं को पहले से ही EMT की प्रक्रिया में एक निश्चित सीमा से परे हो सकता है, और है कि एसबी के साथ अवरोध इस को रोकने में सक्षम नहीं है ।
इस epicardial सेल मॉडल कई अनुप्रयोगों है, के बाद से दोनों विकासशील और वयस्क epicardium जांच की जा सकती है । हमारी प्रयोगशाला में, हम कार्डियक क्षति के बाद epicardial अपक्षयी प्रतिक्रिया के सुधार पर ध्यान केंद्रित । वयस्क EPDCs यौगिकों जो EMT प्रेरित परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, epicardium के एक उन्नत reअपक्षयी प्रतिक्रिया के लिए एक संभावित चिकित्सीय दवा खोजने के लिए लक्ष्य. इसके अलावा, यह EPDCs द्वारा स्रावित कारकों को मापने के लिए paracrine (re) सृजन मायोकार्डियम के लिए संकेतन को समझने के लिए संभव है । इसके अलावा, जब से हमने देखा कि भ्रूण EPDCs अधिक EMT अनायास वयस्क EPDCs की तुलना में गुजरना प्रवण हैं, हम भ्रूण और वयस्क EPDCs के बीच मतभेदों की जांच । वृद्धि हुई भ्रूण सक्रियण के अंतर्निहित तंत्र का निर्धारण एक क्यू वयस्क दिल में epicardial सक्रियण में सुधार करने के लिए प्रदान कर सकता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस शोध को नीदरलैंड के ऑर्गेनाइजेशन फॉर साइंटिफिक रिसर्च (NWO) (वेणी 016.146.079) और एक LUMC रिसर्च फेलोशिप दोनों को एम्स, और LUMC Bontius Stichting (MJG) ने समर्थन दिया है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
| Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
| Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
| Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
| Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
| Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
| 10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
| Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
| Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet controller | Integra | 155 015 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Waterbath | GFL | 1083 |
References
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