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Developmental Biology

Die Isolation und die Kultur der primären Epicardial Zellen aus menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzens Exemplare

doi: 10.3791/57370 Published: April 24, 2018

Summary

Die Epicardium spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Reparatur des Herzens durch die Bereitstellung von Zellen und Wachstumsfaktoren der myokardialen Wand. Hier beschreiben wir eine Methode, um menschliche primäre epicardial Zellkulturen, die die Studie und den Vergleich ihrer Entwicklungs- und Erwachsenen Eigenschaften ermöglicht.

Abstract

Epicardium, eine epitheliale Zellschicht auf das Myokard hat eine wesentliche Rolle während der kardialen Entwicklung, sowie die Reparatur als Reaktion des Herzens nach ischämischen Verletzung. Wenn aktiviert, durchlaufen epicardial Zellen ein Verfahren bekannt als epitheliale Mesenchymale Transition (EMT) Zellen zu regenerierenden Myokard zu bieten. Darüber hinaus trägt die Epicardium durch Sekretion von wesentlichen Parakrine Faktoren. Um das regenerative Potential der Epicardium vollständig zu verstehen, ist eine menschliche zellenmodell erforderlich. Hier beschreiben wir eine neuartige Zellmodell der Kultur um menschliche Erwachsene und fetalen Herzgewebe primäre epicardial abgeleitete Zellen (EPDCs) abgeleitet. Um EPDCs zu isolieren, ist die Epicardium von außen auf das Herz-Exemplar seziert und zu einem einzigen Zellsuspension verarbeitet. Als nächstes sind EPDCs überzogen und in EPDC die ALK-5-Kinase-Inhibitor SB431542 weiterhin ihre epithelialen Phänotyps-haltigem Medium kultiviert. EMT wird durch Stimulation mit TGFβ induziert. Diese Methode ermöglicht zum ersten Mal die Untersuchung des Prozesses der menschlichen epicardial EMT in einer kontrollierten Umgebung und ermöglicht mehr Einblick in die Secretome des EPDCs, das Herz Regeneration helfen kann. Darüber hinaus ermöglicht dieser einheitlichen Ansatz zum direkten Vergleich der menschlichen Erwachsenen und fetalen epicardial Verhalten.

Introduction

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Die Epicardium, eine einzellige Epithelschicht, dass Umschläge das Herz ist von entscheidender Bedeutung für die kardiale Entwicklung und Reparatur (rezensiert in Smits Et al. 1). Entwicklungsgeschichtlich, die Epicardium ergibt sich aus der Proepicardial-Orgel, eine kleine Struktur, die am Fuße des Herzens entwickeln. Um Entwicklungsstörungen Tag E9.5 Maus und 4 Wochen Post-Konzeption in der Human-beginnen Zellen migrieren aus dieser Blumenkohl-Struktur und decken die entwickelnden Myokard-2. Sobald ein einzelnes epitheliale Zellschicht gebildet wird, wird ein Teil der epicardial Zellen epithelialen, Mesenchymale Transition (EMT) unterzogen. Während EMT Zellen verlieren ihre epithelialen Eigenschaften wie Zell-Zell-Verwachsungen, und erhalten einen mesenchymalen Phänotyp verleiht ihnen die Fähigkeit, in den Entwicklungsländern Myokard einwandern. Die gebildeten epicardial abgeleiteten Zellen (EPDCs) können in mehrere kardiale Zelltypen, einschließlich der Fibroblasten, glatten Muskelzellen und potenziell Kardiomyozyten und Endothelzellen3, unterscheiden, obwohl Zell-Differenzierung des letzteren zwei Populationen bleibt Gegenstand der Debatte (rezensiert in Smits Et al. ( 4). Darüber hinaus bietet die Epicardium lehrreich Parakrine Signale an den Herzmuskel, deren Wachstum und Vaskularisierung5,6,7,8zu regulieren. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Sehbehinderte epicardial Bildung zu Entwicklungsschäden im Herzmuskel9,10, Gefäßsystem11und Wärmeleitung System12 führt, betont das wesentliche Beitrag von Epicardium zur Bildung des Herzens.

Obwohl Erwachsene inmitten der Epicardium als ruhende Schicht vorhanden ist, wird es bei der Ischämie13reaktiviert. Epicardial Reaktivierung nach der Verletzung mehrere rekapituliert die Prozesse beschrieben für kardiale Entwicklung, einschließlich Verbreitung und EMT14, wenn auch weniger effizient. Interessant ist, obwohl der genaue Mechanismus ist nicht vollständig geklärt, die epicardial Beitrag zur Reparatur kann durch Behandlung mit z. B.Thymosin β415 verbessert werden oder geändert VEGF-A mRNA16, wodurch verbesserte Herz-Kreislauf Funktion nach Myokardinfarkt. Die Epicardium gilt daher eine interessante Zelle Quelle, endogene Reparatur des Geschädigten Herzens zu verbessern.

Mechanismen der kardialen Entwicklung sind oft bei Verletzungen, obwohl auf eine weniger effiziente Weise zusammengefaßt. Auf der Suche nach epicardial Aktivatoren ist es sehr wichtig, dass wir bestimmen und die volle Kapazität des fetalen und adulten Epicardium vergleichen. Aus therapeutischer Sicht ist es darüber hinaus wichtig, dass neben der Tierversuche, wir wissen in Bezug auf die Reaktion des menschlichen Epicardium erweitern. Hier beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultur menschlichen Erwachsenen und fetalen epicardial abgeleitete Zellen (EPDCs) in einer epithelialen Zellen ähnliche Morphologie und EMT zu induzieren. Mit diesem Modell wollen wir entdecken und vergleichen Sie Erwachsene und fetalen epicardial Zelle Verhalten.

Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die Verwendung von epicardial Menschenmaterial, die nicht gründlich untersucht worden. Wichtig ist, sieht das beschriebene Isolation und Zelle Kultur-Protokoll eine einzige einheitliche Methode um beide fetalen und adulten Kopfsteinpflaster EPDCs, so dass einen direkten Vergleich zwischen diesen beiden Quellen abzuleiten. Zusätzlich, da die Epicardium isoliert aufgrund seiner Lage ist, ist sichergestellt, dass die Zellen tatsächlich epicardially abgeleiteten17.

Während menschliche EPDC Isolierung Methoden bereits aufgebaut haben, setzen diese meist auf Auswuchs Protokolle wo Stücke von Herz- oder epicardial Gewebe auf eine Zelle Kultur Teller18,19überzogen sind. Dieser Ansatz wählt dabei speziell für Zellen, die teilweise ihre epithelialen Phänotyps verlieren, um zu migrieren, und sind anfälliger für spontane EMT unterziehen. In das aktuelle Protokoll erfolgt die Epicardium zuerst in eine einzelne Zelle Lösung erlaubt die isolierte EPDCs um ihre epitheliale Status beizubehalten. Diese Methode stellt daher eine solide in-Vitro -Modell, um epicardial EMT zu studieren.

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Protocol

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Alle Experimente mit menschlichen Gewebeproben wurden von der Ethikkommission des Leiden University Medical Center genehmigt und entspricht der Deklaration von Helsinki. Alle Schritte werden mit steriler Ausrüstung in einer Zelle Kultur Strömung Schrank ausgeführt.

1. Vorbereitungen

  1. Bereiten Sie EPDC Medium durch Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM Low-Glucose) und Medium 199 (M199) im Verhältnis 1:1 mischen. Fügen Sie 10 % Hitze inaktiviert fötalen Rinderserum (FBS, Hitze inaktiviert für 25 min bei 56 ° C) und mit 100 U/mL Penicillin und 100 mg/mL Streptomycin ergänzt. Vorwärmen der EPDC Medium in einem 37 ° C-Wasserbad.
  2. Vorwärmen Trypsin 0.25%/EDTA (1:1) in einem 37 ° C-Wasserbad.
  3. Mantel-Brunnen mit Gelatine. Hinzufügen von 0,1 % Gelatine/PBS in jede Vertiefung und die Platten für mindestens 15 Minuten bei 37 ° c inkubieren Richtlinien für die erforderliche Zellplatte Kultur sind in Tabelle 1zusammengefasst. Entfernen Sie vorsichtig alle Flüssigkeit vor der galvanischen Zellen.
  4. Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM SB431542 (SB), verdünnt in DMSO (Vorsicht). 50 µL-Aliquots in konischen Boden aus Polypropylen Zentrifuge Röhren, wie Eppendorf Röhren, und speichern Sie diese bei-20 ° C. Beachten Sie, dass SB Aliquote nur einmal aufgetaut werden können.

2. Abruf und Speicherung von Erwachsenen und fetalen Herzens Exemplare

  1. Speichern von menschlichen Erwachsenen Ohrmuscheln direkt nach Entnahme während der Operation in einen 50-mL-Tube mit 15 mL High-Glukose DMEM mit 10 % FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 mg/mL Streptomycin bei 4 ° C. Proben sind in der Regel ca. 3-5 cm groß und kann gespeichert werden, bis zu 48 h nach Dissektion.
  2. Speichern Sie fetalen Herzen aus elektiven Abtreibung Material in EPDC Medium bei 4 ° C bis zu 24 h nach Isolierung erhalten. Verwenden Sie für dieses Protokoll Proben mit einem Gestationsalter zwischen 12-22 Wochen. Beachten Sie, dass das ganze Herz zur Isolation von der Epicardium verwendet werden kann.

3. Isolation der Epicardial Schicht

  1. Bereiten Sie in der Laminar-Flow Kabinett ein 100-mm-Zellkultur-Gericht mit PBS und ein separates Tröpfchen (~ 200 µL) PBS im Deckel. Füllen Sie eine 15-mL-Tube mit 5 mL vorgewärmten EPDC Medium.
  2. Legen Sie das Gewebe in der Zellkultur Schale gefüllt mit PBS. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe während des Verfahrens häufig befeuchtet wird.
  3. Mit einem Stereomikroskop, so viel der epicardial Schicht aus der Gewebeprobe möglichst durch Abziehen mit Pinzette entfernen.
    Hinweis: Die Epicardium kann erkannt werden, da eine sehr dünne, transparente Schicht dicht an der Außenseite des Herzens (Abbildung 1A) eingehalten. Versuchen Sie, die Kontamination mit epicardial Fettgewebe und Blutgefäßen zu vermeiden, da dies die Isolierung behindern wird.
  4. Sammeln Sie Stücke von epicardial Gewebe in den Tropfen des PBS auf dem Deckel.
  5. Schneiden Sie das epicardial Gewebe in kleine Stücke (0,5 mm3) mit einem Skalpell (Abbildung 1 b) oder mit den scharfen Spitzen der kleinen Zange. Beachten Sie, dass die Stücke ein P1 weitergeben zu können sollten 000 pipettieren Tipp (Schritt 3,6).
  6. Das epicardial Gewebe 1 mL Trypsin hinzu und sammeln Sie die Stücke und Trypsin mit P1, 000 pipettieren Tipp. Übertragen Sie das Gewebe in eine 1,5 mL konische Zentrifugenröhrchen (Abbildung 1).
  7. Inkubieren Sie das Rohr im Wasserbad 37 ° C für 10 min, unter Schütteln bei ~ 60 u/min.
  8. Nehmen Sie das Rohr aus dem Wasserbad und reinigen Sie die Außenseite des Rohres mit 70 % Ethanol.
  9. Lassen Sie das Gewebe auf den Boden des Rohres (Abbildung 1) sinken und sorgfältig übertragen des Überstands epicardial Zellen um die 15-mL-Tube mit 5 mL EPDC Medium um die Trypsin zu inaktivieren.
  10. Füllen Sie das restliche Gewebe in die konische Zentrifugenröhrchen mit 1 mL Trypsin auf, und mischen Sie, indem Sie sanft auf und ab pipettieren.
  11. Wiederholen Sie Schritt 3,7 bis 3.10 zweimal. Im letzten Schritt nach insgesamt 30 min Inkubation Trypsin, übertragen der überstand und das restliche epicardial Gewebe in das Rohr mit EPDC Medium.
  12. Wenn alle Zellen in EPDC Medium gesammelt sind, durchlaufen Sie sanft die Aussetzung einer 10 mL Spritze mit einer 19-Gauge-Nadel in eine neue 15-mL-Tube die Zellen (Abbildung 1E) mechanisch zu trennen.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Aussetzung zu homogenisieren, durch pipettieren rauf und runter, bevor man die Lösung durch die Nadel, die Nadel immer behindert zu verhindern.
  13. Um die Zellen weiter zu distanzieren, wiederholen Sie Schritt 3.12 mit einer 21-Gauge-Nadel.
  14. Legen Sie ein 100 µm Zelle Sieb auf einen 50-mL-Tube und übertragen Sie die epicardial Zellen auf das Sieb mit einer 10 mL-Pipette um alle restlichen Klumpen (Abb. 1F) zu entfernen-haltigem Medium zu.
  15. Waschen Sie das Sieb verbleibende Zellen sammeln durch pipettieren 5 mL EPDC Medium auf das Sieb.
  16. Pipettieren der Zellsuspension aus dem 50-mL-Röhrchen in eine 15-mL-Tube. Da Zellen an der Unterseite des Rohres zu versenken, schütteln Sie die Lösung leicht vor dem pipettieren.
    Hinweis: Dieser Schritt ist, zwar nicht notwendig hilft ein kleiner Schlauch Visualisierung des Geschosses nach Zentrifugation.
  17. Zentrifugieren Sie bei 200 X g für 5 min bei Raumtemperatur (Abbildung 1).
  18. Entfernen Sie den überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet (Abbildung 1 H) in die gewünschte Lautstärke des EPDC Medium (Tabelle 1).
    Hinweis: Für fetale EPDCs verwenden Sie direkt EPDC Medium mit 10 µM von der ALK5-Kinase-Inhibitor (EPDC + SB). Adulten Zellen können während der ersten Passage ohne SB überzogen.
  19. Platte der Zellsuspension auf die Gelatine beschichtet-Kultur-Platten (Abbildung 1I). Die Größe des Brunnens hängt von der Größe der epicardial Gewebeprobe (Tabelle 1). Beachten Sie, dass niedrige Konfluenz das Auftreten von EMT induziert wird.
  20. Legen Sie die Zellen in den Inkubator für mindestens 48 h bei 37 ° C, 5 % CO2 damit die Zellen an der Kultur-Platte befestigen.

(4) Kultur der EPDCs

  1. Ergänzen Sie das EPDC + SB-Medium mindestens alle 3 Tage.
  2. Überprüfen Sie die Zellen mindestens alle 3 Tage das Mikroskop. Wenn die Zellen Konfluenz, d. h., erreichen wenn die Kultur-Platte voll mit Zellen bedeckt ist, die passage der Zellen im Verhältnis 1:2 Oberfläche. Beachten Sie, dass erreichen Konfluenz ~ 5-10 Tage dauern kann.
    1. Aspirieren Sie das Medium mit einem pipettieren oder eine Aspirationssystem mit z. B.einem Glas pipettieren.
    2. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von PBS zu den Zellen vorsichtig. Vorsichtig schwenken der Plattenrandes und Aspirieren der PBS.
    3. Hinzu kommt die Platte Trypsin. Drehen Sie vorsichtig die Platte, um alle Zellen mit Trypsin zu decken und die Platte für 1 min bei 37 ° c inkubieren
      Hinweis: Verwenden Sie als kleine Trypsin wie möglich (Hinweis: gut 200 µL pro Bohrloch einer 6 Teller)
    4. Tippen Sie auf die Platte, um die Zellen von der Unterseite der Platte mechanisch zu lösen. Verwenden Sie das Mikroskop, um visuell zu überprüfen, ob Zellen getrennt haben. Wenn dies nicht der Fall ist, eine zusätzliche Minute Kultur Zellplatte inkubieren.
    5. Fügen Sie das erforderliche Volumen der EPDC + SB-Medium auf die Zellen, Aufschwemmen durch pipettieren rauf und runter und die Zellsuspension auf eine neue Gelatine beschichtet-Kultur-Platte zu übertragen.
      Hinweis: im Allgemeinen können Zellen in einer gepflasterten Morphologie bis Durchgang 8 gehalten werden.

5. Induktion von EMT in EPDCs

  1. EMT induzieren, distanzieren Sie sich die Zellen mit Trypsin und Transfer der Zellen zu neuen Gelatine beschichtete Brunnen im Verhältnis 1:2 Oberfläche in EPDC + SB Medium, wie unter 4 beschrieben, und inkubieren Sie für mindestens 24 Stunden bei 37 ° C, 5 % CO2.
  2. Check ist wenn confluency 50-70 % und haben EPDCs eine Kopfsteinpflaster-Morphologie.
    Hinweis: Konfluenz beeinträchtigt die Fähigkeit der EPDCs EMT zu unterziehen.
  3. Aspirieren Sie das Medium aus den Zellen und die Zellen vorsichtig mit PBS waschen (siehe Punkt 4.2.1 - 4.2.2).
  4. Stimulieren Sie Zellen mit 1 ng/mL TGFβ3 in EPDC Medium zu, und legen Sie sie in einem Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2 für 5 Tage. Beachten Sie, dass während der Stimulation, TGFβ3-haltigem EPDC-Medium nicht wieder aufgefüllt werden muss.
  5. Die Zellen sind täglich zu überwachen. Nach 5 Tagen sind Zellen, die EMT erfuhr eine spindelförmige Morphologie (Abbildung 2A) anerkannt.
  6. Kultur spindelförmige EPDCs nach der Methode in 4 ohne Zusatz von SB oder TGFβ EPDC Medium beschrieben. Beachten Sie, dass in der Regel spindelförmig EPDCs bis Durchgang 20 kultiviert werden können.
  7. Überprüfen Sie das Auftreten von EMT mit immunofluorescent Färbung mit Antikörpern gegen die mesenchymalen Marker αSMA oder Vimentin oder durch Phalloidin, um die Bildung von F-Aktin Stress Fasern (Abb. 2 b) zu erkennen, oder mittels qRT-PCR für EMT-Genen ( z.B., WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-Cadherin, MMP3, Schnecke, Schnecke) (Abbildung 2 und Tabelle 2).

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Representative Results

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Hier beschreiben wir eine einfache Protokoll zur EPDCs von menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzgewebe (Abbildung 1) zu isolieren. Dieses Protokoll nutzt die verkehrsgünstige Lage der Epicardium an der Außenseite des Herzens (Abbildung 1A). Färbung des Herzens Ohrmuschel nach Dissektion zeigt, dass die WT1 + Epicardium entfernt wird, während die zugrunde liegenden Subepicardial extrazelluläre Matrix und Herzmuskelgewebe intakt (Abbildung 1J) bleiben. Umfassende Charakterisierung worden vor, was zeigt, dass EPDCs epicardial Marker, z. B., ALDH1A2, TBX18, KRT8, KRT19 und fehlende Expression von anderen Herz-Resident Zelltypen, z. B.PECAM1, ISL1, CD34 und TNNT2 Express durchgeführt. 17

Erwachsenen (Abbildung 1 K) und fetalen (Abbildung 1 L) EPDCs kultiviert in Anwesenheit von ALK5-Kinase-Inhibitor SB431542 zeigen eine Kopfsteinpflaster-Morphologie. Allerdings können je nach Spender und Kultur, fetale EPDCs EMT trotz der Anwesenheit von SB zu unterziehen. Dadurch können in spindelförmige Zellen innerhalb der Bevölkerung von Kopfsteinpflaster Zellen (siehe Pfeile in Abbildung 1 L). Bitte beachten Sie, dass die Isolierung von Pflasterstein-förmigen Zellen aus fetalem Gewebe nicht immer möglich ist und kann bei der Ableitung der meist spindelförmige Zellen führen. Da diese Zellen schneller wachsen, werden sie schnell Andere Zelltypen überwuchern.

EMT kann durch Inkubation mit TGFβ320 für 5 Tage in adulten und embryonalen Zellen induziert werden, wie durch eine eindeutige morphologische Übergang zur spindelförmige Zellen (Abbildung 2A). Wie mit der unbehandelten Kontrolle ("leer") gezeigt hat, werden fetalen EPDCs spontane EMT nach Entfernung der SB, unterziehen, während Erwachsene EPDCs EMT nur nach Stimulation mit TGFβ3 unterzogen werden. Um EMT zu validieren, wurden EPDCs Immunostained mit Alpha-Glattmuskel Aktin (αSMA), ein mesenchymalen Marker (Abb. 2 b). Darüber hinaus bestätigte EMT in adult EPDCs mit qRT-PCR zeigt Herabregulation der epicardial Markierung WT1 und Hochregulation der mesenchymalen Marker POSTN, αSMA, Kollagen 1A1, MMP3 und N-Cadherin (Abbildung 2). Umfassende Experimente bezüglich adulten und embryonalen epicardial EMT sind vor17veröffentlicht.

Gewebe Geben Sie nun Zelle Wachstumsbereich (cm2) Volumen des Mediums (mL) Zugabe von SB
Fetalen 24 1.9 0,5 Direkt
Kleine Erwachsene (< 4 cm) 12 3.8 1 Nach 1St -passage
Erwachsener groß 6 9.6 2 Nach 1St -passage
(> 4 cm)

Tabelle 1: Leitfaden für die Auswahl der entsprechenden Kultur Zellplatte. Die erforderliche gut Größe hängt von epicardial Zellen isoliert. Diese Richtlinien können als Faustregel, wählen die entsprechende Zelle Kultur Platte verwendet werden.

Gen Sequenz
WT1 vorwärts CAG CTT GAA TGC ATG ACC TG
WT1 Reverse TAT-TCT GTA TTG GGC TCC GC
N-Cadherin vorwärts CAG ACC GAC CCA AAC AGC AAC
N-Cadherin Reverse GCA GCA ACA GTA AGG ACA AAC ATC
POSTN nach vorne GGA GGC AAA CAG CTC AGA GT
POSTN Rückseite GGC TGA GGA AGG TGC TAA AG
SMA-Forward CCG GGA GAA AAT GAC TCA AA
SMA Reverse GAA GGA ATA GCC ACG CTC AG
MMP3 nach vorne TGG ATG CCG KATZE ATG AAG
MMP3-Rückseite CAG AAA TGG CTG KATZE CGA
COL1A1 nach vorne CCA GAA GAA CTG GTA KATZE CAG CA
COL1A1 Rückseite CGC KATZE ACT CGA AAT GGG AAT
GAPDH nach vorne AGC CAC ATC GCT CAG ACA C
GAPDH Rückseite GCC CAA TAC GAC CAA ATC C
B2M vorwärts ACA CTG AAT TCA CCC CCA CT
B2M Reverse GCT TAC ATG TCT CGA TCC CAC T

Tabelle 2: Primer-Sequenzen verwendet für die Validierung von EMT in EPDCs. Sequenzen von forward und reverse Primer für qRT-PCR verwendet, um festzustellen, dass die Expression von mehreren EMT Gene in adult EPDCs verwandt.

Figure 1
Abbildung 1 : Isolierung von Epicardial abgeleitete Zellen (EPDCs). (A) Depicted ist eine Erwachsene Ohrmuschel entfernt aus dem menschlichen Herzen mit einer dünnen äußeren häutigen, Epicardium, die entfernt wird. Der schwarze Pfeil zeigt auf die Epicardium. (B-ich) Visuelle Darstellung der Isolierung Methode der EPDCs. Der schwarze Pfeil zeigt auf die Zelle Pellet. (J) Immunofluorescent Färbung des ein Herz Ohrmuschel mit und ohne Dissektion der Epicardium. Maßstabsleiste: 50 µm. (K) repräsentative Bilder von zwei verschiedenen Erwachsenen EPDC Isolationen kultiviert mit SB (L) repräsentative Bilder von zwei verschiedenen fetalen EPDC Isolationen kultiviert mit SB Black Pfeile zeigen mesenchymalen-ähnlichen Zellen im fetalen EPDC Kultur. Maßstabsleiste: 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Validierung von EMT in menschlichen Erwachsenen und fetalen Epicardial gewonnenen Zellen (EPDCs). Erwachsene und fetalen EPDCs waren kultiviert mit SB, nicht behandelt (leer) oder mit TGFβ3 für 5 Tage stimuliert. (A) repräsentative Hellfeld Bilder. Maßstabsleiste: 200 µm. (B) Immunostaining für DAPI und αSMA. Maßstab: 100 µm. (C) mRNA-Niveaus von EMT-Genen, in adulten EPDCs mittels qRT-PCR bestimmt. Gemessenen Werte wurden auf GAPDH und B2M Ausdruck normalisiert. Werte sind dargestellt als Mittelwert + SD 2 ^-ΔΔct (n = 2). Abkürzungen: WT1:Wilms' Tumor 1, MMP3: Matrix-Metalloproteinase-3, POSTN:Periostin, αSMA: Alpha Glattmuskel Aktin, Col1A1:Collagen 1A1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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Hier beschreiben wir ein ausführliches Protokoll zu isolieren und Kultur primäre epicardial Zellen aus menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzen abgeleitet. Umfassende Charakterisierung dieser Zellen wurde bisher veröffentlichten17. Wir haben gezeigt, dass beide Zelltypen als Epithelzellen Kopfsteinpflaster-wie, wenn mit dem ALK5-Kinase-Inhibitor SB431542 kultiviert aufrechterhalten werden können. EMT ist fester Bestandteil des epicardial Aktivierung in Vivo während der Entwicklung und der posttraumatischen Antwort. EMT kann mit dieser Methode durch Zugabe von TGFβ untersucht werden. Wichtig ist, haben wir zuvor beobachtet, dass fetale EPDCs schnell spontane EMT unterziehen, wenn SB entfernt wird, während Erwachsene EPDCs nur EMT auf Anregung17unterziehen. Studium dieser Prozesse in fetalen EPDCs kann helfen, zu verstehen, wie optimal die Erwachsenen Epicardium nach Schaden aktivieren.

Die vorgestellte Methode stützt sich auf Patientenmaterial, die während der Operation gewonnen wird. Daher erwartet man mehrere Variationen in den Zustand des Materials isoliert, die sind entweder durch Patienten Variabilität oder die Geschwindigkeit, an der das Material im Operationssaal gesammelt wird. Diese Variante kann Unterschiede in der Vorgehensweise erklären: 1) wie leicht die Epicardium von Myokard seziert werden kann, 2) die Einhaltung der isolierten Zellen der Platte (3) die Fähigkeit zu verhindern oder EMT und Verbreitung (4) Geschwindigkeit zu unterziehen. Im Allgemeinen empfiehlt sich eine schnelle Isolation für Zelle überleben. Der größte Knackpunkt ist die Epicardium von Myokard peeling. Wenn die Epicardium stark das darunter liegende Gewebe eingehalten wird, kann eine 15-min-Vorbehandlung von Herzgewebe mit Trypsin helfen, die Epicardium leichter entfernen. Darüber hinaus ist die Wirksamkeit der Behandlung Trypsin hängt von mehreren Faktoren ab, darunter die Trypsin-Aktivität und die Zusammensetzung des Gewebes. Daher, wenn eine geringe Ausbeute beobachtet wird, kann die Inkubationszeit mit Trypsin angepasst werden. Zusätzlich, wenn keine Zelle Pellet nach Spinnen unten sichtbar ist, könnte die Lösung nicht völlig getrennt worden haben vor der Ausführung durch den Filter. Mischen die Lösung bevor man die Lösung durch die Spritze oder eine zusätzliche, könnte kleinere Spritze nützlich, die Zellen zu trennen sein. Die gut Größe für die Aussaat EPDCs sollte sorgfältig abgewogen werden, ermöglichen Zellen epithelialen Zustand zu halten. Tabelle 1 gibt Aufschluss, aber man kann von dieser Leitlinie abweichen, wenn beispielsweise nur ein kleiner Teil des fetalen Herzens einsetzbar und Beschichtung in einem kleineren gut bequemer ist.

Da fetale Zellen EMT sofort ohne SB17unterzogen werden, sollten fetalen EPDCs immer mit SB plattiert. Jedoch Erwachsene EPDCs neigen dazu, ihre epitheliale Morphologie zu pflegen und können daher ohne SB während der ersten 48 Stunden der ersten Passage, Förderung der zelladhärenz beschichtet werden. Nach dem ersten Durchgang sind Erwachsene und fetalen EPDCs kontinuierlich mit SB gegen spontane EMT kultiviert. Darüber hinaus ist gering Zelldichte ein wichtiger Auslöser für EMT. EPDCs sollten daher nie unter 50 % Konfluenz kultiviert werden. Auf der anderen Seite wenn EMT gewünscht wird, stellen Sie sicher, dass EPDCs sind nicht zu dicht ausgesät, und unter 70 % Konfluenz bleiben. Obwohl dieses Protokoll TGFβ3 nutzt, kann Stimulation mit TGFβ1 und-2 EMT in EPDCs sowie (Beobachtungen unveröffentlicht) induzieren.

In diesem Protokoll sind Zellen geteilt werden direkt ohne Schleudern, da wir eine untere Zelle überleben beobachten, wenn die Zentrifuge zu verwenden. Daher ist es wichtig, geringe Mengen von Trypsin zu verwenden, um seine Deaktivierung zu gewährleisten, wenn Serum enthaltenden Medium hinzugefügt wird.

Nach ca. 6-8 Gänge EPDCs mit einer epithelialen Morphologie werden entweder aufhören zu wachsen oder werden EMT spontan zu unterziehen. Daher verwenden wir für Experimente, Kopfsteinpflaster EPDCs zwischen Abschnitt 3 und Abschnitt 6. Im Gegensatz dazu können EPDCs mit mesenchymalen Morphologie sind weniger anfällig und bis Durchgang 20 kultiviert. In Experimenten, aber wir haben nie verwendet Spindel EPDCs nach der 10th -Passage.

Da die Epicardium befindet sich an der Außenseite des Herzens und lässt sich vom darunterliegenden Gewebe zu trennen, die Echtheit der Zellen ist offensichtlich, und die Chance auf signifikante Kontamination ist gering. Obwohl Fettgewebe oder Blutgefäße manchmal an der isolierten epicardial Schicht halten, die meisten dieser Zellen geben nicht das Sieb in die Isolation und sonst nicht überleben in der Zellkultur EPDC. Darüber hinaus bietet wie bereits erwähnt, mit menschlichem Material ein einzigartiges Modell zur Untersuchung der menschlichen epicardial Zelle Verhalten. Es ist bekannt, dass zum Beispiel epicardial Fettgewebe zwischen den Arten, unter Betonung der Notwendigkeit der menschlichen epicardial Zelle Modelle21unterscheidet.

Es sei darauf hingewiesen, dass Herz Ohrmuscheln wurden während der Operation am Kranken Herzen, und daher die Unterschiede in verwendeten Medikamente, Krankheit, Alter und Geschlecht des Spenders auf die Reproduzierbarkeit der Experimente Einfluss können. Experimente sollten daher durchgeführt werden, auf mehrere Isolationen, gültige Ergebnisse zu erzielen und solide Rückschlüsse gezogen werden. Darüber hinaus abhängig von der Fragestellung können eine speziell für nur Epicardium von Patienten mit ischämischen Herzkrankheit oder Patienten mit nicht-ischämischen Herzklappenfehler Krankheit, die sich anders verhalten sollen.

Es wurde vermutet, dass Vorhofflimmern Epicardium kann verschiedene Merkmale von Ventrikel Epicardium2, damit Fragen, wenn das Vorhofflimmern Herz Ohrmuschel Epicardium abgeleitet bietet ein gültiges Modell für epicardial Verhalten. In diesem Zusammenhang ist es wichtig, darauf hinzuweisen, dass wir nicht finden konnten, dass Unterschiede zwischen fetalen Vorhofflimmern und ventrikuläre EPDCs (unveröffentlichte Daten) abgeleitet. Mit Epicardium aus dem menschlichen Erwachsenen Ventrikel wäre jedoch die ultimative Zelle Quelle um dies zu überprüfen. Dennoch sammeln große Exemplare der menschlichen Erwachsenen Ventrikel EPDC Isolation ist hochgradig invasiv für den Patienten, und ist daher derzeit nicht möglich in diesem Krankenhaus.

Wir beobachteten, dass SB nicht immer ausreicht, EMT, vor allem im fetalen EPDCs zu verhindern. Wenn fötale EPDCs EMT in Anwesenheit von SB unterziehen, schließen wir sie aus Experimenten. Als Folge werden Zellen für Experimente verwendet für ihre Fähigkeit zur Aufrechterhaltung einer epithelialen Phänotyps in Reaktion auf SB ausgewählt. Wir vermuten, dass fetale Zellen können bereits über einen bestimmten Schwellenwert in den Prozess der EMT, und diese Hemmung mit SB nicht in der Lage ist, diese zu stoppen.

Diese epicardial Zellmodell hat mehrere Anwendungen, da die Entwicklung und die Erwachsenen Epicardium untersucht werden können. In unserem Labor konzentrieren wir uns auf die Verbesserung der epicardial regenerative Antwort nach Herzschäden. Adult EPDCs können verwendet werden, um Verbindungen zu testen, die EMT, mit dem Ziel, potenzielle therapeutisches Medikament für eine verbesserte regenerative Reaktion der Epicardium finden zu veranlassen. Darüber hinaus ist es möglich, abgesondert von EPDCs zu verstehen, die Signalisierung zu (Re-) Parakrine Faktoren messen generieren Myokard. Darüber hinaus, da wir beobachten, dass fetale EPDCs anfälliger für EMT spontan im Vergleich zu Erwachsenen EPDCs zu unterziehen sind, untersuchen wir die Unterschiede zwischen der fetalen und adulten EPDCs. Bestimmung des zugrunde liegenden Mechanismus der fetalen mehraktivierung könnte ein Stichwort zur Verbesserung der epicardial Aktivierung in das Erwachsene Herz bieten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Forschung wird durch die niederländische Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) (VENI 016.146.079) und ein LUMC Forschungsstipendium für AMS und LUMC Bontius Stichting (MJG) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX Gibco 21885-025
Medium 199  Gibco 31150-022
Fetal Bovine Serum  Gibco 10270-106
Trypsin 0.25% Invitrogen 25200-056
Penicillin G sodium salt Roth HP48
Streptomycin sulphate Roth HP66
Trypsin 1:250 from bovine pancreas Serva 37289
EDTA Sigma E4884
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890
Culture plates 6 well Greiner bio-one 657160
Culture plates 12 well Corning 3512
Culture plates 24 well Greiner bio-one 662160
SB 431542 Tocris 1614
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Merck 102931
100-1000µL Filtered Pipet Tips Corning 4809
10-ml pipet Greiner bio-one 607180
5-ml pipet Greiner bio-one 606180
Cell culture dish 100/20 mm Greiner bio-one 664160
PBS Gibco 10010056 Or home-made and sterilized
Eppendorf tubes 1.5 mL Eppendorf 0030120086
15-ml centrifuge tubes Greiner bio-one 188271
50-ml centrifuge tubes Greiner bio-one 227261
10 mL Syringe Becton Dickinson 305959
Needles 19 Gauge Becton Dickinson 301700
Needles 21 Gauge Becton Dickinson 304432
EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm Greiner bio-one 542000
TGFβ3  R&D systems 243-B3
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle Sigma A2547 
Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Invitrogen A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen A12379
Equipment
Name Company Catalog Number Comments
Pipet P1,000 Gilson F123602
Pipet controller Integra 155 015
Stereomicroscope Leica M80
Inverted Light Microscope Olympus CK2
Centrifuge Eppendorf 5702
Waterbath GFL 1083

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References

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Die Isolation und die Kultur der primären Epicardial Zellen aus menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzens Exemplare
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Dronkers, E., Moerkamp, A. T., van Herwaarden, T., Goumans, M. J., Smits, A. M. The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens. J. Vis. Exp. (134), e57370, doi:10.3791/57370 (2018).More

Dronkers, E., Moerkamp, A. T., van Herwaarden, T., Goumans, M. J., Smits, A. M. The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens. J. Vis. Exp. (134), e57370, doi:10.3791/57370 (2018).

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