Summary
Apresentamos a construção de um hyperdrive 3D-printable com dezoito tetrodes independentemente ajustáveis. O hiperpropulsor é projetado para gravar a atividade cerebral em livremente se comportando ratos durante um período de várias semanas.
Abstract
Monitorar os padrões de atividade de uma grande população de neurônios ao longo de muitos dias em animais acordados é uma técnica valiosa no campo da neurociência de sistemas. Um componente chave desta técnica consiste no posicionamento preciso de vários eletrodos em regiões do cérebro desejada e a manutenção de sua estabilidade. Aqui, descrevemos um protocolo para a construção de um hyperdrive impressão 3D, que inclui dezoito tetrodes independentemente ajustáveis e destina-se especificamente na vivo extracelular neural gravação em livremente se comportando ratos. Os tetrodes anexadas para os microdrives também podem individualmente ser avançados em várias regiões do cérebro ao longo da trilha, ou podem ser usados para colocar uma matriz de eletrodos em uma área menor. Os Múltiplo tetrodes permitem a análise simultânea de action potentials de dezenas de neurônios individuais, bem como potenciais de campo local de populações de neurônios no cérebro durante o comportamento ativo. Além disso, o projeto prevê 3D mais simples elaboração de software que pode ser facilmente modificado para diferentes necessidades experimentais.
Introduction
No campo da neurociência de sistemas, os cientistas estudam as correlações neurais subjacentes a processos cognitivos como navegação espacial, memória e tomada de decisões. Para estes tipos de estudos, é fundamental para monitorar a atividade de muitos neurônios individuais durante o comportamento animal. Nas últimas décadas, dois importantes avanços foram feitos para atender às necessidades experimentais para extracelular neural gravação em pequenos animais,1,2,3. Primeiro foi o desenvolvimento do tetrode, um pacote de quatro microwires usado para gravar a atividade neural de neurônios simultaneamente1,2,4. As amplitudes de sinal diferencial de atividade através dos quatro canais de um tetrode permite o isolamento da atividade do neurônio individuais de muitas células gravadas simultaneamente5. Além disso, a natureza flexível do microwires permite maior estabilidade do tetrode minimizando o deslocamento relativo entre o tetrode e o populacao de celula alvo. Tetrodes agora são amplamente utilizados em vez de um único eletrodo para muitos estudos do cérebro em várias espécies, incluindo roedores1,2,6, primatas7e insetos8. Segundo o desenvolvimento de um hyperdrive transportava vários tetrodes móveis independente, o que permite o monitoramento simultâneo de atividade neural de maiores populações de neurônios de gravação múltiplas localizações3, 9,10,11,12.
A disponibilidade de um dispositivo de gravação multi tetrode confiável e acessível para pequenos animais é limitada. O hiperpropulsor clássico, inicialmente desenvolvido por Bruce McNaughton13, tem sido utilizado com sucesso para gravações neurais em livremente se comportando ratos em muitos laboratórios no passado duas décadas9,10,14, 15. no entanto, por razões técnicas, os componentes originais necessários para construir a unidade McNaughton agora são muito difíceis de obter e não são compatíveis com interfaces de aquisição de dados recentemente melhorada. O outro projeto bem aceito de hyperdrive requer os microdrives para handcrafted individualmente, que pode produzir resultados inconsistentes e consumir tempo substancial12. Para gravar a atividade neural de várias regiões do cérebro no comportamento de ratos, desenvolvemos um novo hiperdrive usando a tecnologia de stereolithographic. Nós procuramos satisfazer os seguintes requisitos: (1) o hiperpropulsor novo deve permitir deslocamento preciso dos tetrodes no cérebro e fornecer a gravação estável de várias regiões-alvo; (2) o hiperpropulsor novo deve ser compatível com o sistema magnético quickclip recentemente desenvolvido para permitir a fácil conexão; e (3) o hiperpropulsor novo pode ser reproduzido com precisão com materiais facilmente disponíveis. Aqui, nós fornecemos uma técnica para construir o hiperpropulsor 3D-printable contendo dezoito tetrodes móveis independente, baseados em cima do projeto McNaughton. O protocolo, descrevemos os detalhes do processo de fabricação do hiperpropulsor novo, o que temos usado com sucesso para registros único-neurônio potenciais de ação e potenciais de campo local dos córtices medial e postrhinal entorhinal durante semanas em um livremente comportando-se rato durante tarefas de forrageamento naturais.
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Protocol
1. estereolitografia de modelos 3D
- Use técnicas de stereolithographic para imprimir o hyperdrive peças e acessórios. Cada hyperdrive é composto de dezoito vaivéns, dezoito shuttle parafusos e cada um de todos os outros pedaços de plástico (Figura 1).
Nota: Os acessórios não fazem parte do hiperpropulsor mas são necessários para a construção de hyperdrive.
2. preparação de acessórios (Figura 2).
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Preparação do rack microdrive (Figura 2).
- Limpar e expandir os menores através de furos e os cego-furos maiores no rack com um bocado de broca ø 0,71 mm (0,028") e um ø 0,84 mm (0.033") broca, respectivamente.
- Cortar uma haste de soldadura de 0,89 mm (0,035") ø 17mm longos segmentos, rodada de ambas as extremidades e inserir cada haste guia o ø 0,84 mm (0.033") furos na prateleira, deixando 11,5 mm fora (flush com barras roscadas).
- Totalmente Insira 0 6-80 rosqueado, 15,88 mm (5/8") há muito plana parafusos de cabeça para baixo nas ranhuras do rack. Certifique-se de que as barras de guia e barras roscadas são retos e paralelos um ao outro. Preencha o espaço restante nas ranhuras com cimento dental diluído. Ar seco em uma bancada de 15 min.
- As hastes de soldadura de cola e parafusos dentro do rack com super fina de cola e deixe secos por 15 min.
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Preparação da estação núcleo (Figura 2E).
- Enfie os quatro furos com um toque de 2-56 e use parafusos de nylon longa de 4,76 mm (3/16") 2-56, para proteger o núcleo na estação, se necessário.
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Preparação da ferramenta de torneamento (Figura 2F).
- Rosqueie o buraco no punho com um toque de 4-40. Introduza a ponta usinada na ranhura no punho e seguro com um parafuso de copo longo 4-40, 4,76 mm (3/16").
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Preparação do hiperdrive titular (Figura 2).
- Rosqueie o orifício do parafuso com um toque de 8-32. Use um parafuso de polegar de nylon longa de 9,52 mm (3/8") de 8-32, para proteger o hyperdrive quando em uso.
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Preparação da haste posicionamento complexas (Figura 2 H).
- Rosqueie a haste do lado com o furo maior (topo) com um toque de 8-32 para uma profundidade de aproximadamente 7 mm. Thread os furos menores (seis no topo, dezoito anos no fundo) com um toque de 0-80. Expanda o furo central no topo com uma broca de ø 4,76 mm (3/16"), se necessário.
- Montar a haste para cima, usando um 8-32, ø 4,76 mm (3/16"), 6,35 mm (1/4") parafuso longo do ombro. Fixe o fundo para o topo com 0-80, 6,35 mm (1/4") parafusos longos, quando em uso.
3. preparação dos componentes Hyperdrive (Figura 3).
- Preparação da porca hyperdrive (Figura 3A).
- Usando o titular porca (Figura 2D), rosqueie a porca com uma torneira de 3/8-24 bottoming até ficar homogêneo.
- Montagem do núcleo hyperdrive (Figura 3B).
- Limpar e expandir os buracos no núcleo usando brocas de tamanhos diferentes (doze chão fio através de buracos (anel interno): ø 0,61 mm (0,024"); os dezoito tetrode através de furos (anel médio): ø 0,66 mm (0,026") primeiro e depois ø 0,71 mm (0,028 "); 18 guia haste cego-buracos (anel exterior): ø 0,84 mm (0,033")).
- Passe os dois através de furos, no topo do núcleo e os restantes oito cegos-furos (quatro no lado, quatro na parte inferior) com um toque de 0-80. Utilize uma torneira bottoming para os furos cegos.
- Crie segmentos externos na base do núcleo usando um dado de 3/8-24. Ajuste o dado corretamente para a porca do hiperdrive vai caber sobre novos tópicos.
- Dependendo do número de chão fios desejado, inserir vários segmentos longa de 6 mm de tubo de metal de calibre 23 (cânulas) nos orifícios fio terra no núcleo, colando-os se necessário. Arquivo as extremidades das cânulas de fio chão até flush com o exterior do núcleo e limpar as cânulas com um fio de 0,30 mm (0,012") aço ø.
- Introduza completamente dezoito 0-80, 15,88 mm (5/8") cabeça de parafusos de cabeça plana muito baixa nas ranhuras do núcleo. Não dobre os parafusos ou danificar os fios durante esse processo.
- Utilizando a haste posicionamento complexo e da estação central, posição dezoito segmentos de 17 milímetros de diâmetro 0,89 mm (0,035") haste de soldadura sobre os buracos de haste de guia no núcleo e martelo-los para baixo para ser nivelado com os parafusos (cerca de 5 mm).
- Corrigir as posições das barras de soldagem e parafusos se necessário, em seguida, aperte o parafuso central do ombro e os seis parafusos ao redor da haste posicionamento complexas para fixar as direções para fora das barras no núcleo. Aparafuse a porca do núcleo (com a haste de posicionamento complexo) e o núcleo se encaixa o titular hyperdrive para permitir fácil posicionamento sob um estereoscópio.
- Preencha as vagas com cimento dental diluído para fixar os parafusos para o núcleo e permitir que o ar de secagem de 15 min. preencher vagas de 2-3 em um momento antes do cimento dental fica muito grosso. Raspe qualquer excesso de cimento dental no núcleo para manter um encaixe adequado com o escudo.
- Cola os parafusos e as hastes para o núcleo com cola super fina, permitem que o ar de secagem de 15 min.
- Montagem do microdrive (Figura 3).
- Limpar e expandir os dois orifícios exteriores no vaivém com bocados de broca (orifício menor: ø broca de 0,61 mm (0,024") bit; furo maior: ø 0,89 mm (0,035") de broca).
- Insira o parafuso de transporte no parafuso suporte base. Preste atenção para a orientação. Feche a tampa do suporte de parafuso, segure firmemente e thread lentamente através do orifício da tampa com um toque de 0-80. Bata 2 - 3 vezes até ficar homogêneo.
- Insira o parafuso de transporte para o vaivém do lado com a abertura menor. Lugar do transporte-transporte bolt complexos de ponta-cabeça na estação de montagem microdrive base.
- Cortar um segmento de 15 mm do tubo de metal de calibre 23 e suavizar as duas extremidades e, em seguida, posicione o tubo sobre o buraco de 0,61 mm (0,024") ø, guiado pela ranhura na estação de tampa. Martelo da cânula no buraco até a extremidade superior é nivelada com a estação de tampa.
- Remova a metade externa da ponta superior da cânula com uma roda de lixamento. Limpeza da cânula com um fio de metal ø 0,30 mm (0,012"). Cola a cânula o transporte usando cola super fina, certificando-se não para o parafuso de transporte para o transporte de cola e ar seco por 15 min.
- Preparar pelo menos dezoito microdrives, teste o microdrive no rack microdrive. Certifique-se que o raio de transporte pode girar suavemente na nave e que o microdrive inteira move-se livremente ao longo do comprimento da haste rosqueada.
- Preparação da coluna central (Figura 3D).
- Areia de superior e inferior da coluna central até o apartamento, se necessário. Passe os dois furos na coluna central com um toque de 0-80. Inserir uma porca sextavada de 0-80 (3,18 mm (1/8") de largura, 1,19 mm (3/64") alta) em cada slot.
- Preparação da PAC hyperdrive (Figura 3E).
- Usando fórceps não-magnético, Cole quatro ímãs (3 mm de diâmetro, 1 mm de espessura) para os quatro poços, combiná-los com os polos N e S, na placa de interface de eletrodo.
- Montagem das cânulas de guia em um pacote (Figura 3F).
- Lugar 18 30 gauge, cânulas de parede fina (ID) 0,19 mm, 0,0075" em ø 2,29 mm (0.09") termo-retráctil tubos (3-5 mm de comprimento, espaçamento ao longo do feixe por 5-10 mm). Fazer todas as cânulas lave com um outro em uma extremidade do feixe.
- Encolha os tubos termo-retráctil usando uma pistola de calor até que o pacote está apertado. Esprema o pacote com cuidado para moldá-la conforme desejado (redondo ou oval). Confirme que todas as cânulas estão nas posições corretas com nenhuma torção, cruzamento, ou dobra.
- Marque a área (s) para a solda sobre as cânulas. A porção dessoldada deve ser 26 mm de comprimento, enquanto a porção soldada deve ser 5-10 mm. mover o encolhimento tubos para as marcas de solda para evitar a propagação.
- Aplicar o fluxo para uma área de solda e solda rodando o pacote. Esfriar em temperatura ambiente pelo menos 1 min. Repita este passo para a mesma área de solda mais duas vezes. Suavizar a parte soldada por solda sem aplicar o material de enchimento e de fluxo. Esfriar em temperatura ambiente pelo menos 1 min.
- Corte o pacote para o comprimento correcto com um disco diamantado na velocidade máxima, polonês ambos termina para ajustar o comprimento (dessoldadas parte: 26 mm, soldado parte: 5-10 mm conforme desejado). Limpe as cânulas de guia com um fio de metal ø 0.18 mm (0,007") sob um estereoscópio.
- Preparando os tetrodes. Procedimentos semelhantes foram descritos8,16,17 .
- Ajuste a altura da barra horizontal de T e a posição do agitador magnético, para que o braço horizontal na Cruz da barra T é diretamente acima do centro do agitador magnético. Conectar uma extremidade de um gancho-S ao centro de uma barra de agitação magnética pequena e, em seguida, colá-los. Limpe o tetrode, tornando o espaço com ar comprimido e toalhetes de etanol.
- Extremidades do círculo os dois de uma peça de única tetrode juntos cerca de 40 cm de comprimento do fio e, em seguida, prenda com um pedaço de fita de cobre.
- Levante o círculo de arame, segurando a fita de cobre. Coloque a extremidade oposta da fita de cobre sobre o braço horizontal da barra de T. Baixar a fita de cobre suavemente (enquanto a outra extremidade é ainda na barra de T), torcer uma vez e coloque a fita de cobre com a barra de T. O círculo de tetrode está agora em uma configuração de figura oito ("∞") com a fita de cobre, sentado no topo a Cruz da barra horizontal.
- Mantenha a fita de cobre na barra de T, com uma mão suavemente. Com a outra mão, ligar a extremidade livre do S-gancho (com agitação magnética anexada ao extremo oposto) através da parte inferior do círculo fio tetrode, libere o S-gancho suavemente e que corrija os quatro fios, o peso do gancho S.
- Ajuste a altura da barra horizontal até a parte inferior do gancho-S é cerca de 1 cm acima do centro da placa de agitador magnético.
- Dobre a borda da fita cobre para baixo para fixá-la à barra horizontal. Examinar os quatro fios reta tetrode pelo olho e, em seguida, remover os detritos.
- Ligue o agitador torcendo os quatro fios a uma velocidade de cerca de 60 rpm, até que o ângulo entre os dois fios sem torção opostos é cerca de 60°.
- Definir o soprador de ar quente a 210 ° C e aqueça os fios torcidos varrendo a arma ao longo do comprimento reto dos fios de diferentes ângulos para 2 min para fundi-las juntos derretendo a camada de ligação VG.
- Levantar o gancho S com agitar suavemente e corte a extremidade inferior do tetrode com uma tesoura bem.
- Espere a barra horizontal com um dedo a fita de cobre, cortar os fios de ambas as extremidades da fita cobre com uma tesoura e remova a fita de cobre. Corte o fio restante na barra horizontal para liberar o elétrons triodo.
- Coloque o tetrode concluído em uma caixa de pó-livre para o armazenamento. Prepare pelo menos vinte e cinco tetrodes.
4. montagem do hyperdrive (Figura 4).
- Inserir as cânulas de guia para o núcleo de hyperdrive (Figura 4A).
- Retirar os tubos termo-retráctil e deslizar um segmento de 4 mm de tubo de silicone (ID 1,02 mm (0,04"), OD 2,16 mm (0,085")) ao longo do pacote à fronteira soldadas/dessoldadas. A fenda da Cunha no espaçador hyperdrive para alargar o furo central, permitindo que o espaçador para escorregar em volta do tubo de silicone. Remova a placa quando o espaçador senta-se no centro do tubo do silicone.
- Organize as posições das cânulas de guia no pacote colocando longos segmentos (10 cm) do fio metal ø 0.18mm (0,007") através de cada cânula em um buraco tetrode específicas no núcleo do hiperdrive, impedindo qualquer cruzamento dos fios ou cânulas no processo. Dobre as pontas dos fios para mantê-los no lugar.
- Empurre as cânulas através de seus respectivos furos no núcleo, tendo o cuidado de evitar dobrar ou cruzamento entre eles, até que a extremidade livre de cada cânula é pelo menos 2 milímetros fora da extremidade superior do furo tetrode. Fixe o espaçador apertando a porca do núcleo, tendo o cuidado de evitar o espaçador de rotação. Aplique uma gota de cimento dental muito diluído da parte superior do núcleo para a junção das cânulas para fixar suas posições relativas.
- Cortar o guia fios da extremidade soldada do feixe e retire-lhes as cânulas por retração da extremidade livre.
- Montagem dos microdrives para o hiperpropulsor núcleo (Figura 4B). Um arranjo espacial detalhado dos microdrives no hiperpropulsor tem sido descrito anteriormente11,13.
- Carrega os microdrives lentamente e com cuidado para cada haste roscada do núcleo. Confirmar que (1) a 23 gauge microdrive cânula entra no buraco de tetrode lisamente, (2) a 30 gauge cânula guia vai para o 23 calibre microdrive cânula lisamente, e (3) o parafuso de transporte gira suavemente ao longo da haste roscada. Que se lixe os microdrives até 1.0-1.5 mm acima da extremidade inferior da barras roscadas.
- Corte 18 pedaços de tubos de poliimida (ID 0,11 mm (0,0045"), OD 0,14 mm (0.0055")) em segmentos de 38-43 mm (comprimento do pacote de cânula guia plus 7 mm). Limpe cada tubo com um fio de 0,08 mm (0,003") aço ø.
- Inverter o núcleo, Introduza cuidadosamente os tubos de poliimida as cânulas de guia da extremidade soldada e empurrá-los todos a entrar sob um estereoscópio. O núcleo da aleta vertical e cole a extremidade superior do tubo para a cânula microdrive poliimida com cola super grossa. Coloque o núcleo de cabeça para baixo e deixe a cola secar durante 15 min.
- Corte a extra poliimida tubo na extremidade superior, deixando 0,5-1,0 mm fora da cânula microdrive.
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Montagem dos fios terra (Figura 4).
- Reduzir o número de fios de terra necessários para comprimentos de 25-30 mm de fio de aço revestido (revestido ø 0,20 mm (0,008"), ø desencapado 0,13 mm (0,005")). Tira 2 mm do isolamento plástico de ambas as pontas dos fios e insira uma extremidade de cada um nas extremidades das cânulas de calibre 30 tempo de 6-8 mm. Achate as pontas das cânulas para fixar a conexão aos seus respectivos fios.
- Use uma ferramenta Dremel para cortar as cânulas ao meio para criar dois fios terra completa de cada um.
- Insira a extremidade redonda da cânula de 30 calibre na extremidade superior da cânula no núcleo do fio terra e pressione para fazer a inserção apertada.
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Montagem da placa de interface de eletrodo (Figura 4).
- Inserir a coluna central no núcleo e seguro com dois 0-80, parafusos de cabeça de soquete longo 7,94 mm (5/16"). Cola-se necessário fazer a coluna central constante no núcleo.
- Expanda as porções dos slots na placa de BEI-72-QC-Large que correspondem aos dois furos roscados na coluna central com um toque de 1,2 mm de ø. Anexe a placa de interface de eletrodo para a coluna central com dois 0-80, parafusos de cabeça de pan longo 3,97 mm (5/32"). Verifique se a placa está situada no centro e é segura.
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Ligar os fios do chão (Figura 4E).
- Rota cada fio de terra ao redor da coluna central e conecte a extremidade livre exposta para a placa de interface de eletrodo com um pin de ouro para o buraco de terra designado.
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Carregando os tetrodes no hiperpropulsor, como anteriormente descrito 16 , 17 .
- Carrega cada tetrode cuidadosamente para os tubos de poliimida dos microdrives, tomando cuidado para não dobrá-los durante o processo.
- Delicadamente, alimentar os fios de extremidade livre em seus buracos designados na interface do eletrodo placa e eletricamente conexão-los usando pinos ouro.
- Corte os tetrodes individualmente a um comprimento adequado. Confirmar que a parcela de tetrodes salientes as extremidades inferiores dos tubos de poliimida após o corte é reta, caso contrário, substitua o tetrode inteira e recut.
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Anexar o escudo.
- Anexe o escudo para o núcleo usando quatro 0-80, 3,97 mm (5/32") parafusos Philips. Os números sobre o escudo devem combinar com os números na placa de interface de eletrodo.
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Chapeamento da dicas tetrode.
- As dicas dos tetrodes usando o dispositivo de chapeamento de NanoZ equipado com um conector ADPT-NZ-BEI-36 e um adaptador de ADPT-EIB-72-QC-HS-3617da placa. Como alternativa, da placa-los manualmente um por um, conforme descrito em outro lugar16. Placa do tetrode dicas antes da sua utilização (por exemplo, um dia antes da implantação), como impedância aumentará progressivamente ao longo do tempo após o chapeamento. Substitua os tetrodes que estão em curto ou obstruídas durante o processo do chapeamento, cortá-los para um comprimento adequado e re-placa.
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Finalizando o hyperdrive (Figura 4F).
- Cole os tetrodes para seus tubos de poliimida como descrito anteriormente,16. Retrai todos eles volta para suas cânulas de guia para que as chapeado dicas não são expostas.
- Dane-se quatro 0-80, 6,35 mm (1/4") tempo soquete parafusos nos quatro furos na parte inferior do núcleo hyperdrive.
- Usando um estereoscópio, baixe cada tetrode lentamente até que a extremidade do tetrode é apenas acima da borda da cânula guia. Enquanto isso, localize a posição de cada tetrode no pacote de cânula do guia. O mapa de posição do tetrode é fundamental para a reconstrução dos locais de gravação.
- Colocar a tampa para a unidade e armazenar o hiperpropulsor corretamente para implantação.
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Representative Results
Usamos um recém-construído hyperdrive para obter resultados experimentais. O carro foi equipado com tetrodes construídos a partir de ø 17 µm (0,0007"), fio de poliamida-revestido de platina-irídio (90% - 10%). As dicas dos tetrodes foram chapeadas em platinum preto solução para reduzir impedâncias de eletrodo para entre 100 e 200 kΩ a 1 kHz. O hiperpropulsor foi implantado 4,6 mm deixada de linha média e 0,5 mm à frente do seio transverso no crânio de 550 g, masculino rato de Long-Evans. Fios de terra adicional estavam ligados aos parafusos de crânio sobre o cerebelo. Todos os procedimentos foram realizados conforme aprovado pelo Comitê de uso (IACUC) do Baylor College of Medicine e institucional Cuidado Animal e foram semelhantes aquelas descritas anteriormente18. Imediatamente após a implantação cirúrgica, os tetrodes eram avançados 1 mm para o cérebro. Nos dias subsequentes, foram utilizados menores avançados incrementos de não mais de 80 µm. Os tetrodes permitiram estabilizar após cada avanço pelo menos 20 h antes neurais gravações foram realizadas.
Para gravar a atividade neural, o hiperpropulsor foi conectado a um pre-amplificador de headstage (Neuralynx, HS-72-QC), e o último foi conectado a um sistema de aquisição de dados com amplificadores programáveis (Neuralynx, Digital SX Lynx). Potenciais de campo locais foram referenciados para o fio terra, amostrado de 2 kHz, e band-pass filtrado em 0,1 — 500 Hz. actividade de unidade foi referenciada para um tetrode com nenhuma atividade observável localizado a 500 µm da superfície do cérebro, amostrados em 32 kHz e filtrada na passa-banda 600 Hz - 6 kHz. Só pico de ondas acima de um limite de 50 µV foram gravadas.
Figura 5A ilustra a atividade neural, gravada a partir de um tetrode localizado no córtex postrhinal (2,1 mm abaixo da superfície do cérebro), enquanto o animal foi forrageiam livremente dentro de um 1,5 m abrir caixa três semanas após o implante. A sessão de gravação durou cerca de 30 min e as unidades gravadas manteve-se estável através de toda a sessão (demonstrada pela pequena variação na forma de onda do pico). Figura 5B mostra potenciais de campo local gravados simultaneamente a partir de quatro diferentes tetrodes localizados no córtex entorhinal medial (3.4-3,7 mm de profundidade), enquanto o mesmo animal foi explorando ativamente open arena sete semanas após o implante. Atividade potencial de campo limpo na faixa de frequência theta (6-10 Hz) estava presente. Dados de pico de neurônio individual foram isolados utilizando o software classificação MClust (A.D. avermelhado), e dados de potencial do campo local foi visualizados pelos scripts de Matlab personalizada. Exemplos de gravações de baixa qualidade tetrode, possivelmente resultante de uma unidade mal preparada, foram mostrados anteriormente17.
Figura 1: componentes Hyperdrive criados pela tecnologia stereolithographic. Imagem dos componentes 3D-printable hyperdrive (moeda 1¢ para comparação de tamanho). (A), o núcleo de hyperdrive; (B) o escudo protetor; (C) a tampa de protecção; (D), a coluna central; (E), a porca; (F), o espaçador; (G), o serviço de transporte; (H) o parafuso de transporte. Barra de escala: 1 cm. Esses componentes foram criados por uma impressora UnionTech RSPro450 usando o material plástico Somos evoluir 128. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: acessórios personalizados para construção de hyperdrive. Estes acessórios foram concebidos especificamente para auxiliar na preparação de hyperdrive. Seus principais componentes foram criados pela impressão de stereolithographic. (A) titular do parafuso de transporte, que prende o parafuso de transporte enquanto grampeia os fios. (B), o assembly microdrive estação, que orienta a inserção da cânula para o transporte. (C) o microdrive cremalheira, que ajuda a testar os microdrives montados e prende-los no lugar enquanto colando as cânulas. 1: uma base de cremalheira microdrive; 2: um microdrive rack com parafusos totalmente inseridos nos slots; 3: um rack microdrive pronto para uso. (D) o titular da porca, que detém a hyperdrive porca quando se enrosca no buraco. (E), o núcleo do hiperdrive estação, que protege o núcleo enquanto martelando as barras de guia. (F) a ferramenta de giro, que aciona o parafuso de transporte para girar na nave. (G) o titular hyperdrive, que ajuda a colocar o hiperpropulsor sob um estereoscópio. O titular também protege os tetrodes após terem sido carregados para o hiperpropulsor. (H) a haste posicionamento complexas, que ajuda a posicionar as barras roscadas e guiar as hastes no núcleo do hiperdrive. 1: principais componentes do complexo; 2: a parte superior do complexo após a montagem; 3: uma haste de posicionamento complexas em uso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: preparação de hyperdrive peças antes da montagem. Imagens que mostram o processo de preparação do núcleo do hiperdrive e o microdrive, bem como outros preparados hyperdrive peças. (A), A segmentação hyperdrive porca. (B) preparação do núcleo hyperdrive. 1: o núcleo com rosca externa criada para a porca; 2: o núcleo colocado em uma estação de núcleo com parafusos totalmente inseridos nos slots; 3: guia de hastes posicionadas pela haste posicionamento complexo, pronto para ser martelado para o núcleo; 4: preencher o espaço restante nas ranhuras com cimento dental diluído; 5: a parte superior de um núcleo de hyperdrive preparado. (C) preparação do microdrive. 1: um parafuso de transporte colocados em uma vaivém parafuso suporte base, nota a menor abertura esteja voltado para o experimentador; 2: segmentação segmentos dentro do parafuso de transporte; 3: parafuso de inserção do ônibus para o transporte; 4: um microdrive colocado na estação de montagem microdrive base com a cânula guiada pela tampa da estação, pronta para ser inserido; 5: um microdrive com o exterior metade da ponta da cânula superior removido (indicado pela seta); 6: montado microdrives testado na prateleira microdrive. (D), A coluna central com furos roscados e porcas do parafuso inserido. (E) A hyperdrive cap com quatro ímãs colados nos poços. Bundle (F) A 36 mm de comprimento de guia de cânula, com a parte soldada à esquerda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: montagem do hiperpropulsor. Imagens mostrando estágios da Assembleia hyperdrive. (A) inserção de cânulas o guia para o núcleo. 1: o pacote de cânula guia deslizou para o tubo de silicone e o espaçador; 2: cânula de um guia, sendo colocada em seu furo designado no núcleo. Escrita de mão mostra a organização do guia de cânulas; 3: guia de cânulas empurradas para o núcleo; 4: o núcleo com as cânulas de guia inserido e garantidos pela porca. (B) montagem dos microdrives ao núcleo. 1: o núcleo com microdrives carregado; 2: os microdrives com tubos de poliimida inseridos nas cânulas. (C) inserção dos fios terra para o núcleo. (D) fixação da placa de interface de eletrodo. 1: o hiperpropulsor com coluna central inserido; 2: o hiperpropulsor com placa de interface de eletrodo anexado à coluna central. (E) Conexão do fio terra para o buraco designado na placa de interface de eletrodo. (F) uma finalizado hyperdrive pronto para implantação (peso total de 20 g). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: sinais neurais gravada pelo hiperpropulsor. Representante gravações mostrando atividade neural de unidade e campo local potenciais no cérebro de um rato comportamento. (A) bidimensional cluster diagramas ilustrando pontos individuais de neurônios simultaneamente gravados por um tetrode localizado no córtex postrhinal (profundidade: 2.1 mm). Esquerda: gráfico de dispersão mostrando a relação entre o pico a pico amplitudes dos picos, gravados a partir de dois eletrodos do tetrode. Cada ponto corresponde a um pico. Clusters de picos são prováveis que se originam na mesma cela. Quatro grupos são codificados por cores. Barra de escala: 20 µV. Direita: spike (meios ± S.D.) formas de onda das células Color-coded mostradas à esquerda. Note a pequena variação das formas de onda. Barra de escala: 200 µs. (B) vestígios de campo local potencial na faixa de frequência theta gravado simultaneamente a partir de quatro diferentes tetrodes localizados no córtex entorhinal medial (profundidade: 3.4-3,7 mm) quando o rato era forrageiam livremente. Barra de escala no canto inferior esquerdo: 500 mV; barra de escala no canto inferior direito: 100 ms. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivos complementares: Os arquivos complementares incluem 20 arquivos no formato. STL detalhando os hyperdrive componentes e acessórios prontos para stereolithographic impressão (unidades em mm) e 1 ficheiro em formato PDF, que é o modelo da ferramenta torneamento dica pronto para usinagem. Os arquivos de modelo 3D original foram criados com o software AutoCAD em formato DWG, que estará disponível a pedido. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Aqui, descrevemos o processo de construção de um hyperdrive recém-desenvolvido composto de dezoito tetrodes independente móveis. A unidade pode ser construída de partes acessíveis compradas em muitas lojas de hardware disponíveis, combinadas com componentes criados pela impressão de stereolithographic. O hiperpropulsor pode ser cronicamente implantado no crânio de um rato utilizando procedimentos cirúrgicos padrão e é capaz de gravar a atividade neural extracelular, enquanto o animal executa várias tarefas comportamentais.
O hiperpropulsor mantém muitas das características desejáveis do hiperpropulsor McNaughton original, incluindo os microdrives tripé que são orientados para o exterior por 30 graus a partir da unidade centro13, que fornece suporte confiável para os tetrodes. Uma vez implantado, o hyperdrive permite a execução de pequenos movimentos dos tetrodes dentro do cérebro de um animal acordado com precisão considerável. Uma volta completa de um serviço de transporte sobre a haste roscada corresponde a um deslocamento linear de 317.5 µm. Com formação adequada, um experimentador pode avançar um serviço de transporte em vez de 1/16 passos (20 µm). Nós projetamos o hyperdrive para uso em ratos adultos, mas a unidade poderia ser facilmente utilizada em qualquer animal com um tamanho de corpo de 350 g ou maior (limitado pelo tamanho da cabeça). Uma limitação do dispositivo pode-se notar na profundidade restrita de gravação, como a distância do curso máximo dos tetrodes ao longo de barras roscadas é cerca de 7 mm, o que poderia ficar aquém estruturas mais profundas nos cérebros dos animais.
Stereolithographic impressão prevê resolução suficiente para criar componentes plásticos em grande detalhe com alta fidelidade e tem sido utilizado anteriormente em hyperdrive fabricação12,19,20. Neste caso, utilizou-se uma impressora industrial comumente disponível através de instalações de produção de terceiros. Lá, todos os componentes do hiperdrive foram impressos precisamente, incluindo o núcleo do hiperdrive, apesar de sua geometria complexa e as pequenas estruturas tais como o ø 0,6 mm pelos furos e as paredes finas de 0,3 mm. Essa precisão torna estereolitografia uma escolha ideal para a fabricação de componentes de hyperdrive. Com base na experiência anterior, menos caras, desktop impressoras 3D são menos propensos a ter a precisão necessária para reprodução confiável dos hyperdrive componentes necessários. Ainda, a tecnologia de stereolithographic tem suas limitações. Primeiro, ele tem uma seleção limitada de materiais. O plástico que escolhemos para o hiperpropulsor foi o mais durável daqueles que nós testamos, mas é ainda não é ideal para a fabricação de peças muito pequenas. As naves e os parafusos de transporte precisam ser manuseados com cuidado extra como eles podem quebrar durante a preparação. As peças de plástico não são autoclaváveis, como a temperatura de deflexão térmica do material é de cerca de 50 ° C. Além disso, o material de impressão utilizado não é resistente a acetona. Estas questões poderiam ser resolvidas quando novos materiais de estereolitografia são desenvolvidos e testados. Ainda, considerando o custo relativamente baixo de estereolitografia, as vantagens da técnica e custo excedem os defeitos. Em segundo lugar, devido à natureza de estereolitografia, durante o qual fotopolímeros são fotoquimicamente solidificados por um laser UV para formar uma única camada do modelo 3D desejado21, os objetos criados pela impressão de stereolithographic são vulneráveis à luz UV. Por conseguinte, expondo-os à UV forte (por exemplo, luz solar direta) por muitas horas irreversivelmente reduzirá sua força física (com base na comunicação pessoal com a loja de impressão). Considerando o UV ambiental no espaço de laboratório (por exemplo, das luzes fluorescentes), é melhor guardar os componentes do stereolithographic em uma caixa escura quando não estiver em uso, que irá reter a força física dos componentes por anos. Além disso, é importante o uso de outros métodos além da luz UV para desinfectar a superfície hyperdrive antes da cirurgia. Este teste hyperdrive manteve-se implantado no rato em boas condições em um ambiente de laboratório comuns ao longo de quatro meses, sem qualquer indicação de redução de força física ou desempenho.
A natureza para impressão 3D deste hyperdrive também permite modificações rápidas e flexível redesenho. Por exemplo, o hyperdrive pode ser facilmente modificado para destino separados vários cérebro regiões11. Além disso, esta unidade poderia ser ajustada para permitir o monitoramento simultâneo de atividade neural e manipulação do cérebro local. Incorporação de uma sonda de microdialysis com a matriz de tetrodes Permite farmacológica ativação e desativação de neurônios mediante a infusão de várias drogas durante gravação neural22. Além disso, neurônios, projetados para expressar crepuscular canais podem ser ativados ou desativados pela incorporação de uma fibra óptica no tetrode bundle e optogenetic técnica19. Além disso, a unidade pode ser facilmente redimensionada com um menos número de tetrodes para animais com cabeça menores, tais como ratos ou ratos jovens.
Em resumo, a mutabilidade fácil juntamente com o método mais simples, mais acessível de construção de um implante de gravação neural eficaz que pode ser reproduzida de forma confiável e com precisão, faz este hyperdrive uma ferramenta poderosa no campo.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos o laboratório Moser no Kavli Institute de neurociência de sistemas e o centro para Computação Neural, Universidade Norueguesa de ciência e tecnologia, para a crônica neural gravando procedimentos em ratos. Este trabalho foi financiado pelo NIH grant R21 NS098146 e humano Frontier ciência programa a longo prazo Fellowship LT000211/2016-L L. Lu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Welding rod | Blue Demon | ER308L-035-01T | Stainless steel, 0.035" in diameter |
| Screw | McMaster | 91771A060 | Stainless steel, flat head, 0-80 thread, 5/8" in length |
| Screw | McMaster | 91772A051 | Stainless steel, pan head, 0-80 thread, 5/32" in length |
| Screw | McMaster | 92196A056 | Stainless steel, socket head, 0-80 thread, 5/16" in length |
| Screw | McMaster | 92196A055 | Stainless steel, socket head, 0-80 thread, 1/4" in length |
| Screw | McMaster | 95868A131 | Nylon, socket head, 2-56 thread, 3/16" in length, black |
| Screw nut | McMaster | 90730A001 | Stainless steel, narrow hex, 0-80 thread |
| Shoulder screw | McMaster | 90298A213 | Stainless steel, 8-32 thread, 3/16" in diameter, 1/4" in length |
| Cup screw | McMaster | 92313A105 | Stainless steel, 4-40 thread, 3/16" in length |
| Thumb screw | McMaster | 94323A592 | Nylon, 8-32 thread, 3/8" in length, black |
| Magnet | Apex | M3X1MMDI | Neodymium, 3 mm X 1 mm disc |
| Metal tubing | Small Parts | B00137QHNS | Stainless steel, 23 gauge, 0.0253" OD, 0.013" ID, 0.006" wall |
| Metal tubing | New England Small Tube | Custom-made | Stainless steel, 30 gauge, 0.012/0.0125" OD, 0.007/0.008" ID, full hard |
| Heat-shrink tubing | McMaster | 7856K72 | 0.09" ID before shrinking, blue |
| Silicone tubing | A-M Systems | 807300 | 0.040" ID, 0.085" OD |
| Polyimide tubing | A-M Systems | 823400 | 0.0045" ID, 0.0005" wall |
| Ground wire | A-M Systems | 791500 | 0.005" bare, 0.008" coated, half hard |
| Tetrode wire | California Fine Wire | Custom-made | 0.0007" in diameter, platinum-iridium (90%-10%), HML and VG coating |
| EIB | Neuralynx | EIB-72-QC-Large | |
| Gold pins | Neuralynx | large EIB pins | |
| Tap | Balax | 01302-000 | M1.2 thread size |
| Tap | McMaster | 2522A811 | 0-80 thread size, bottoming |
| Tap | McMaster | 2522A771 | 0-80 thread size, plug |
| Tap | McMaster | 26955A94 | 3/8"-24 thread size, bottoming |
| Tap | McMaster | 2522A713 | 2-56 thread size |
| Tap | McMaster | 2522A715 | 4-40 thread size |
| Tap | McMaster | 2522A718 | 8-32 thread size |
| Die | McMaster | 2576A457 | 3/8"-24 thread size, 1" OD |
| Drill bit | McMaster | 30585A82 | Wire gauge 65, 0.035" in diameter |
| Drill bit | McMaster | 30585A83 | Wire gauge 66, 0.033" in diameter |
| Drill bit | McMaster | 30585A87 | Wire gauge 70, 0.028" in diameter |
| Drill bit | McMaster | 30585A88 | Wire gauge 71, 0.026" in diameter |
| Drill bit | McMaster | 30585A91 | Wire gauge 73, 0.024" in diameter |
| Drill bit | McMaster | 8870A23 | 3/16" in diameter |
| Dremel disc | Wagner | 31M | Diamond coated, 22 mm in diameter, 0.17 mm in thickness |
| Steel wire | Precision Brand | 21212 | 0.012" in diameter, full hard |
| Steel wire | Precision Brand | 21007 | 0.007" in diameter, full hard |
| Steel wire | A-M Systems | 792700 | 0.003" in diameter, half hard |
| Super glue | Loctite | LT-40640 | # 406 |
| Super glue | Loctite | LT-41550 | # 415 |
| Dental acrylic powder | Teets | 223-3773 | Coral |
| Dental acrylic liquid | Teets | 223-4003 |
References
- O'Keefe, J., Recce, M. L. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).
- Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Science. 261 (5124), 1055-1058 (1993).
- Gothard, K. M., Skaggs, W. E., Moore, K. M., McNaughton, B. L. Binding of hippocampal CA1 neural activity to multiple reference frames in a landmark-based navigation task. J Neurosci. 16 (2), 823-835 (1996).
- Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex. J Neurosci Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).
- Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
- Fyhn, M., Hafting, T., Witter, M. P., Moser, E. I., Moser, M. B. Grid cells in mice. Hippocampus. 18 (12), 1230-1238 (2008).
- Skaggs, W. E., et al. EEG sharp waves and sparse ensemble unit activity in the macaque hippocampus. J Neurophysiol. 98 (2), 898-910 (2007).
- Guo, P., Pollack, A. J., Varga, A. G., Martin, J. P., Ritzmann, R. E. Extracellular wire tetrode recording in brain of freely walking insects. J Vis Exp. (86), (2014).
- Knierim, J. J., McNaughton, B. L., Poe, G. R. Three-dimensional spatial selectivity of hippocampal neurons during space flight. Nat Neurosci. 3 (3), 209-210 (2000).
- Leutgeb, S., et al. Independent codes for spatial and episodic memory in hippocampal neuronal ensembles. Science. 309 (5734), 619-623 (2005).
- Lansink, C. S., et al. A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals. J Neurosci Methods. 162 (1-2), 129-138 (2007).
- Kloosterman, F., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: drive fabrication. J Vis Exp. (26), (2009).
- McNaughton, B. L. Google Patents. , Available from: https://www.google.com/patents/US5928143 (1999).
- Redish, A. D., et al. Independence of firing correlates of anatomically proximate hippocampal pyramidal cells. J Neurosci. 21 (5), RC134 (2001).
- Schmitzer-Torbert, N., Redish, A. D. Neuronal activity in the rodent dorsal striatum in sequential navigation: separation of spatial and reward responses on the multiple T task. J Neurophysiol. 91 (5), 2259-2272 (2004).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. (26), (2009).
- Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice. J Vis Exp. (77), e50470 (2013).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. J Vis Exp. (61), e3568 (2012).
- Siegle, J. H., et al. Chronically implanted hyperdrive for cortical recording and optogenetic control in behaving mice. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2011, 7529-7532 (2011).
- Brunetti, P. M., et al. Design and fabrication of ultralight weight, adjustable multi-electrode probes for electrophysiological recordings in mice. J Vis Exp. (91), e51675 (2014).
- Hull, C. W. Google Patents. , Available from: https://www.google.com/patents/US4575330 (1986).
- Ludvig, N., Potter, P. E., Fox, S. E. Simultaneous single-cell recording and microdialysis within the same brain site in freely behaving rats: a novel neurobiological method. J Neurosci Methods. 55 (1), 31-40 (1994).
