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Neuroscience

Construcción de un hiperimpulsor mejorado del tetrodo múltiples de grabación Neural a gran escala en comportarse ratas

Published: May 9, 2018 doi: 10.3791/57388
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine

Summary

Presentamos la construcción de un hiperimpulsor 3D imprimibles con dieciocho tetrodos independientemente ajustables. El hiperimpulsor está diseñado para registrar la actividad cerebral en comportarse libremente las ratas durante un período de varias semanas.

Abstract

Monitoreo de los patrones de actividad de una gran población de neuronas durante muchos días en animales despiertos es una técnica valiosa en el campo de la neurociencia de sistemas. Un componente clave de esta técnica consiste en la colocación precisa de múltiples electrodos en regiones cerebrales deseadas y el mantenimiento de su estabilidad. Aquí, describimos un protocolo para la construcción de un hiperimpulsor 3D imprimible, que incluye dieciocho tetrodos independientemente ajustables y está diseñado específicamente para en vivo grabación extracelular neuronal en comportarse libremente las ratas. Los tetrodos a los microdrives o pueden ser avanzados individualmente en varias regiones del cerebro a lo largo de la pista, o pueden utilizarse para colocar una matriz de electrodos en un área más pequeña. Los tetrodos múltiples permiten un examen simultáneo de action potentials de docenas de neuronas individuales, así como potenciales de campo local de las poblaciones de neuronas en el cerebro durante el comportamiento activo. Además, el diseño proporciona 3D más sencillo elaborar software que puede modificarse fácilmente para diferentes necesidades experimentales.

Introduction

En el campo de la neurociencia de sistemas, los científicos estudian los correlatos neurales subyacentes a los procesos cognitivos como la navegación espacial, memoria y toma de decisiones. Para este tipo de estudios, es fundamental para monitorear la actividad de muchas neuronas individuales en comportamiento animal. En las últimas décadas, se hicieron dos importantes avances para satisfacer las necesidades experimentales de grabación extracelular neuronal en animales pequeños1,2,3. Primero fue el desarrollo de la tetrodo, un paquete de cuatro microhilos utilizada para registrar la actividad neuronal de neuronas simultáneamente1,2,4. Las amplitudes de señal diferencial de actividad a través de los cuatro canales de un tetrodo permite el aislamiento de la actividad de neuronas individuales de muchas células simultáneamente registrado5. Además, la naturaleza flexible de los microhilos permite una mayor estabilidad de la tetrodo minimizando el desplazamiento relativo entre el tetrodo y la población celular. Tetrodos ahora son ampliamente utilizados en lugar de un electrodo individual para muchos estudios del cerebro en varias especies, incluyendo roedores1,2,6, primates7y8de insectos. En segundo lugar el desarrollo de un hiperimpulsor llevaba tetrodos independientemente móviles múltiples, que permite el monitoreo simultáneo de la actividad neural de grandes poblaciones de neuronas de grabación de múltiples localizaciones3, 9,10,11,12.

La disponibilidad de un dispositivo de grabación multi-tetrodo fiable y asequible para los pequeños animales es limitada. El hiperimpulsor clásico, desarrollado inicialmente por Bruce McNaughton13, se ha utilizado con éxito para grabaciones neurales en comportarse libremente las ratas en muchos laboratorios en las últimos dos décadas9,10,14, 15. sin embargo, por razones técnicas, los componentes originales necesarios para construir la unidad de McNaughton ahora son muy difíciles de conseguir y no son compatibles con interfaces de adquisición de datos recientemente mejorada. El otro diseño bien aceptado de hiperimpulsor requiere los microdrives para individualmente handcrafted, que podría producir resultados inconsistentes y consumir mucho tiempo12. Para grabar la actividad de los nervios de varias regiones del cerebro en ratas comportarse, hemos desarrollado un nuevo hiperimpulsor stereolithographic tecnología. Intentamos satisfacer los siguientes requisitos: (1) el nuevo hiperimpulsor debe permitir desplazamiento preciso de tetrodos en el cerebro y proporcionar grabación estable de varias regiones de destino; (2) el hiperimpulsor nuevo debe ser compatible con el sistema quickclip magnético desarrollado recientemente para permitir la conexión fácil; y (3) el nuevo hiperimpulsor puede ser reproducido con exactitud con materiales fácilmente disponibles. Presentamos una técnica para construir el hiperimpulsor para imprimir 3D que contiene dieciocho tetrodos independientemente móviles, basados en el diseño de McNaughton. En el protocolo, se describen los detalles del proceso de fabricación del nuevo hiperimpulsor, que hemos utilizado con éxito para registros potenciales de acción de la solo-neurona y los potenciales de campo local de las cortezas entorrinal postrhinal y medial durante semanas en una libre rata de comportarse durante las tareas de forrajeo naturales.

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Protocol

1. estereolitografía de modelos 3D

  1. Utilice técnicas stereolithographic para imprimir el hiperimpulsor piezas y accesorios. Cada hiperimpulsor está compuesta por dieciocho lanzaderas, dieciocho traslados de pernos y cada uno de los otros pedazos de plástico (figura 1).
    Nota: Los accesorios no son parte del hiperimpulsor pero son necesarios para la construcción de un hiperimpulsor.

2. preparación de accesorios (figura 2).

  1. Preparación de la canastilla de microdrive (Figura 2).
    1. Limpiar y ampliar los agujeros más pequeños y los agujeros más grandes de la persiana en la parrilla con una broca de 0,71 mm (0,028") ø y ø mm 0,84 (0.033") broca, respectivamente.
    2. Cortar una varilla de soldadura de 0,89 mm (0.035") de ø 17 mm segmentos largos, alrededor de ambos extremos e inserte cada varilla de guía en la ø mm 0,84 (0.033") los agujeros en la bandeja, dejando 11,5 mm exterior (a ras con las varillas roscadas).
    3. Colocar seis 0-80 roscada, 15,88 mm (5/8") tornillos de cabeza plana larga abajo en las ranuras de la rejilla. Asegúrese de que las barras de guía y varillas roscadas son rectas y paralelas entre sí. Llene el espacio restante en las ranuras con cemento dental diluido. Aire seco en una mesa durante 15 minutos.
    4. Pegar las varillas de soldadura y tornillos en el bastidor con super fina del pegamento y seque al aire durante 15 minutos.
  2. Preparación de la estación base (Figura 2E).
    1. Enrosque los cuatro orificios con una toma de 2-56 y utilice tornillos de nylon largo de 4.76 mm (3/16") 2-56, para garantizar la base en la estación, si es necesario.
  3. Preparación de la herramienta de torneado (Figura 2F).
    1. Hilo de rosca del agujero de la manija con un tap de 4-40. Inserte la punta mecanizada en la ranura en la manija y asegure con un tornillo de Copa larga 4-40, 4,76 mm (3/16").
  4. Preparación del soporte del hiperimpulsor (Figura 2).
    1. El orificio del tornillo del hilo de rosca con un tap de 8-32. Use un tornillo de 9.52 mm (3/8") largo nylon 8-32, para asegurar el hiperimpulsor cuando esté en uso.
  5. Preparación de la barra de posicionamiento complejo (Figura 2 H).
    1. Del hilo de rosca el tallo desde el lado con el agujero más grande (arriba) con un grifo de 8-32 a una profundidad de unos 7 mm. hilo de rosca de los agujeros más pequeños (seis en la parte superior, 18 en la parte inferior) con un toque de 0-80. Ampliar el agujero central en la parte superior con una broca de ø 4,76 mm (3/16"), si es necesario.
    2. Monte el vástago en la parte superior, con un ø de 8-32, 4,76 mm (3/16"), 6,35 mm (1/4") largo tornillo de hombro. Fije la parte inferior a la cima con 0-80, 6,35 mm (1/4") tornillos largos cuando esté en uso.

3. preparación de los componentes de hiperimpulsor (figura 3).

  1. Preparación de la tuerca de hiperimpulsor (Figura 3A).
    1. Usando el soporte de la tuerca (Figura 2D), enrosque la tuerca con una llave de 3/8-24 tocando fondo hasta que quede suave.
  2. Montaje de la base de hiperimpulsor (Figura 3B).
    1. Limpiar y ampliar los agujeros en la base utilizando brocas diferentes tamaños (doce tierra alambre aberturas (anillo interno): ø 0,61 mm (0,024"), los dieciocho tetrodo agujeros (medio aro): ø 0,66 mm (0.026") primero y luego ø 0,71 mm (0.028 "); el 18 Guía de varilla agujeros ciegos (anillo externo): ø 0,84 mm (0,033")).
    2. Enrosque los dos agujeros en la parte superior del núcleo y los restantes ocho ciegos hoyos (cuatro en el lado, cuatro en la parte inferior) con un toque de 0-80. Usar un grifo de tocando fondo de los agujeros ciegos.
    3. Crear hilos de rosca externos en la base de la base utilizando un dado de 3/8-24. Ajustar correctamente el dado para la tuerca de hiperimpulsor sobre la rosca nueva.
    4. Dependiendo de la cantidad de tierra cables desea insertar varios segmentos largos de 6 mm de tubería metálica de calibre 23 (cánulas) en los agujeros del alambre de tierra en la base, les pega si es necesario. Presentar los extremos de las cánulas de alambre de tierra hasta que esté al ras con la parte exterior del núcleo y limpiar las cánulas con un alambre de acero 0,30 mm (0,012") de ø.
    5. Colocar 18 0-80, 15,88 mm (5/8") cabeza de tornillos de cabeza plana larga hacia abajo en las ranuras en la base. No doble los tornillos ni dañar las roscas durante este proceso.
    6. Usando la varilla de complejo y la estación base de posicionamiento, posición 18 segmentos de 17 mm de ø de 0,89 mm (0.035") barra de soldadura sobre los agujeros de la varilla de guía en la base y les martillo abajo a nivelarse con los tornillos (unos 5 mm).
    7. Corregir las posiciones de las barras de soldadura y tornillos si es necesario, apriete el tornillo de hombro central y los alrededores seis tornillos en la barra de posicionamiento complejo para garantizar las direcciones hacia el exterior de las varillas en la base. Atornille la tuerca sobre el núcleo (con la barra de posicionamiento complejo) y montar la base en el soporte de hiperimpulsor para permitir la fácil colocación bajo un estereoscopio.
    8. Rellenar las ranuras con cemento dental diluido para asegurar los tornillos a la base y permiten que el aire de secado 15 minutos rellenar las ranuras 2-3 en un momento antes el cemento dental es demasiado gruesa. Raspe cualquier exceso de cemento dental en la base para mantener un ajuste correcto con el escudo.
    9. Pegar los tornillos y las barras en la base con pegamento super delgado, permiten que el aire de secado de 15 minutos.
  3. Asamblea de lo microdrive (Figura 3).
    1. Limpiar y ampliar los dos orificios exteriores en la lanzadera con los pedacitos de taladro (orificio más pequeño: ø taladro de 0,61 mm (0,024") poco; un agujero más grande: ø 0,89 mm (0,035") broca).
    2. Inserte el tornillo de la lanzadera en el soporte del perno base. Preste atención a la orientación. Cierre la tapa del soporte de perno, sujete firmemente y pase lentamente a través del agujero en la tapa con llave 0-80. Pulse 2 - 3 veces hasta que quede suave.
    3. Inserte el tornillo de transporte en el traslado desde el lado con la abertura más pequeña. Coloque la lanzadera perno complejo boca abajo en la base de la estación de Asamblea de microdrive.
    4. Cortar un segmento de 15 mm de calibre 23 metal tubo liso ambos extremos y coloque el tubo sobre el orificio de 0,61 mm (0,024") ø, guiado por la ranura en la tapa de la estación. Martillo de la cánula en el orificio hasta el extremo superior quede a ras con la tapa de la estación.
    5. Retire la mitad externa de la extremidad superior de la cánula con una rueda de lijar. Limpiar la cánula con un alambre de metal ø 0,30 mm (0,012"). Pegue la cánula en la lanzadera usando el pegamento super delgado, asegurándose de no pegar el perno de transporte para el traslado y el aire seco durante 15 minutos.
    6. Preparar por lo menos dieciocho microdrives, prueba el microdrive en el estante de microdrive. Asegúrese que el perno de transporte puede girar sin problemas en el transporte y que el microdrive toda se mueve libremente a lo largo de la longitud de la varilla roscada.
  4. Preparación de la columna central (Figura 3D).
    1. Lijar la parte superior e inferior de la columna central hasta plana, si es necesario. Los dos agujeros en la columna central del hilo de rosca con llave 0-80. Inserte una tuerca hexagonal 0-80 (3,18 mm (1/8 pulg) de ancho, 1,19 mm (3/64 ") alto) en cada ranura.
  5. Preparación de la tapa del hiperimpulsor (Figura 3E).
    1. Con unas pinzas no magneticas, pegar cuatro imanes (3 mm de diámetro, 1 mm de espesor) en cuatro pozos, emparejando a los polos N y S en el tablero de la interfaz de electrodo.
  6. Montaje de las cánulas guía en un paquete (Figura 3F).
    1. Lugar 18 30 calibrador, cánulas de pared delgada (ID) 0,19 mm, 0,0075" en ø 2,29 mm (0.09") tubos de termocontracción (3-5 mm de largo, espaciados a lo largo del paquete por 5-10 mm). Hacer todas las cánulas ras uno con el otro en un extremo del paquete.
    2. Encogimiento de los tubos de termocontracción usando una pistola de calor hasta que el paquete quede ajustado. Apriete el paquete suavemente a la forma deseada (ovalado o redondo). Confirme que todas las cánulas en las posiciones correctas con no torcer, travesía, o flexión.
    3. Marcar las áreas para soldar en las cánulas. La parte unsoldered debería ser 26 mm de longitud, mientras que la parte soldada debe ser 5-10 mm. mover la reducción tubos a las marcas de soldaduras para prevenir la propagación.
    4. Flujo se aplica a un área de soldado y la soldadura mientras gira el paquete. Enfriar a temperatura ambiente durante al menos 1 min repetir este paso para la soldadura de la misma área dos veces más. Lisa la parte soldadas por soldadura sin aplicar material fundente y relleno. Enfriar a temperatura ambiente durante al menos 1 minuto.
    5. Corte el paquete a la longitud adecuada con un disco de diamante a la máxima velocidad, Polaco ambos extremos para ajustar la longitud (unsoldered parte: 26 mm, soldado parte: 5-10 mm como se desee). Limpiar las cánulas de guía con un alambre metálico de ø 0,18 mm (0,007") bajo un estereoscopio.
  7. Preparar los tetrodos. Procedimientos similares se han descrito8,16,17 .
    1. Ajuste la altura de la barra horizontal de la T y la posición del agitador magnético, para que el brazo horizontal en la Cruz de la barra de la T está directamente sobre el centro del agitador magnético. Gancho de uno de los extremos de un gancho en S en el centro de una barra de agitación magnética pequeña, luego pegarlos juntos. Limpie el tetrodo haciendo espacio con aire comprimido y toallitas de etanol.
    2. Extremos del círculo los dos de un pedazo de tetrodo solo alrededor de 40 cm de longitud del alambre juntos, después asegúrela con un pedazo de cinta de cobre.
    3. Agarre el círculo de alambre por la cinta de cobre. Coloque el extremo opuesto de la cinta en el brazo horizontal de la barra de la T de cobre. Bajar la cinta de cobre suavemente (mientras el otro está todavía en la barra de la T), torcer una vez y colocar la cinta de cobre en la barra de T. El círculo de tetrodo es ahora en una configuración de ocho ("∞") con la cinta de cobre sentado en la cima de la Cruz de la barra horizontal.
    4. Mantenga la cinta de cobre en la barra de T con una mano suavemente. Con la otra mano, enganchar el extremo libre del gancho S (con una agitación magnética conectada al otro extremo) a través de la parte inferior del círculo de alambre tetrodo, soltar el gancho en S suavemente y dejarla enderezar los cuatro cables por el peso del gancho S.
    5. Ajuste la altura de la barra horizontal hasta la parte inferior del gancho en S es aproximadamente 1 cm encima del centro de la placa del agitador magnético.
    6. Doblar el borde de la cinta de cobre hacia abajo para fijarla a la barra horizontal. Examinar los cuatro cables del tetrodo recto por el ojo y quite cualquier escombro.
    7. Encender el agitador girando los cuatro cables a una velocidad de alrededor de 60 rpm, hasta que el ángulo entre los dos hilos sin torsión opuestos es aproximadamente de 60°.
    8. La pistola de calor a 210 ° C y calentar los alambres torcidos por barrer la pistola a lo largo de la recta longitud de los cables desde diferentes ángulos por 2 min a fusionar por la fusión de la capa de enlace VG.
    9. Levante el gancho en S con revolver suavemente y corte el extremo inferior de la tetrodo con unas tijeras finas.
    10. Mantenga la cinta de cobre en la barra horizontal con el dedo, cortar los cables de ambos bordes de la cinta de cobre con una tijera y retire la cinta de cobre. Corte el cable restante en la barra horizontal para liberar la tetrodo.
    11. Lugar el tetrodo terminado en una caja libre de polvo para el almacenamiento. Preparar por lo menos veinticinco tetrodos.

4. montaje del hiperimpulsor (figura 4).

  1. Inserción de las cánulas guía en la base de hiperimpulsor (Figura 4A).
    1. Retirar los tubos de termocontracción y deslice un segmento de 4 mm de tubo de silicon (ID 1,02 mm (0,04"), OD 2.16 mm (0.085")) a lo largo del haz a la frontera de soldado/unsoldered. La ranura de la cuña en el espaciador de hiperimpulsor para ensanchar el agujero central, permitiendo que al espaciador se deslice por el tubo de silicona. Quitar la cuña cuando el separador se encuentra en el centro del tubo de silicona.
    2. Organizar las posiciones de las cánulas de guía en el paquete colocando segmentos larga (10 cm) del cable metálico ø 0,18 mm (0,007") a través de cada cánula en un agujero de tetrodo específicos en el núcleo de hiperimpulsor, evitar cualquier cruce de los cables o las cánulas en el proceso. Doblar los extremos de los cables para mantenerlos en su lugar.
    3. Empuje las cánulas a través de sus respectivos agujeros en el núcleo, teniendo cuidado de no doblar o cruzar entre ellos, hasta que el extremo libre de cada cánula de 2 mm como mínimo fuera de la parte superior del agujero del tetrodo. Fije al separador atornillando la tuerca en la base, teniendo cuidado de evitar que al espaciador gire. Aplique una gota de cemento dental muy diluida de la parte superior de la base en el cruce de las cánulas para asegurar sus posiciones relativas.
    4. Cortar a la guía de cables desde el extremo soldado del paquete y quitarlos de las cánulas por contracción del extremo libre.
  2. Montaje de los microdrives en el hiperimpulsor núcleo (Figura 4B). Un arreglo espacial detallado de los microdrives en el hiperimpulsor ha sido previamente descrito11,13.
    1. Cargar los microdrives lentamente y con cuidado en cada varilla roscada de la base. Confirman que (1) los 23 manómetro microdrive cánula va en el agujero del tetrodo suavemente, (2) los 30 calibre cánula guía entra en la 23 calibre microdrive cánula suavemente, y (3) el tornillo de transporte se vuelve suavemente a lo largo de la varilla roscada. Atornille los microdrives hasta 1.0-1.5 mm por encima del extremo inferior de las varillas roscadas.
    2. Cortar 18 pedazos de tubería de polyimide (ID 0,11 mm (0,0045"), OD 0,14 mm (0.0055")) en segmentos de 38-43 mm (longitud del paquete de cánula guía plus 7 mm). Limpie cada tubo con un alambre de acero de 0,08 mm (0.003") de ø.
    3. Invertir la base, inserte los tubos de poliamida cuidadosamente las cánulas guía del extremo soldada y empuje a todos el camino en bajo un estereoscopio. Hacia el núcleo vertical y pegar el extremo superior del tubo de poliamida en la cánula de microdrive con pegamento espeso. Coloque la base boca abajo y deje que el pegamento seque durante 15 minutos.
    4. Corte el polyimide extra en el extremo superior de la tubería, dejando 0.5-1.0 mm fuera de la cánula de microdrive.
  3. Montaje de los cables de tierra (Figura 4).
    1. Reducir el número de cables a tierra necesarios para longitudes de 25-30 mm de alambre de acero recubierto (recubierto ø 0,20 mm (0,008"), ø desnudo 0.13 mm (0.005")). El aislamiento plástico de ambas puntas de los cables de 2 mm de la tira e inserte un extremo de cada uno en los extremos de las cánulas de calibre largo 30 mm 6-8. Aplanar los extremos de las cánulas para garantizar la conexión con sus respectivos cables.
    2. Utilice una herramienta Dremel para cortar las cánulas por la mitad para crear dos hilos de planta completa de cada uno.
    3. Introduzca el extremo redondeado de la cánula del 30 calibre en el extremo superior de la cánula de alambre de tierra en la base y presione firmemente para la inserción.
  4. Montaje de la placa de interfaz de electrodo (Figura 4).
    1. Insertar la columna central en la base y sujétela con dos 0-80, tornillos Allen largo 7,94 mm (5/16"). Pegamento si es necesario hacer constante en la base de la columna central.
    2. Ampliar las porciones de las ranuras en la placa BEI-72-control de calidad-grandes que corresponden a los dos agujeros roscados en la columna central con un toque de 1,2 mm de ø. Fijar la placa de interfaz de electrodo en la columna central con dos 0-80, 3,97 mm (5/32") largo tornillos de cabeza. Asegúrese de que la Junta está situada en el centro y es segura.
  5. Conectar los cables de tierra (Figura 4E).
    1. Cada cable de tierra alrededor de la columna central y conecte el extremo libre expuesto a la tarjeta de interfaz de electrodo con un alfiler de oro en el hoyo de tierra designado.
  6. Cargando los tetrodos en el hiperimpulsor, anteriormente descrita 16 , 17 .
    1. Cargar cada tetrodo cuidadosamente en los tubos del polyimide de microdrives, teniendo cuidado de no doblar durante el proceso.
    2. Suavemente alimente los cables de extremo libre en sus agujeros designados en la interfaz electrodo tablón y conectan eléctricamente usando pernos de oro.
    3. Corte los tetrodos individualmente a la longitud correcta. Confirmar que la porción de tetrodos que sobresalen de los extremos inferiores de los tubos de poliamida después de cortar es recta, de lo contrario reemplazar el tetrodo todo y coinciden.
  7. Colocar el escudo.
    1. Colocar la pantalla a la base usando cuatro 0-80, 3,97 mm (5/32") tornillos de cabeza troncocónica. Los números en la pantalla deben coincidir con los números en el tablero del interfaz del electrodo.
  8. Los consejos de tetrodo de la galjanoplastia.
    1. La placa de las puntas de los tetrodos uso NanoZ chapado equipado con un conector de ADPT-NZ-BEI-36 y un adaptador de ADPT-EIB-72-QC-HS-3617. Por otra parte, la placa ellos manualmente uno por uno como se describe en otra parte16. Placa el tetrodo Consejos antes de su uso (por ejemplo, un día antes de la implantación), como impedancia aumentará gradualmente con el tiempo después de la galjanoplastia. Reemplazar los tetrodos en cortocircuito o obstruido durante el proceso de la galjanoplastia, cortarlas a una longitud adecuada y volver a la placa.
  9. Finalizando el hiperimpulsor (Figura 4F).
    1. Pegue los tetrodos a sus tubos de poliamida como se describió anteriormente16. Retraerse todos ellos hacia sus cánulas guía por lo que no se exponen las puntas plateadas.
    2. Atornille cuatro 0-80, 6,35 mm (1/4") largo tornillos de cabeza en los cuatro orificios en la parte inferior de la base de un hiperimpulsor.
    3. Uso de un estereoscopio, baje cada tetrodo lentamente hasta que la punta del tetrodo es apenas por encima del borde de la cánula de la guía. Mientras tanto, ubicar la posición de cada tetrodo en el paquete de cánula guía. El mapa de posición de tetrodo es fundamental para la reconstrucción de sitios de grabación.
    4. Instale la tapa para el disco y guardar el hiperimpulsor correctamente para la implantación.

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Representative Results

Utilizamos un hiperimpulsor recién construido para obtener resultados de los ensayos. La unidad fue equipada con tetrodos de ø 17 μm (0,0007"), alambre recubierto de poliamida Platino-Iridio (90% - 10%). Las puntas de los tetrodos fueron plateadas en la solución de negro de platino para reducir la impedancia del electrodo a entre 100 y 200 kΩ a 1 kHz. El hiperimpulsor fue implantado 4,6 mm a la izquierda de la línea media y 0,5 mm anterior al sino transversal sobre el cráneo de un 550 g, hombre rata Long-Evans. Los cables de tierra adicionales fueron conectados con los tornillos de calavera sobre el cerebelo. Todos los procedimientos fueron realizados según lo aprobado por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Baylor College of Medicine y fueron similares a los previamente descritos18. Inmediatamente después de la implantación quirúrgica, los tetrodos fueron avanzados 1 mm en el cerebro. En los días posteriores, se utilizaron más avanzadas incrementos de no más de 80 μm. Los tetrodos podían estabilizar después de cada avance para al menos 20 horas antes de que se realizaron grabaciones de nervios.

Para grabar la actividad de los nervios, el hiperimpulsor fue conectado a un pre-amplificador headstage (Neuralynx, HS-72-QC), y el último fue conectado a un sistema de adquisición de datos con los amplificadores programables (Neuralynx, Digital SX lince). Potenciales de campo local se hace referencia al cable de tierra, muestreado en 2 kHz, y band-pass filtrada a 0.1-500 Hz. actividad de la unidad estaba referenciado a un tetrodo con ninguna actividad observable situado 500 μm de la superficie del cerebro, muestreadas a 32 kHz y la banda-pass filtrada a 600 Hz - 6 kHz. Se registraron sólo spike formas de onda por encima de un umbral de 50 μV.

Figura 5A muestra la actividad de los nervios de un tetrodo situado en la corteza postrhinal (2,1 mm por debajo de la superficie del cerebro), mientras que el animal se alimentan libremente dentro de 1,5 m abrir cuadro de tres semanas después de la implantación. La sesión de grabación duró aproximadamente 30 minutos y las unidades registradas se mantuvieron estables a través de toda la sesión (demostrada por la pequeña variación en formas de onda de pico). La figura 5B muestra potenciales de campo local registran simultáneamente desde cuatro diferentes tetrodos situados en la corteza del entorhinal medial (3.4-3.7 mm de profundidad) mientras que el mismo animal fue explorando activamente la arena abierta siete semanas después de la implantación. La actividad de potencial de campo claro en la gama de frecuencias theta (6-10 Hz) estaba presente. Datos de punto de la neurona individual fueron aislados utilizando el software de clasificación MClust (A.D. rojizo), y datos potenciales de campo local fue visualizados por encargo escrito secuencias de comandos de Matlab. Ejemplos de grabaciones de tetrodo de baja calidad, posiblemente resultantes de una unidad mal preparada, se han demostrado previamente17.

Figure 1
Figura 1: componentes de hiperimpulsor creados por tecnología de stereolithographic. Imagen de los componentes de hiperimpulsor 3D imprimibles (¢ 1 moneda para la comparación de tamaño). (A) la base de hiperimpulsor; (B) el escudo protector; (C) la tapa protectora; (D) la columna central; (E) la tuerca; (F) el espaciador; (G) el servicio de transporte; (H) el tornillo de transporte. Barra de escala: 1 cm. Estos componentes fueron creados por una impresora UnionTech RSPro450 utilizando el material plástico Somos evolucionar 128. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: accesorios diseñados para la construcción de un hiperimpulsor. Estos accesorios fueron diseñados específicamente para ayudar en la preparación del hiperimpulsor. Sus principales componentes fueron creados por la impresión de stereolithographic. (A) el titular de perno de transporte, que asegura el perno de transporte durante el roscado. Estación de (B) la Asamblea de microdrive, que guía la inserción de la cánula en la lanzadera. Estante (C) el microdrive, que ayuda a probar los microdrives montado y sostiene en su lugar mientras pegando las cánulas. 1: una base de rejilla de microdrive; 2: un soporte de microdrive con tornillos totalmente insertadas en las ranuras; 3: un microdrive rack listo para usar. (D) el titular de la tuerca, la tuerca de hiperimpulsor que al roscar el agujero. Estación de (E) la base de un hiperimpulsor, que asegura la base durante el martilleo las barras guía. (F) la herramienta de torneado, que conduce el perno de transporte para girar en la lanzadera. (G) el titular del hiperimpulsor, que ayuda a colocar el hiperimpulsor bajo un estereoscopio. El titular también protege los tetrodos después de que han sido cargados en el hiperimpulsor. (H) la barra de posicionamiento complejo, que ayuda a colocar las varillas roscadas y guía de varillas en la base de un hiperimpulsor. 1: principales componentes del complejo; 2: la parte superior del complejo después de la Asamblea; 3: una barra de posicionamiento complejo en uso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: preparación del hiperimpulsor piezas antes del montaje. Imágenes que muestran el proceso de preparación de la base de un hiperimpulsor y el microdrive, así como otros preparan hiperimpulsor piezas. (A) A rosca tuerca de hiperimpulsor. (B) preparación de la base de un hiperimpulsor. 1: el núcleo con hilos de rosca externos para la tuerca; 2: el núcleo colocado en una estación de base con tornillos totalmente insertados en las ranuras; 3: Guía de barras colocadas por la barra de posicionamiento complejo, listo para ser martillado en la base; 4: el espacio restante en las ranuras de llenado con cemento dental diluido; 5: la parte superior de un núcleo de hiperimpulsor preparado. (C) preparación del microdrive. 1: un tornillo de transporte colocado en una lanzadera perno soporte base, nota la menor apertura es hacia el experimentador; 2: enhebrado los hilos dentro del mismo transporte; 3: inserción de la lanzadera de perno en la lanzadera; 4: un microdrive colocado en la estación del montaje de microdrive base con la cánula guiada por la tapa de la estación, lista para ser insertado; 5: un microdrive con el exterior la mitad de la punta de la cánula superior quitada (indicado por flecha); 6: montado microdrives probado en la parrilla de microdrive. (D) una columna central con los orificios roscados y las tuercas de rosca. (E) A tapa de hiperimpulsor con cuatro imanes pegados en los pozos. Paquete de cánula guía (F) A 36 mm de largo, con la parte soldada a la izquierda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: montaje del hiperimpulsor. Imágenes que muestran las etapas de la Asamblea de hiperimpulsor. (A) inserción de las cánulas de guía en la base. 1: el paquete de cánula guía se deslizó en el tubo de silicona y el espaciador; 2: cánula una guía en su orificio señalado en la base. Escritura de la mano muestra la organización de la guía de cánulas; 3: Guía de cánulas en la base; 4: el núcleo con las cánulas guía insertada y asegurada por la tuerca. (B) montaje de los microdrives al núcleo. 1: el núcleo con microdrives cargado; 2: los microdrives con tubos de poliamida en las cánulas. (C) inserción de los cables de tierra en la base. (D) fijación de la placa de interfaz de electrodo. 1: el hiperimpulsor con la columna central que se inserta; 2: el hiperimpulsor con el tablero del interfaz del electrodo conectado a la columna central. (E) conexión del cable de conexión para el orificio señalado en la tarjeta de interfaz de electrodo. (F) A finalizado hiperimpulsor preparado para la implantación (peso total de 20 g). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: señales neuronales registran por el hiperimpulsor. Grabaciones representativas mostrando actividad neuronal de la unidad y campo local potencial en cerebro de rata de un comportamiento. Cluster dos dimensiones (A) diagramas de picos individuales que ilustra de neuronas al mismo tiempo registradas por un tetrodo situado en la corteza postrhinal (profundidad: 2,1 mm). Izquierda: Diagrama de dispersión que muestra la relación entre las amplitudes pico a pico de espigas grabadas de dos electrodos de la tetrodo. Cada punto corresponde a un punto. Racimos de espigas están probables que proceden de la misma célula. Cuatro grupos están codificadas por colores. Barra de escala: 20 μV. Derecha: espiga onda (medio ± S.D.) de las células codificadas por colores que aparecen a la izquierda. Tenga en cuenta la pequeña variación de las formas de onda. Barra de escala: 200 μs. (B) rastros de potencial en el rango de frecuencias theta local campo grabado simultáneamente desde cuatro diferentes tetrodos situados en la corteza del entorhinal medial (profundidad: 3.4-3.7 mm) cuando la rata se alimentan libremente. Barra de escala en la parte inferior izquierda: 500 μV; barra de escala en la parte inferior derecha: la Sra. 100 haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivos complementarios: Los archivos suplementarios incluyen 20 ficheros en formato .stl detallando los componentes de hiperimpulsor y accesorios listo para stereolithographic impresión (unidades en mm) y 1 archivo en formato .pdf que es el plan de acción de la herramienta de torneado punta listo para trabajar a máquina. Los archivos originales del modelo 3D fueron creados con el software de AutoCAD en formato DWG, que estará disponible a petición. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Aquí, describimos el proceso de construcción de un hiperimpulsor desarrollado recientemente conformado por dieciocho tetrodos independientemente móviles. La unidad puede ser construida de piezas asequibles compradas en muchas tiendas de hardware disponibles, combinados con componentes creados por stereolithographic impresión. El hiperimpulsor puede ser crónicamente implantado en el cráneo de una rata utilizando procedimientos quirúrgicos estándar y es capaz de grabar actividad neuronal extracelular mientras que el animal realiza diversas tareas conductuales.

El hiperimpulsor conserva muchas de las características deseables del hiperimpulsor McNaughton original, incluyendo los microdrives de trípode que se orientan hacia el exterior de 30 grados de la unidad centro13, que proporciona soporte para los tetrodos. Una vez implantado, el hiperimpulsor permite la ejecución de movimientos finos de los tetrodos dentro del cerebro de un animal despierto con considerable precisión. Una vuelta completa de un transbordador en la varilla roscada corresponde a un desplazamiento lineal de 317.5 μm. Con una formación adecuada, un experimentador puede promover un servicio de traslado en pasos de 1/16 vuelta (20 μm). Hemos diseñado el hiperimpulsor para uso en ratas adultas, pero la unidad puede utilizarse fácilmente en cualquier animal con un tamaño de cuerpo de 350 g o más (limitado por el tamaño de la cabeza). Una limitación del dispositivo puede notarse en la limitada profundidad de grabación, como el recorrido máximo de los tetrodos a lo largo de las varillas roscadas es de unos 7 mm, que podría caer por debajo de estructuras más profundas en el cerebro de algunos animales.

Impresión de stereolithographic ofrece suficiente resolución crear componentes de plástico en gran detalle con una alta fidelidad y se ha utilizado previamente en hiperimpulsor fabricación12,19,20. En este caso, se utilizó una impresora industrial comúnmente disponible a través de terceros las instalaciones de producción. Allí todos los componentes de hiperimpulsor imprimieron precisamente, incluyendo el núcleo de hiperimpulsor, a pesar de su compleja geometría y pequeñas estructuras como ø 0,6 mm a través de los agujeros y las paredes delgadas de 0,3 mm. Esta precisión hace estereolitografía una opción ideal para la fabricación de componentes de un hiperimpulsor. Basado en experiencia previa, menos costosas impresoras 3D de escritorio no suelen tener la precisión necesaria para la reproducción fiable de los componentes de hiperimpulsor necesarios. Aún así, stereolithographic tecnología tiene sus limitaciones. En primer lugar, tiene una selección limitada de materiales. El plástico que nos eligió para el hiperimpulsor fue el más duradero de los que hemos probado, pero es aún no óptima para la fabricación de piezas muy pequeñas. Las lanzaderas y los pernos de transporte deben manipularse con precaución ya que pueden romperse durante la preparación. Los componentes de plástico no son esterilizables en autoclave, como la temperatura de desviación del material de alrededor de 50 ° C. Además, el material de impresión utilizado no es resistente a la acetona. Estas cuestiones pueden resolverse cuando nuevos materiales de estereolitografía son desarrollados y probados. Sin embargo, considerando el relativamente bajo costo de la estereolitografía, las ventajas de la técnica y el costo superan con creces los defectos. En segundo lugar, debido a la naturaleza de la estereolitografía, durante el cual fotopolímeros fotoquímico se solidifican por un láser UV para formar una sola capa del modelo 3D21, los objetos creados por la impresión de stereolithographic son vulnerables a los rayos UV. Por lo tanto, expone a fuerte ultravioleta (por ejemplo, la luz solar directa) durante muchas horas irreversible reducirá su fuerza física (basada en comunicación personal con el servicio de impresión). Teniendo en cuenta la UV ambiental en el espacio de laboratorio (por ejemplo, de las luces fluorescentes), es mejor almacenar los componentes stereolithographic en una caja oscura cuando no esté en uso, que conservará la fuerza física de componentes por años. Por otra parte, es importante usar otros métodos aparte de luz UV para desinfectar la superficie de hiperimpulsor antes de la cirugía. Esta prueba de hiperimpulsor ha permanecido implantado en la rata en buenas condiciones en un entorno de laboratorio ordinarios a lo largo de cuatro meses, sin ninguna indicación de una reducción en la fuerza física o de rendimiento.

La naturaleza para imprimir 3D de este hiperimpulsor también permite modificaciones rápidas y flexible rediseño. Por ejemplo, el hiperimpulsor puede modificarse fácilmente para destino separados de regiones cerebrales múltiples11. Por otra parte, esta unidad se podía ajustar para permitir la supervisión simultánea de actividad neural y manipulación del cerebro local. Incorporación de una sonda de microdiálisis con la matriz de tetrodos permite farmacológica activación y desactivación de neuronas por la infusión de varias drogas durante grabación neural22. Además, neuronas dirigidas a expresar sensible a la luz los canales pueden ser activadas o desactivadas por la incorporación de una fibra óptica en el tetrodo paquete y optogenetic técnica19. Además, la unidad puede ser fácilmente escalarlos disminuir con menor número de tetrodos para animales con tamaños más pequeños de la cabeza, como ratones o ratas juveniles.

En Resumen, la mutabilidad fácil junto con el método más simple, más asequible de la construcción de un implante de registro neuronal efectivo que puedan reproducirse de forma fiable y precisa, hace este hiperimpulsor una poderosa herramienta en el campo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos al laboratorio de Moser en el Instituto Kavli centro de Neurociencia de sistemas y computación neuronal, Universidad Noruega de ciencia y tecnología, para la crónica neuronal grabación procedimientos en ratas. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH NS098146 R21 y humano frontera ciencia programa a largo plazo becas LT000211/2016-L a L. Lu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Welding rod Blue Demon ER308L-035-01T Stainless steel, 0.035" in diameter
Screw McMaster 91771A060 Stainless steel, flat head, 0-80 thread, 5/8" in length
Screw McMaster 91772A051 Stainless steel, pan head, 0-80 thread, 5/32" in length
Screw McMaster 92196A056 Stainless steel, socket head, 0-80 thread, 5/16" in length
Screw McMaster 92196A055 Stainless steel, socket head, 0-80 thread, 1/4" in length
Screw McMaster 95868A131 Nylon,  socket head, 2-56 thread, 3/16" in length, black
Screw nut McMaster 90730A001 Stainless steel, narrow hex,  0-80 thread
Shoulder screw McMaster 90298A213 Stainless steel, 8-32 thread, 3/16" in diameter, 1/4" in length
Cup screw McMaster 92313A105 Stainless steel, 4-40 thread, 3/16" in length
Thumb screw McMaster 94323A592 Nylon, 8-32 thread, 3/8" in length, black
Magnet Apex M3X1MMDI Neodymium, 3 mm X 1 mm disc
Metal tubing Small Parts B00137QHNS Stainless steel, 23 gauge, 0.0253" OD, 0.013" ID, 0.006" wall
Metal tubing New England Small Tube Custom-made Stainless steel, 30 gauge, 0.012/0.0125" OD, 0.007/0.008" ID, full hard
Heat-shrink tubing McMaster 7856K72 0.09" ID before shrinking, blue
Silicone tubing A-M Systems 807300 0.040" ID, 0.085" OD
Polyimide tubing A-M Systems 823400 0.0045" ID, 0.0005" wall
Ground wire A-M Systems 791500 0.005" bare, 0.008" coated, half hard
Tetrode wire California Fine Wire Custom-made 0.0007" in diameter, platinum-iridium (90%-10%), HML and VG coating
EIB Neuralynx EIB-72-QC-Large
Gold pins Neuralynx large EIB pins
Tap Balax 01302-000 M1.2 thread size
Tap McMaster 2522A811 0-80 thread size, bottoming
Tap McMaster 2522A771 0-80 thread size, plug
Tap McMaster 26955A94 3/8"-24 thread size, bottoming
Tap McMaster 2522A713 2-56 thread size
Tap McMaster 2522A715 4-40 thread size
Tap McMaster 2522A718 8-32 thread size
Die McMaster 2576A457 3/8"-24 thread size, 1" OD
Drill bit McMaster 30585A82 Wire gauge 65, 0.035" in diameter
Drill bit McMaster 30585A83 Wire gauge 66, 0.033" in diameter
Drill bit McMaster 30585A87 Wire gauge 70, 0.028" in diameter
Drill bit McMaster 30585A88 Wire gauge 71, 0.026" in diameter
Drill bit McMaster 30585A91 Wire gauge 73, 0.024" in diameter
Drill bit McMaster 8870A23 3/16" in diameter
Dremel disc Wagner 31M Diamond coated, 22 mm in diameter, 0.17 mm in thickness
Steel wire Precision Brand 21212 0.012" in diameter, full hard
Steel wire Precision Brand 21007 0.007" in diameter, full hard
Steel wire A-M Systems 792700 0.003" in diameter, half hard
Super glue Loctite LT-40640 # 406
Super glue Loctite LT-41550 # 415
Dental acrylic powder  Teets 223-3773 Coral
Dental acrylic liquid Teets 223-4003

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References

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Grabación de neurociencia número 135 hiperimpulsor multi-tetrodo en vivo electrofisiología extracelular actividad neural comportarse ratas
Construcción de un hiperimpulsor mejorado del tetrodo múltiples de grabación Neural a gran escala en comportarse ratas
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Lu, L., Popeney, B., Dickman, J. D., … More

Lu, L., Popeney, B., Dickman, J. D., Angelaki, D. E. Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats. J. Vis. Exp. (135), e57388, doi:10.3791/57388 (2018).

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