Summary
Epicardium hücreleri ve büyüme faktörleri miyokardiyal duvara sağlayarak geliştirme ve onarım kalp önemli bir rol oynar. Burada, çalışma ve gelişimsel ve yetişkin özellikleri karşılaştırma sağlar kültür insan birincil epicardial hücreleri yöntemine açıklayın.
Abstract
Epicardium, Miyokardiyum kapsayan bir epitel hücre katmanı iskemik yaralanma sonra kalp geliştirme sırasında hem de onarım yanıt kalp önemli bir rol vardır. Aktif hale getirildiğinde, epicardial hücreleri epitelyal Mezenkimal geçiş (EMT) hücreleri Yenileyici Miyokardiyum için sağlamak için bilinen bir sürecinden geçmeleri. Ayrıca, epicardium temel parakrin faktörler salgılanmasını katkıda bulunur. Tam takdir epicardium rejeneratif potansiyelini ortaya çıkarmak için bir insan hücre modeli gereklidir. Burada bir roman hücre kültür model birincil epicardial türetilmiş hücre (EPDCs) insan yetişkin ve fetal kalp dokudan türetmek için anahat. EPDCs izole etmek için epicardium kalp numune dışarıdan disseke ve bir tek hücre süspansiyon işlenmiş. Ardından, EPDCs kaplama ve ALK 5-kinaz inhibitörü onların epitel fenotip korumak için SB431542 içeren EPDC ortamda kültürlenir. EMT stimülasyon ile TGFβ tarafından indüklenen. Bu yöntem sağlar, ilk kez, kontrollü bir ortamda insan epicardial EMT sürecinin incelenmesi ve kalp rejenerasyon yardımcı olabilir EPDCs secretome daha fazla anlayış kazanıyor kolaylaştırır. Ayrıca, bu üniforma yaklaşım insan yetişkin ve fetal epicardial davranışını doğrudan karşılaştırma için sağlar.
Introduction
Epicardium, zarflar, olduğunu kalp geliştirme ve (gözden Smits ve ark. tamir için hayati önemi olan bir tek hücreli epitel tabaka 1). proepicardial organ, gelişmekte olan kalp tabanında bulunan küçük bir yapı developmentally, epicardium kaynaklanmaktadır. Gelişimsel güne E9.5 fare ve 4 hafta sonrası anlayışı insan, hücreleri bu karnabahar yapısından geçirmek ve kapak gelişmekte olan Miyokardiyum2başlayın. Bir kez bir tek epitel hücre katmanı oluşturulur, bir kısmını epicardial hücreleri epitel Mezenkimal geçiş (EMT) uğrar. EMT sırasında hücreleri epitel onların niteliklerinden hücre-hücre yapışıklıklar, kaybetmek ve onları gelişen Miyokardiyum geçirmek için kapasitesi sayesinde daha çok bir Mezenkimal fenotip elde edilir. Her ne kadar ikinci farklılaşma iki hücre fibroblastlar, düz kas hücreleri ve potansiyel olarak cardiomyocytes ve endotel hücreleri3, gibi çeşitli kardiyak hücre türleri kurulan epicardial türetilmiş hücre (EPDCs) ayırt nüfus kalır (gözden Smits ve ark. içinde tartışma konu 4). Ayrıca, onun büyüme ve vaskülarizasyon5,6,7,8düzenlemek için öğretici parakrin sinyalleri Miyokardiyum için epicardium sağlar. Engelli epicardial oluşumu kalp kası9,10, damarlara11ve iletim sistemi12temel vurgu, gelişimsel hatalarına yol açar birden fazla çalışmalar göstermiştir epicardium kalp oluşumu için katkı.
Yetişkin kalbinde epicardium uyuyan bir katman olarak mevcut olsa da, iskemi13yeniden olur. Epicardial yeniden etkinleştirme sonrası yaralanma beyannamedir birkaç işlemler yayılması ve EMT14, olsa da dahil olmak üzere kalp geliştirme için daha az verimli bir şekilde açıklanan. İlginçtir, her ne kadar kesin mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir, onarmak için epicardial katkı tedavi ile örneğin, Thymosin β415 tarafından geliştirilmiş veya VEGF-bir mRNA16iyileştirmiştir kalp kaynaklanan, değişikliğin Miyokard İnfarktüsü sonra işlev. Epicardium bu nedenle endojen onarım yaralı kalp geliştirmek için ilginç bir hücre kaynak olarak kabul edilir.
Kalp Geliştirme mekanizmalarının kez yaralanma sırasında daha az verimli bir şekilde her ne kadar recapitulated. Epicardial aktivatörleri arayışı içinde belirlemek ve fetal ve yetişkin epicardium tam kapasite karşılaştırmak önemlidir. Ayrıca, terapötik bir bakış açısından bu hayvan deneyleri ek olarak, biz bilgi ile ilgili insan epicardium yanıt uzatmak önemlidir. Burada, izole ve insan yetişkin ve fetal epicardial türetilmiş hücrelerinde (EPDCs) bir epitel hücre gibi Morfoloji kültür ve EMT ikna etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu model ile keşfetmek ve yetişkin ve fetal epicardial hücre davranış karşılaştırın hedefliyoruz.
Bu iletişim kuralı en büyük avantajı değil iyice incelenmiştir insan epicardial malzeme kullanmaktır. Önemlisi, açıklanan yalıtım ve hücre kültürü iletişim kuralı bu iki hücre kaynakları arasında doğrudan bir karşılaştırma etkinleştirme her iki fetal ve yetişkin Arnavut kaldırımı EPDCs türetmek için tek bir üniforma yöntemi sağlar. Ayrıca, epicardium, konuma göre izole olduğu için aslında epicardially türetilmiş17hücrelerdir sağlanmaktadır.
İnsan EPDC izolasyon yöntemleri daha önce kurulmuş olan sağlarken, bunlar çoğunlukla nerede kalp veya epicardial doku parçaları bir hücre kültür çanak18,19kaplama yapılan protokol bağlıdır. Bu yaklaşım böylece bunu kısmen geçirmek için onların epitel fenotip kaybetmek ve spontan EMT geçmesi daha eğilimli olan özellikle hücreleri için seçer. Geçerli protokol epicardium epitel onların durumunu korumak izole EPDCs sağlayan bir tek hücre çözümü önce işlenir. Bu yöntem bu nedenle epicardial EMT eğitim için bir katı vitro modeli sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan dokusu numuneler ile tüm deneyler Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve Helsinki Deklarasyonu için uygundur. Tüm adımlar bir hücre kültür akışı kabine steril ekipmanları ile gerçekleştirilir.
1. hazırlıkları
- EPDC orta Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM düşük-glikoz) ve orta 199 (M199) 1:1 oran içinde karıştırarak hazırlayın. % 10 ısı inaktive fetal sığır serum (FBS, 25 dk 56 ° c için inaktive ısı) ekleyin ve ilave 100 U/mL penisilin ve 100 mg/mL streptomisin ile. 37 ° C su banyosu EPDC ortamda önceden ısıtmak.
- Tripsin önceden sıcak 0.25%/EDTA (1:37 ° C su banyosunda 1).
- Wells jelatin ile kat. Her şey için % 0,1 jelatin/PBS ekleyin ve en az 15 dakika 37 ° C'de plakaları kuluçkaya Yönergeleri gerekli hücre kültür plaka için Tablo 1' de özetlenmiştir. Dikkatli bir şekilde tüm sıvı hücreleri kaplama önce çıkarın.
- DMSO (dikkat) seyreltilmiş hisse senedi çözeltisi 10 mM SB431542 (SB), hazır olun. Eppendorf tüpleri gibi konik alt polipropilen santrifüj tüpleri 50 µL aliquots yapmak ve onları-20 ° C'de depolayın SB aliquots yalnızca bir kez çözdürülen unutmayın.
2. alma ve depolama yetişkin ve Fetal kalp örneklerin
- 15 mL ile 50 mL tüp içinde saklamak kaldırma ameliyatı sırasında üzerine doğrudan insan yetişkin auricles %10 FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 mg/mL streptomisin 4 ° C'de içeren yüksek glikoz DMEM Örnekler genellikle 3-5 cm boyutunda ve ilâ saklanabilir diseksiyon sonra 48 saat.
- Fetal kalp yalıtım sonra seçmeli kürtaj malzeme 24 s kadar 4 ° C'de EPDC ortamda elde edilen saklayın. Bu iletişim kuralı için 12-22 hafta arasında gebelik yaşı ile örnekleri kullanır. Not tüm kalp epicardium yalıtım için kullanılabilir.
3. yalıtım Epicardial tabakasının
- Laminar akışı kabine PBS ile 100 mm hücre kültürü yemek hazırlamak ve PBS, ayrı bir damlacık (~ 200 µL) kapağı yerleştirin. 15 mL tüp 5 mL Önceden ısıtılmış EPDC orta ile doldurun.
- Doku PBS ile dolu hücre kültürü çanak yerleştirin. Doku işlem sırasında sık sık nemlendirilmiş emin olun.
- Bir stereomicroscope kullanarak, daha fazla doku örneği mümkün olduğunca epicardial katmandan kaldırmak forseps kullanarak kapalı soyulması tarafından.
Not: epicardium bir çok ince, şeffaf tabaka sıkıca kalp (şekil 1A) dışa doğru uydurdugunuz hikayeye bagli olarak kabul edilebilir. Bu yalıtım engel olacaktır beri epicardial yağ dokusu ve kan damarları ile kirlenmesini önlemek deneyin. - PBS damlacığı epicardial doku parçaları kapağını toplamak.
- Bir neşter (şekil 1B) ya da küçük forseps keskin uçları kullanarak epicardial doku (0,5 mm3) küçük parçalara kesilmiş. Parçaları bir P1 geçmek gerekir Not 000 damlalıklı ipucu (Adım 3.6).
- Tripsin 1 mL epicardial doku ekleyin ve parçalar ve tripsin bir P1, 000 damlalıklı ipucu ile toplamak. Doku 1.5 mL konik santrifüj tüpüne (şekil 1 c) aktarın.
- 10 dk, bir 37 ° C su banyosunda tüp ~ 60 rpm'de sallayarak süre kuluçkaya.
- Tüp su banyosundan çıkarın ve % 70 etanol ile tüp dýþýna temizleyin.
- Doku tüp (şekil 1 d) altına lavabo ve dikkatle tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için 5 mL EPDC orta içeren 15 mL tüp epicardial hücreleri içeren süpernatant aktarmak izin.
- Konik santrifüj tüpü 1 mL tripsin ile kalan dokuda doldurmak ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetting karıştırın.
- 3.7-3.10 iki kez tekrarlayın. Son adımda, tripsin kuluçka, 30 dk toplam sonra süpernatant ve kalan epicardial doku EPDC orta içeren tüp içine aktarın.
- Tüm hücreleri EPDC ortamda toplandığında, yavaşça süspansiyon 10 mL şırınga ile 19 G'lik iğneyi mekanik olarak hücreleri (şekil 1E) ayırmak için yeni bir 15 mL tüp geçmek.
Not: yukarı ve aşağı tıkalı iğne önlemek için iğne çözüm geçirmeden önce pipetting tarafından süspansiyon homojenize emin olun. - Daha fazla hücreleri ayırmak için 3,12 21'lik iğne ile adımları yineleyin.
- Üzerine 50 mL tüp 100 µm hücre süzgeç koyun ve tüm kalan kümeleri (şekil 1F) kaldırmak için bir 10 mL pipet kullanarak süzgeç üzerine epicardial hücreleri içeren orta aktarın.
- 5 mL EPDC orta süzgeç üzerine pipetting tarafından kalan hücreleri toplamak için süzgeç yıkayın.
- Damlalıklı hücre süspansiyon 50 mL tüp 15 mL tüp içine. Hücreleri tüp altına lavabo beri çözüm pipetting önce yavaşça salla.
Not: Bu adım gerekli değildir, ancak daha küçük bir tüp Pelet görselleştirme Santrifüjü sonra yardımcı olur. - 200 x g (şekil 1G) oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet (şekil 1 H) EPDC orta (Tablo 1) gerekli hacmi resuspend.
Not: fetal EPDCs için doğrudan EPDC orta ALK5 kinaz inhibitörü (EPDC + SB) 10 µM içeren kullanın. Yetişkin hücreler SB ilk geçiş sırasında kaplama. - Jelatin kaplı kültür plakaları (şekil 1I) hücre süspansiyon plaka. Kuyu boyutunu epicardial doku örneği (Tablo 1) boyutuna bağlıdır. Düşük confluency EMT oluşumunu teşvik unutmayın.
- En az 48 saat 37 ° c, % 5 CO2 hücre kültür plakasına eklemek izin vermek için kuluçka hücreleri yerleştirin.
4. Kültür EPDCs
- EPDC + SB orta en az 3 günde doldurmak.
- Hücreleri en az her 3 gün mikroskop kullanarak kontrol edin. Ne zaman ne zaman kültür plaka tamamen hücrelerle örtülüdür hücreleri confluency, Yani, ulaşmak, bir 1:2 yüzey oranı hücrelerde geçiş. Confluency ulaşan ~ 5-10 gün sürebilir unutmayın.
- Örneğin, bir cam damlalıklı bir damlalıklı veya bir aspirasyon sistemi kullanarak orta Aspire edin.
- Hücreleri dikkatle PBS hücrelere ekleyerek yıkayın. Yavaşça plaka girdap ve PBS Aspire edin.
- Tripsin plaka ekleyin. Tripsin içeren hücrelerin tümünü kapsar ve 1 dk. 37 ° C'de plaka kuluçkaya için plaka Yavaşça döndürün
Not: Kullanmak mümkün olduğunca küçük tripsin olarak (gösterge: 6 kuyu başına 200 µL de plaka) - Mekanik olarak alt plaka hücrelerden ayırmak için plaka dokunun. Mikroskop görsel olarak hücreleri ayırdıktan denetlemek için kullanın. Eğer değilse, hücre kültür plaka ilave bir dakikalığına kuluçkaya.
- EPDC + SB orta gerekli hacmi hücrelere ekleme, yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend ve hücre süspansiyon yeni bir jelatin kaplı kültür tabağa aktarın.
Not: genel olarak, hücre içinde bir Arnavut kaldırımlı Morfoloji geçiş 8 kadar tutulabilir.
5. indüksiyon EMT EPDCs içinde
- EMT ikna etmek için hücreleri tripsin ve yeni jelatin hücrelere kuyu 1:2 yüzey oranında EPDC + SB ortamda 4'te açıklandığı gibi kaplı ve en az 24 h 37 ° c, % 5 CO2için kuluçkaya transfer ayırmak.
- Onay confluency % 50-70 ve EPDCs bir Arnavut kaldırımlı Morfoloji varsa ise.
Not: Confluency EMT geçmesi EPDCs yeteneğini etkiler. - Hücreleri ortamından Aspire edin ve PBS dikkatle hücrelerle yıkayın (bkz. Adım 4.2.1 - 4.2.2).
- 1 ng/mL TGFβ3 EPDC ortamda içeren hücreleri uyarmak ve 37 ° c, % 5 CO2 5 gün için bir kuluçka yer onları. Stimülasyon sırasında doldurulan TGFβ3 içeren EPDC orta sahip olmadığını unutmayın.
- Hücreleri her gün izlemek. 5 gün sonra EMT uygulandı hücreleri bir seklinde Morfoloji tarafından (şekil 2A) kabul edilmektedir.
- Kültür EPDCs SB veya TGFβ eklenmesi EPDC orta olmadan 4 açıklanan yöntemine göre seklinde. Genel olarak, EPDCs seklinde Not geçiş 20 kadar kültürlü.
- İmmünfloresan boyama ile EMT oluşumunu doğrulamak antikorlar Mezenkimal işaretleri αSMA veya Vimentin karşı veya phalloidin tarafından F-aktin stres lifleri (şekil 2B) oluşumu tespit etmek ya da qRT-PCR EMT ilgili genler ( kullanarak Örneğin, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-Cadherin, MMP3, salyangoz, Slug) (şekil 2C ve Tablo 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, EPDCs insan yetişkin ve fetal kalp dokusu (şekil 1) izole etmek için basit bir protokol anahat. Bu iletişim kuralı, kalp (şekil 1A) dışarıdan epicardium kolay erişilebilecek bir konuma yararlanır. Diseksiyon temel subepicardial hücre dışı matriks ve miyokard dokusu bozulmamış (şekil 1J) kalırken WT1 + epicardium kaldırılır gösterir sonra kalp auricle boyama. Geniş karakterizasyonu, EPDCs hızlı epicardial işaretleri, örneğin, diğer kalp yerleşik hücre tipleri, örneğin, PECAM1, ISL1, CD34 ve TNNT2 ALDH1A2, TBX18, KRT8, KRT19 ve eksikliği ifade gösteren daha önce de yapılmıştır. 17
Yetişkin (1 K rakam) ve fetal (şekil 1 L) EPDCs ALK5 kinaz inhibitörü SB431542 gösteri huzurunda bir Arnavut kaldırımlı Morfoloji kültürlü. Ancak, donör ve kültür koşulları doğrultusunda, fetal EPDCs SB varlığı rağmen EMT uygulayabilir. Bu nüfus (bkz. şekil1 L oklar) Arnavut kaldırımlı hücre içindeki hücreleri seklinde neden olabilir. Lütfen Arnavut kaldırımı şeklinde fetal doku hücrelerinden yalıtım her zaman mümkün değildir ve çoğunlukla seklinde hücre türetme neden olabilir unutmayın. Bu hücreler daha hızlı büyümek beri hızla diğer hücre tipleri sarmak.
EMT TGFβ320 ile 5 gün boyunca her iki yetişkin ve fetal hücreleri, kuluçka tarafından hücrelere (şekil 2A) seklinde açık morfolojik bir geçiş tarafından gösterildiği gibi indüklenen. Yetişkin EPDCs sadece TGFβ3 ile stimülasyon üzerine EMT geçirecek iken tedavi edilmezse denetim ("boş") ile gösterildiği gibi fetal EPDCs SB, kaldırılması üzerine spontan EMT geçirecek. EMT doğrulamak için alfa-düz kas aktin (αSMA), Mezenkimal işaretleyici (şekil 2B) ile immunostained EPDCs vardı. Ayrıca, EMT yetişkin EPDCs qRT-PCR gösteren downregülasyon epicardial işaretin WT1 ve upregulation Mezenkimal işaretleri POSTN, αSMA, kolajen 1A1, MMP3 ve N-Cadherin (şekil 2C) kullanılarak doğrulandı. Yetişkin ve fetal epicardial EMT ilgili kapsamlı deneyler17önce yayımlanır.
| Doku | De yazın | Hücre büyüme alanı (cm2) | Orta (mL) hacmi | SB eklenmesi |
| Fetal | 24 | 1.9 | 0,5 | Doğrudan |
| Yetişkin küçük (< 4 cm) | 12 | 3.8 | 1 | 1st geçiş sonra |
| Yetişkin büyük | 6 | 9.6 | 2 | 1st geçiş sonra |
| (> 4 cm) |
Tablo 1: uygun hücre kültür plaka seçmek için kılavuz. Gereken iyi boyut epicardial hücreleri izole miktarına bağlıdır. Bu yönergelere uygun hücre kültür kalıbı seçin için kural olarak kullanılabilir.
| Gen | Sıra |
| WT1 ileri | CAG CTT GAA TGC ATG ACC TG |
| WT1 ters | TAT TCT GTA TTG GGC TCC GC |
| N-Cadherin ileri | CAG ACC GAC CCA AAC AGC AAC |
| N-Cadherin ters | GCA GCA ACA GTA AGG ACA AAC ATC |
| POSTN ileri | GGA GGC AAA CAG CTC AGA GT |
| POSTN ters | GGC TGA GGA AGG TGC TAA AG |
| SMA ileri | MOLDOVA'DA GGA GAA AAT GAC TCA AA |
| SMA ters | GAA GGA ATA GCC ACG CTC AG |
| MMP3 ileri | TGG ATG MOLDOVA'DA KEDİ ATG AAG |
| MMP3 ters | CAG AAA TGG CTG KEDİ CGA |
| COL1A1 ileri | CCA GAA GAA CTG GTA KEDİ CAG CA |
| COL1A1 ters | CGC KEDİ HAREKET CGA AAT GGG AAT |
| GAPDH ileri | AGC CAC ATC GCT CAG ACA C |
| GAPDH ters | GCC CAA TAC GAC CAA ATC C |
| B2a ileri | ACA CTG AAT TCA CCC CCA CT |
| B2a ters | GCT TAC ATG TCT CGA TCC CAC T |
Tablo 2: EMT EPDCs içinde doğrulama için kullanılan astar dizileri. Dizilerinin bulunması qRT-PCR için birkaç EMT ifade yetişkin EPDCs genlerinde ilişkili belirlemek için kullanılan ileriye ve geriye doğru astar.
Resim 1 : Epicardial izolasyonu türetilmiş hücre (EPDCs). (A)Depicted olan bir yetişkin auricle insan kalp ile ince bir dış zar tabaka, kaldırılır epicardium kaldırıldı. Siyah ok için epicardium işaret eder. (B-Ben) EPDCs yalıtım yöntemini görsel temsili. Siyah ok hücre Pelet işaret eder. (J) ve epicardium diseksiyon olmadan bir kalp lobülü immünfloresan boyama. Ölçek çubuğu: 50 µm. (K) temsilcisi resimlerini iki farklı yetişkin EPDC izolasyonların iki farklı fetal EPDC izolasyonların SB. siyah oklarla kültürlü SB. (L) temsilcisi resimleriyle kültürlü gösterir gibi Mezenkimal hücreler fetal EPDC kültür. Ölçek çubuğu: 200 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : EMT insan hücrelerinde yetişkin ve fetal Epicardial elde edilen (EPDCs) doğrulanmasını. Yetişkin ve fetal EPDCs SB, (boş) ile tedavi kültürlü veya TGFβ3 ile 5 gün için uyarılmış. (A)temsilcisi parlak alan resimler. Ölçek çubuğu: 200 µm. (B) Immunostaining DAPI ve αSMA için. Ölçek çubuğu: 100 µm. (C) mRNA seviyeleri yetişkin EPDCs qRT-PCR kullanarak belirlenen gen, EMT ile ilgili. Ölçüm değerleri GAPDH ve B2a ifade için normalleştirilmiş. Değerleri ortalama + SD 2 tasvir ^-ΔΔct (n = 2). Kısaltmalar: WT1:Wilms tümör 1, MMP3: matriks metalloproteinaz 3, POSTN:Periostin, αSMA: Alfa düz kas aktin, Col1A1:Collagen 1A1. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada bir yalıtmak için detaylı Protokolü ve birincil epicardial hücreleri insan yetişkin ve fetal kalp türetilmiş kültür açıklar. Kapsamlı bu hücrelerin karakterizasyonu önceden yayınlanan17oldu. Biz her iki hücre tipleri ALK5 kinaz inhibitörü SB431542 ile kültürlü zaman epitel Arnavut kaldırımlı benzeri hücreler olarak muhafaza edilmesi göstermiştir. EMT geliştirme ve sonrası yaralanma yanıt sırasında epicardial harekete geçirmek içinde vivo ayrılmaz bir parçası olduğunu. EMT bu yöntemi kullanarak buna ek olarak TGFβ tarafından ele. Önemlisi, biz daha önce yetişkin EPDCs sadece EMT stimülasyon17geçmesi. iken SB çıkarıldığı zaman fetal EPDCs hızla spontan EMT geçmesi gözlenen. Fetal EPDCs bu işlemlerde eğitim nasıl en iyi şekilde yetişkin epicardium hasar sonra etkinleştirmek anlamada yardımcı olabilir.
Sunulan yöntem ameliyat sırasında elde edilen hasta malzeme kullanır. Bu nedenle, bir hasta değişkenlik veya malzeme tiyatrodan içinde toplanan hız nedeniyle olan birkaç izole, malzeme durumunu değişimler bekleyebilirsiniz. Bu varyasyon yordamı farklılıkları açıklayabilir: 1) ne kadar kolay epicardium Miyokardiyum disseke, bağlılık 2) izole hücre plaka engellemek veya EMT ve 4) yayılma hızını geçmesi 3) yeteneği. Genel olarak, hızlı bir yalıtım hücre hayatta kalmak için tercih edilir. Ana kritik nokta Miyokardiyum üzerinden epicardium soyma. Epicardium güçlü temel doku yapıştırılır, 15dk ön arıtma tripsin ile kalp dokusunun epicardium daha kolay kaldırmak için yardımcı olabilir. Ayrıca, tripsin tedavi etkinliğinin tripsin etkinlik ve doku oluşumunu da dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır. Bu nedenle, bir düşük verim gözlem yapılırsa tripsin kuluçka zamanla ayarlanabilir. Hiçbir hücre Pelet iplik aşağı sonra görünür durumdaysa, Ayrıca, çözüm tamamen filtreden çalıştırmadan önce ayrışmış değil. Çözüm şırınga geçen veya ekstra bir kullanmadan önce çözüm karıştırma, daha küçük şırınga hücreleri ayırmak için yararlı olabilir. EPDCs tohumlama için iyi boyutunu dikkatle hücreleri epitelyal onların durumunu korumak etkinleştirmek için düşünülmelidir. Tablo 1 bir göstergesi verir ama bir örneğin, fetal kalp sadece küçük bir bölümünü kullanılabilir ve daha küçük iyi kaplama daha uygun olduğunda, bu kılavuz--dan sapma.
Fetal hücreleri EMT hemen SB17geçirecek beri fetal EPDCs her zaman SB ile kaplama. Ancak, Yetişkin EPDCs epitel onların morfolojisi korumak eğilimindedir ve bu nedenle SB sırasında ilk 48 h hücre yapışma tanıtmak için ilk geçiş kaplama. Sonra ilk geçiş, Yetişkin ve fetal EPDCs sürekli olarak spontan EMT önlemek için SB kültürlü. Buna ek olarak, düşük hücre yoğunluğu EMT için önemli bir tetikleyicidir. EPDCs bu nedenle asla % 50 confluency kültürlü. Öte yandan, EMT isterseniz, EPDCs çok yoğun seribaşı olmayan ve % 70 confluency kalmak emin olun. TGFβ3 bu protokolü kullanır rağmen stimülasyon ile TGFβ1 ve -2 EMT EPDCs de (yayınlanmamış gözlemler) içinde tetikleyebilir.
Bu protokol için santrifüj kullanırken daha düşük bir hücre yaşam gözlemlemek bu yana doğrudan aşağı, iplik olmadan hücreler ayrılır. Bu nedenle, düşük hacimli tripsin serum içeren orta eklendiğinde, devre dışı bırakma sağlamak için kullanmak çok önemlidir.
~ 6-8 pasajlar sonra EPDCs bir epitel morfolojisi ile de büyüyen durur veya EMT kendiliğinden geçirecek. Bu nedenle, deneyler için kullandığımız EPDCs Arnavut kaldırımı geçit 6 arasında geçiş 3. Buna ek olarak, EPDCs Mezenkimal görünümdeki daha az savunmasız ve geçiş 20 kadar kültürlü olabilir. Deneylerde, biz ancak, hiç kullanmadım EPDCs sonra 10th geçit iğ.
Epicardium kalp dış yer alır ve temel dokudan ayırmak kolay beri hücreleri orijinalliğini belirgindir ve önemli bulaşma olasılığı düşüktür. Her ne kadar bazen yağ dokusu ya da kan damarları izole epicardial katmana sopa, bu hücreleri çoğunluğu süzgeç sırasında yalıtım geçmek olmaz ve aksi takdirde EPDC hücre kültüründe yaşayamaz. Ayrıca, daha önce belirtildiği gibi insan malzeme kullanarak insan epicardial hücre davranış. araştırmak için benzersiz bir model sağlar Örneğin, epicardial yağ dokusu insan epicardial hücre modelleri21gerekliliğini vurgulayan türler arasında farklı olduğunu, bilinir.
Kalp auricles hastalıklı kalp cerrahisi sırasında elde edilmiştir ve bu nedenle hastalığı, kullanılan ilaç, yaş ve cinsiyet bağış farklılıkları deneyler tekrarlanabilirlik etkileyebilir unutulmamalıdır. Deneyler bu nedenle geçerli sonuçlar elde edilir ve çizilecek sağlam sonuçlara izin birkaç izolasyonların yapılmalıdır. Ayrıca, araştırma soru bağlı olarak bir özel olarak sadece iskemik hastalığı olan hastalarda veya hasta epicardium farklı davranmaya beklenen iskemik olmayan kapak hastalığı ile kullanmak üzere seçebilirsiniz.
Atriyal epicardium ventrikül epicardium2farklı özelliklere sahip, eğer epicardium Atriyal kalp auricle türetilmiş böylece sorgulama epicardial davranış için geçerli bir model sağlar sürülmüştür. Bu bağlamda, fetal arasındaki farklar Atriyal ve Ventriküler EPDCs (yayınlanmamış veri) türetilmiş bulunamadı işaret etmek önemlidir. Ancak, epicardium insan yetişkin ventrikül kullanarak bunu doğrulamak için son hücre kaynağı olurdu. Henüz, büyük insan yetişkin ventrikül EPDC yalıtım için örnekleri toplama son derece hasta için invaziv ve bu nedenle şu anda bu hastanede mümkün değildir.
Biz tekniği SB her zaman EMT, başta olmak üzere fetal EPDCs önlemek için yeterli değil. Fetal EPDCs EMT SB varlığında geçmesi zaman, biz onları deneylerden hariç. Sonuç olarak, deneyler için kullanılan hücre bir epitel fenotip yanıt SB olarak korumak yeteneklerini için seçilir. Fetal hücreler zaten EMT sürecinde belirli bir eşiğin ötesinde olabilir ve bu inhibisyon SB ile bu durdurmak mümkün değil öngörmekteyiz.
Bu epicardial hücre modeli birkaç uygulama, beri gelişmekte olan ve yetişkin epicardium araştırıldı. Bizim laboratuarımızda kardiyak hasar sonra epicardial rejeneratif yanıtının gelişme odaklanmak. Yetişkin EPDCs EMT, epicardium bir ameliorated rejeneratif yanıtı için potansiyel bir tedavi edici ilaç bulmak için amaçlayan teşvik bileşikleri test etmek için kullanılabilir. Buna ek olarak, (re) sinyal parakrin anlamak için EPDCs tarafından salgılanan etkenleri ölçer mümkündür Miyokardiyum oluşturuluyor. Ayrıca, biz fetal EPDCs kendiliğinden yetişkin EPDCs için karşılaştırıldığında EMT geçmesi daha eğilimli gözlenen beri fetal ve yetişkin EPDCs arasındaki farklar araştırıyoruz. Temel mekanizma artan fetal etkinleştirme belirleme geliştirmek yetişkin kalbinde epicardial harekete geçirmek için bir işaret verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu araştırma Hollanda organizasyon bilimsel araştırma (NWO) (VENI 016.146.079) için ve bir LUMC araştırma bursu hem AMS ve LUMC Bontius Stichting (MJG) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
| Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
| Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
| Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
| Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
| Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
| 10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
| Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
| Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet controller | Integra | 155 015 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Waterbath | GFL | 1083 |
References
- Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate. Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).
- Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development. Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).
- Zhou, B., Ma, Q., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).
- Smits, A., Riley, P. Epicardium-Derived Heart Repair. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).
- Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor. Developmental Biology. 250 (1), 198-207 (2002).
- Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).
- Lavine, K. J., Yu, K., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).
- Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).
- Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).
- Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns. Circulation Research. 96 (5), (2005).
- Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).
- van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PloS one. 7 (9), e44692 (2012).
- Zhou, B., Honor, L. B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).
- Smart, N., Bollini, S., et al. De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury. Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).
- Zangi, L., Lui, K. O., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).
- Clunie-O'Connor, C., Smits, A. M., et al. The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).
- Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).
- Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGFβ-signaling and WT1. Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).
- Chechi, K., Richard, D. Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue. International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).
