Costruzione di un Hyperdrive multi-tetrodo migliorata per la registrazione su larga scala neurale nel comportarsi ratti

Summary

Vi presentiamo la costruzione di un 3D-stampabile hyperdrive con diciotto tetrodi regolabili in modo indipendente. L'iperguida è progettato per registrare l'attività cerebrale a comportarsi liberamente ratti per un periodo di diverse settimane.

Abstract

I modelli di attività di una grande popolazione di neuroni per molti giorni in animali svegli il monitoraggio sono una tecnica importante nel campo della neuroscienza sistemiche. Una componente chiave di questa tecnica è costituito dal preciso posizionamento degli elettrodi multipli in regioni cerebrali desiderata e il mantenimento della loro stabilità. Qui, descriviamo un protocollo per la costruzione di un hyperdrive 3D-stampabile, che comprende diciotto tetrodi regolabili in modo indipendente ed è specificamente progettato per in vivo registrazione neurale extracellulare a comportarsi liberamente ratti. I tetrodi collegati i Microdrive singolarmente o possono essere avanzate nelle regioni multiple del cervello lungo la pista, o possono essere utilizzati per inserire una matrice di elettrodi in un'area più piccola. I tetrodi multiple consentono esame simultaneo di action potentials da decine di singoli neuroni, nonché potenziali di campo locale da popolazioni di neuroni nel cervello durante il comportamento attivo. Inoltre, la progettazione prevede 3D più semplice software che può essere facilmente modificato per diverse esigenze sperimentali di disegno.

Introduction

Nel campo della neuroscienza sistemiche, gli scienziati studiano i correlati neurali alla base di processi cognitivi quali navigazione spaziale, memoria e processi decisionali. Per questi tipi di studi, è fondamentale per monitorare l'attività di molti singoli neuroni durante il comportamento animale. Negli ultimi decenni, due importanti progressi per soddisfare le esigenze sperimentali per la registrazione extracellulare neurale in piccoli animali^1,2,3. In primo luogo è stato lo sviluppo del tetrodo, un fascio di quattro microwires utilizzato per registrare l'attività neurale di neuroni simultaneamente^1,2,4. Le ampiezze del segnale differenziale di attività attraverso i quattro canali di un tetrodo consente l'isolamento dell'attività di singoli neuroni da molte cellule contemporaneamente registrato⁵. Inoltre, la natura flessibile del microwires consente una maggiore stabilità del tetrodo riducendo al minimo lo spostamento relativo tra il tetrodo e la popolazione delle cellule bersaglio. Tetrodi ora sono ampiamente usati invece di un singolo elettrodo per molti studi di cervello in varie specie, tra cui roditori^1,2,6, primati⁷e⁸di insetti. In secondo luogo lo sviluppo di un hyperdrive trasportava tetrodi indipendentemente mobili multiple, che consente il monitoraggio simultaneo di attività neurale da più grandi popolazioni di neuroni da più posizioni di registrazione^{3, 9,10,11,12}.

La disponibilità di un dispositivo di registrazione multi-tetrodo affidabile e conveniente per piccoli animali è limitata. L'iperguida classico, inizialmente sviluppato da Bruce McNaughton¹³, è stato utilizzato con successo per le registrazioni neurale a comportarsi liberamente ratti in molti laboratori nel passato due decenni^{9,10,14, 15}. Tuttavia, per motivi tecnici, i componenti originali necessari per costruire l'unità McNaughton ora sono molto difficili da ottenere e non sono compatibili con le interfacce di acquisizione dati recentemente migliorata. L'altro disegno ben accettato di hyperdrive richiede i Microdrive per essere individualmente fatti a mano, che potrebbe produrre risultati incoerenti e consumano consistente lasso di tempo¹². Al fine di registrare l'attività neurale da varie regioni del cervello in ratti si comporta, abbiamo sviluppato una nuova iperguida utilizzando la tecnologia stereolithographic. Abbiamo cercato di soddisfare i seguenti requisiti: (1) la nuova iperguida deve consentire lo spostamento preciso del tetrodi nel cervello e fornire registrazione stabile da più aree della destinazione; (2) l'iperguida nuovo deve essere compatibile con il sistema magnetico quickclip recentemente sviluppato per consentire la facile connessione; e (3) l'iperguida nuovo possa essere riprodotte fedelmente con materiali facilmente disponibili. Qui, forniamo una tecnica per la costruzione dell'iperguida 3D-stampabile contenente diciotto tetrodi indipendentemente mobili, basati sul disegno McNaughton. Nel protocollo, descriviamo i dettagli del processo di fabbricazione dell'iperguida nuovo, che abbiamo usato con successo per registrare potenziali di azione di singoli neuroni e potenziali di campo locale dalle cortecce entorinale postrinale e mediale nelle settimane in un liberamente comportamento del ratto durante le attività di foraggiamento naturale.

Protocol

1. stereolitografia di modelli 3D

1. Utilizzare tecniche stereolithographic per stampare le parti di hyperdrive e accessori. Ogni hyperdrive è composto da diciotto navette, diciotto navetta bulloni e uno ciascuno di tutti gli altri pezzi di plastica (Figura 1).
   Nota: Gli accessori non fanno parte dell'iperguida ma sono necessari per la costruzione di iperguida.

2. preparazione degli accessori (Figura 2).

1. Preparazione del rack microdrive (Figura 2).
   1. Pulire ed espandere i fori più piccoli e i più grandi fori ciechi nel rack con una punta di ø 0.71 mm (0.028") e un ø 0,84 mm (0,033") trapano, rispettivamente.
   2. Tagliate un asta di saldatura di 0,89 mm (0,035") ø 17 mm segmenti lunghi, turno entrambe le estremità e inserire ogni asta di guida il ø 0,84 mm (0,033") fori sul rack, lasciando 11,5 mm all'esterno (a filo con le barre filettate).
   3. Inserire completamente sei 0-80 filettato, 15,88 mm (5/8") viti a testa piatta lunga giù nelle fessure del rack. Garantire che i coni retinici di guida e barre filettate sono dritti e paralleli tra loro. Riempire lo spazio rimanente nelle fessure con cemento dentale diluito. Aria secca su un benchtop per 15 min.
   4. I coni retinici di saldatura per colla e viti nel rack con sottile super colla e asciugare all'aria per 15 min.
2. Preparazione della stazione base (Figura 2E).
   1. Infilare i quattro fori con un rubinetto 2-56 e utilizzare 2-56, 4,76 mm (3/16") lungo nylon viti per fissare il nucleo della stazione, se necessario.
3. Preparazione dell'utensile di tornitura (Figura 2F).
   1. Filettatura del foro sul manico con un tap 4-40. Inserire la punta lavorata nello slot nel manico e fissarlo con una vite di tazza lunga 4-40, 4,76 mm (3/16").
4. Preparazione del titolare hyperdrive (Figura 2).
   1. Filettatura del foro della vite con un colpetto di 8-32. Utilizzare una vite a testa zigrinata in nylon lunga 8-32, 9,52 mm (3/8") per proteggere l'iperguida quando è in uso.
5. Preparazione dell'asta posizionamento complesso (Figura 2 H).
   1. Infilare il gambo dal lato con il foro più grande (in alto) con un colpetto di 8-32 ad una profondità di circa 7 mm. Thread i fori più piccoli (sei in alto, a diciotto anni in fondo) con un tocco di 0-80. Allargare il foro centrale nella parte superiore con una punta di trapano ø 4,76 mm (3/16"), se necessario.
   2. Montare l'attacco manubrio verso l'alto, utilizzando un 8-32, ø 4,76 mm (3/16"), 6,35 mm (1/4") a tracolla lunga vite. Fissare la parte inferiore verso l'alto con 0-80, 6,35 mm (1/4") viti lunghe quando è in uso.

3. preparazione dei componenti del Hyperdrive (Figura 3).

1. Preparazione del dado hyperdrive (Figura 3A).
   1. Utilizzando il supporto di dado (Figura 2D), avvitare il dado con un 3/8-24 maschio finitore fino a che liscio.
2. Assemblea del nucleo hyperdrive (Figura 3B).
   1. Pulire ed espandere i fori nel nucleo utilizzando punte di dimensioni diverse (dodici terra filo fori passanti (anello interno): ø 0,61 mm (0,024"); i diciotto tetrodo fori (anello intermedio): ø 0,66 mm (0,026") prima e poi ø 0.71 mm (0.028 "); le diciotto asta di guida fori ciechi (anello esterno): ø 0,84 mm (0,033")).
   2. Infilare i due fori sulla parte superiore il nucleo e i cieco-fori rimanenti otto (quattro sul lato, quattro nella parte inferiore) con un tocco di 0-80. Utilizzare un finitore per i fori ciechi.
   3. Creare filettature esterne alla base del nucleo usando un dado 3/8-24. Regolare correttamente il dado quindi il dado di hyperdrive si adatta sopra le nuove discussioni.
   4. A seconda del numero di terra fili desiderato, inserire più segmenti lunghi 6 mm di tubi di metallo 23 gauge (cannule) nei fori del filo di terra nel nucleo, incollandoli se necessario. Le estremità delle cannule di filo di terra del file finché non si blocca con l'esterno del nucleo e pulire le cannule con un filo di 0,30 mm (0.012") in acciaio ø.
   5. Inserire completamente diciotto 0-80, 15,88 mm (5/8") testa di viti a testa piatta lunga giù nelle fessure nel nucleo. Non piegare le viti o danneggiare le filettature durante questo processo.
   6. Usando il bastone posizionamento complesso e la stazione base, posizionare diciotto segmenti di 17 mm di ø 0,89 mm (0,035") asta di saldatura sopra i fori di guida asta nel nucleo e li batti giù per essere a filo con le viti (circa 5 mm).
   7. Correggere le posizioni delle barre di saldatura e viti, se necessario, quindi serrare la vite centrale e le sei viti circostanti del tondino posizionamento complesso per garantire le indicazioni verso l'esterno delle aste nel nucleo. Avvitare il dado il nucleo (con l'asta di posizionamento complesso) e forma il nucleo nel supporto hyperdrive per consentire un più facile posizionamento sotto uno stereoscopio.
   8. Riempire le fessure con cemento dentale diluito per fissare le viti al nucleo e permettere all'aria di essiccazione per 15 min. riempimento di 2-3 slot in un momento prima il cemento dentale diventa troppo spessa. Raschiare via qualsiasi cemento dentale in eccesso sul nucleo di mantenere una misura adeguata con lo scudo.
   9. Incollare le viti e barre nel nucleo con colla super sottile, permettono all'aria di essiccazione per 15 min.
3. Assemblea del microdrive (Figura 3).
   1. Pulire ed espandere i due fori esterni in navetta con punte da trapano (foro più piccolo: trapano 0,61 mm (0,024") ø bit; foro più grande: ø 0,89 mm (0,035") punta da trapano).
   2. Inserire il bullone di navetta nel bullone supporto base. Prestare attenzione all'orientamento. Nelle vicinanze il coperchio del supporto di bullone, tenere saldamente e lentamente attraverso il foro nel coperchio del filetto con un tocco di 0-80. Toccare 2 - 3 volte fino a che liscio.
   3. Inserire il bullone di navetta la navetta dal lato con l'apertura più piccola. Posto il navetta-shuttle bullone complesso a testa in giù nella stazione di assemblaggio di microdrive base.
   4. Tagliare un segmento di 15 mm di tubi di metallo 23 gauge e liscia entrambe le estremità, quindi posizionare il tubo sopra il foro ø 0,61 mm (0,024"), guidato dall'asola sulla stazione di coperchio. Martello la cannula nel buco fino a quando l'estremità superiore è a filo con la stazione di coperchio.
   5. Rimuovere la metà esterna dell'estremità superiore della cannula con una ruota di levigatura. Pulire la cannula con un filo di metallo ø 0,30 mm (0.012"). Incollare la cannula su shuttle usando colla super sottile, facendo attenzione a non incollare il bullone di navetta per la navetta e aria secca per 15 min.
   6. Preparare almeno diciotto Microdrive, testare il microdrive sul rack microdrive. Assicurarsi che il bullone di navetta può ruotare senza intoppi in navetta e che il microdrive intero si muove liberamente lungo la lunghezza della barra filettata.
4. Preparazione della colonna centrale (Figura 3D).
   1. Carteggiare la parte superiore e inferiore della colonna centrale fino al piatto, se necessario. Infilare i due fori nella colonna centrale con un tocco di 0-80. Inserire un dado esagonale 0-80 (3,18 mm (1/8") di larghezza, 1,19 mm (3/64") alta) in ogni slot.
5. Preparazione della PAC hyperdrive (Figura 3E).
   1. Utilizzando forcipe amagnetico, colla quattro magneti (3 mm di diametro, 1 mm di spessore) in quattro pozzi, abbinandoli ai poli N e S sulla scheda di interfaccia di elettrodo.
6. Assemblea delle cannule di guida in un fascio (Figura 3F).
   1. Posto diciotto 30 gauge, cannule di parete sottile (ID 0,19 mm, 0.0075") in ø 2,29 mm (0.09") degli strizzacervelli di calore tubi (3-5 mm di lunghezza, distanziati lungo il bundle di 5-10 mm). Fare tutte le cannule a filo uno con l'altro su un'estremità del fascio.
   2. Compattare i tubi termorestringenti usando una pistola di calore fino a quando il fascio è stretto. Spremere il bundle delicatamente per modellarlo come desiderato (rotondo o ovale). Confermare che tutte le cannule sono nelle posizioni corrette con nessun torcimento, incrocio, o flessione.
   3. Contrassegnare la zona per la saldatura sulle cannule. La parte dissaldata dovrebbero essere 26 mm in lunghezza, mentre la parte saldata dovrebbero essere 5-10 mm. mossa il restringimento tubi per i segni di saldatura per impedire lo spargimento.
   4. Applicare flusso ad una sola area di saldatura e di saldatura durante la rotazione il bundle. Raffreddare a temperatura ambiente per almeno 1 min. Ripetere questo passaggio per saldare la stessa zona altre due volte. Liscia la parte saldata saldando senza applicare materiale di flusso e filler. Raffreddare a temperatura ambiente per almeno 1 min.
   5. Tagliare il bundle alla lunghezza corretta con un disco diamantato alla massima velocità, polacco entrambi finisce per regolare la lunghezza (dissaldato parte: 26 mm, saldato parte: 5-10 mm come desiderato). Pulire le cannule di guida con un filo metallico di 0,18 mm (0,007") ø sotto uno stereoscopio.
7. Preparando i tetrodi. Procedure simili sono state descritte^8,16,17 .
   1. Regolare l'altezza della barra di T orizzontale e la posizione dell'agitatore magnetico, in modo che il braccio orizzontale sulla Croce della barra di T è direttamente sopra il centro dell'agitatore magnetico. Collegare un'estremità di un gancio a S al centro di una piccola ancoretta magnetica, quindi incollarli insieme. Pulire il tetrodo facendo spazio con aria compressa e salviettine imbevute di etanolo.
   2. Le estremità di un pezzo di singola tetrodo cerchio i due legare insieme circa 40 cm di lunghezza, quindi fissare con un pezzo di nastro di rame.
   3. Sollevare il cerchio filo tenendo il nastro di rame. Posizionare l'estremità opposta del nastro di rame sul braccio orizzontale della barra di T. Abbassare il nastro di rame delicatamente (mentre l'altra estremità è ancora sulla barra T), una volta di torsione e posizionare il nastro di rame sulla barra T. Il cerchio di tetrodo è ora in una configurazione di figura otto ("∞") con il nastro di rame che si siede in cima alla Croce della barra orizzontale.
   4. Tenere il nastro di rame sulla barra T con una mano, delicatamente. Con l'altra mano, agganciare l'estremità libera del gancio a S (con scalpore magnetico collegato a altra estremità) attraverso la parte inferiore del cerchio filo tetrodo, rilasciare delicatamente il gancio a S e lasciarlo a raddrizzare i quattro fili dal peso del gancio S.
   5. Regolare l'altezza della barra orizzontale fino a quando la parte inferiore del S-gancio è circa 1 cm sopra il centro della piastra agitatore magnetico.
   6. Piegare il bordo del nastro rame verso il basso per fissarlo alla barra orizzontale. Esaminare i quattro fili dritto tetrodo ad occhio, quindi rimuovere eventuali detriti.
   7. Accendere l'agitatore torsione i quattro fili ad una velocità di circa 60 giri/min, fino a quando l'angolo tra i due fili torti opposti è di circa 60°.
   8. Impostare il decapatore termico a 210 ° C e i fili intrecciati di calore da spazzare la pistola lungo la lunghezza diritta dei fili da diverse angolazioni per 2min per fonderli insieme fondendo il cappotto di legame VG.
   9. Sollevare il gancio a S con mescolare delicatamente e tagliare l'estremità inferiore del tetrodo con forbice.
   10. Tenere il nastro di rame sulla barra orizzontale con un dito, tagliare i fili da entrambi i bordi del nastro di rame con le forbici e rimuovere il nastro di rame. Tagliare il filo rimanente sulla barra orizzontale per rilasciare il tetrodo.
   11. Posto il tetrodo completato in una scatola di polvere per deposito. Preparare almeno venticinque tetrodi.

4. montaggio dell'iperguida (Figura 4).

1. Inserire le cannule di guida il nucleo di hyperdrive (Figura 4A).
   1. Rimuovere i tubi termorestringenti e far scorrere un segmento di 4 mm di tubo in silicone (ID 1,02 mm (0.04"), OD 2,16 mm (0,085")) lungo il bundle al bordo saldato/dissaldato. Cuneo la fessura nel distanziale hyperdrive per allargare il foro centrale, permettendo il distanziatore per scivolare attorno al tubo di silicone. Rimuovere il cuneo quando il distanziatore si siede al centro del tubo in silicone.
   2. Organizzare le posizioni delle cannule di guida nel bundle inserendo segmenti lunghi (10 cm) di filo metallico ø 0,18 mm (0,007") attraverso ogni cannula in un buco di tetrodo specifico nel nucleo hyperdrive, impedendo qualsiasi incrocio dei fili o cannule nel processo. Piegare le estremità dei fili per tenerli in luogo.
   3. Spingere le cannule attraverso i rispettivi fori nel nucleo, facendo attenzione ad evitare la flessione o incrocio tra di loro, fino a quando l'estremità libera di ogni cannula è esterno l'estremità superiore del foro tetrodo almeno 2 mm. Fissare il distanziale avvitando il dado sul nucleo, facendo attenzione a impedire il distanziale di rotazione. Applicare una goccia di cemento dentale molto diluita dalla parte superiore del nucleo sull'incrocio tra le cannule per garantire la loro posizione relativa.
   4. Tagliare la guida fili dall'estremità saldata del bundle e rimuoverli dalle cannule ritraendo dall'estremità libera.
2. Assemblea del Microdrive sull'iperguida Core (Figura 4B). Una disposizione spaziale dettagliata di Microdrive nell'iperguida è stato descritto in precedenza^11,13.
   1. Caricare i Microdrive lentamente e con attenzione su ogni asta filettata del nucleo. Confermare che (1) il 23 gauge microdrive cannula senza intoppi nel foro tetrodo, (2) il 30 gauge cannula guida va dentro il 23 gauge microdrive cannula senza intoppi, e (3) il bullone di fissaggio navetta gira senza intoppi lungo l'asta filettata. Avvitare i Microdrive fino a 1,0-1,5 mm sopra l'estremità inferiore delle barre filettate.
   2. Tagliare diciotto pezzi di tubazione di polyimide (ID 0,11 mm (0,0045"), OD 0,14 mm (0.0055")) in segmenti di 38-43 mm (lunghezza del bundle cannula Guida plus 7 mm). Pulire ogni tubo con un filo di 0,08 mm (0.003") in acciaio ø.
   3. Invertire il nucleo, inserire i tubi di polyimide attentamente le cannule di guida dall'estremità saldata e spingerli a tutti il modo in sotto uno stereoscopio. Capovolgere il nucleo in posizione verticale e colla l'estremità superiore del tubo polyimide sulla cannula microdrive con colla super spessa. Posizionare il nucleo a testa in giù e lasciato asciugare la colla per 15 min.
   4. Tagliare il polyimide supplementare della tubazione all'estremità superiore, lasciando 0.5-1.0 mm fuori la cannula microdrive.
3. Assemblaggio dei fili terra (Figura 4).
   1. Tagliare il numero di fili di terra necessari a lunghezze di 25-30 mm dal filo di acciaio rivestito (rivestito ø 0,20 mm (0.008"), nudo ø 0,13 mm (0,005")). Striscia 2 mm dell'isolamento in plastica da entrambe le punte dei fili e inserirne l'estremità di ciascuno nelle estremità delle cannule lunghe 30 gauge 6-8 mm. Appiattire le estremità di cannule per proteggere la connessione al loro rispettivi cavi.
   2. Utilizzare un utensile Dremel per tagliare le cannule a metà per creare due fili di terra completo da ogni.
   3. Inserire l'estremità rotonda della cannula 30 gauge nell'estremità superiore della cannula di filo di terra nel nucleo e premere per rendere l'inserimento stretto.
4. Montaggio della scheda di interfaccia di elettrodo (Figura 4).
   1. Inserire la colonna centrale nel nucleo e fissarlo con due 0-80, viti a brugola 7,94 mm (5/16") lungo. Colla se necessario per rendere la colonna centrale costante nel nucleo.
   2. Espandere le porzioni degli slot nel Consiglio di bei-72-QC-grande che corrispondono ai due fori filettati nella colonna centrale con rubinetto ø 1,2 mm. Collegare la scheda di interfaccia di elettrodo alla colonna centrale con due 0-80, viti a testa troncoconica lunga 3,97 mm (5/32"). Assicurarsi che la scheda si trova nel centro ed è sicura.
5. Per collegare i cavi di terra (Figura 4E).
   1. Itinerario ogni filo di terra intorno alla colonna centrale e collegare l'estremità libera esposta alla scheda di interfaccia elettrodo con una spilla d'oro presso il foro di terreno designato.
6. Caricamento i tetrodi nell'iperguida, come precedentemente descritto ^{16 , 17} .
   1. Caricare ogni tetrodo accuratamente i tubi di polyimide di Microdrive, facendo attenzione a non piegarle durante il processo.
   2. Delicatamente mangimi i fili estremità libera nei loro fori designati nell'interfaccia elettrodo a bordo e li collegano elettricamente con pin dorati.
   3. Tagliare i tetrodi individualmente alla lunghezza corretta. Confermare che la parte di tetrodi sporgenti dall'estremità inferiore dei tubi polyimide dopo il taglio è dritta, altrimenti sostituire l'intero tetrodo e remix.
7. Associare lo scudo.
   1. Fissare lo scudo al nucleo utilizzando quattro 0-80, 3,97 mm (5/32") viti a testa troncoconica. I numeri sullo scudo devono corrispondere con i numeri sulla scheda di interfaccia di elettrodo.
8. I suggerimenti di tetrodo di placcatura.
   1. Piastra le punte di tetrodi utilizzando il dispositivo di placcatura di NanoZ dotato di un connettore ADPT-NZ-bei-36 e un adattatore di ADPT-EIB-72-QC-HS-36¹⁷. In alternativa, impiattatelo manualmente uno ad uno come descritto altrove¹⁶. Piastra del tetrodo consigli prima dell'uso (ad es., un giorno prima dell'impianto), come impedenza aumenterà gradualmente nel tempo dopo il placcaggio. Sostituire i tetrodi che sono in corto o ostruito durante il processo di placcatura, tagliarli a una lunghezza adeguata e ri-piastra.
9. Finalizzare l'iperguida (Figura 4F).
   1. Incollare i tetrodi ai loro tubi di polyimide come precedentemente descritti¹⁶. Ritrarre tutti loro indietro nella loro cannule di guida così le punte placcate non sono esposti.
   2. Avvitare viti lungo quattro 0-80, 6,35 mm (1/4") nei quattro fori nella parte inferiore del nucleo hyperdrive.
   3. Utilizzando uno stereoscopio, abbassare ogni tetrodo lentamente fino a quando la punta del tetrodo è appena sopra il bordo della cannula guida. Nel frattempo, individuare la posizione di ogni tetrodo in bundle il cannula di guida. La mappa della posizione di tetrodo è fondamentale per la ricostruzione dei siti di registrazione.
   4. Fissare il tappo alla unità e memorizzare l'iperguida correttamente per l'impianto.

Representative Results

Abbiamo utilizzato un hyperdrive recentemente costruito per ottenere risultati di prova. L'unità era dotata di tetrodi costruiti da ø 17 µm (0,0007"), filo di polyimide-rivestito platino-iridio (90% - 10%). Le punte dei tetrodi erano placcate in platino nero soluzione per ridurre le impedenze elettrodo a tra 100 e 200 kΩ a 1 kHz. L'iperguida è stato impiantato 4,6 mm a sinistra della linea mediana e 0,5 mm anteriore il seno trasversale sul cranio di un 550 g, ratto maschio lungo Evans. Messa a terra supplementare sono stati collegati alle viti del cranio sopra il cervelletto. Tutte le procedure sono state eseguite, approvati dagli istituzionali Animal Care ed uso Committee (IACUC) del Baylor College of Medicine ed erano simili a quelli descritti in precedenza¹⁸. Subito dopo l'impianto chirurgico, i tetrodi sono stati avanzati 1 mm nel cervello. Nei giorni successivi, sono stati utilizzati più piccoli incrementi di avanzata di non più di 80 µm. I tetrodi furono autorizzati a stabilizzarsi dopo ogni avanzamento per almeno 20 ore prima neurale registrazioni sono state eseguite.

Per registrare l'attività neurale, l'iperguida è stato collegato ad un pre-amplificatore headstage (Neuralynx, HS-72-QC), e quest'ultimo è stato collegato ad un sistema di acquisizione dati con amplificatori programmabili (Neuralynx, Digital Lynx SX). Potenziali di campo locale si sono riferiti al filo di massa, alla 2 kHz, e passa-banda filtrati a 0,1 — 500 Hz. attività dell'unità è stato fatto riferimento a un tetrodo con nessuna attività osservabile situato 500 µm dalla superficie del cervello, campionata a 32 kHz e filtrata a passa-banda 600 Hz - 6 kHz. Sono state registrate solo spike di forme d'onda sopra una soglia di 50 µV.

Figura 5A illustra attività neurale registrata da un tetrodo situato nella corteccia postrinale (2,1 mm sotto la superficie del cervello), mentre l'animale è stato liberamente foraggiamento all'interno di un 1,5 m Aprire casella tre settimane dopo l'impianto. La sessione di registrazione durata circa 30 min e le unità registrate è rimasto stabile in tutta l'intera sessione (dimostrato dalla piccola variazione di forme d'onda di picco). Figura 5B Mostra potenziali di campo locale registrati contemporaneamente da quattro differenti tetrodi situati nella corteccia entorinale mediale (3,4-3,7 mm di profondità) mentre lo stesso animale stava attivamente esplorando all'open arena sette settimane dopo l'impianto. Attività potenziali di campo chiaro nella gamma di frequenza theta (6-10 Hz) era presente. Dati di picco del singolo neurone è stati isolati utilizzando il software ordinamento MClust (A.D. Redish), e dati potenziali di campo locale è stati visualizzati da custom-scritto script Matlab. Esempi di registrazioni di tetrodo di bassa qualità, eventualmente risultanti da un'unità mal preparata, sono stati indicati in precedenza¹⁷.

Figura 1: Hyperdrive componenti creati dalla tecnologia di stereolithographic. Immagine dei componenti 3D-stampabile hyperdrive (moneta 1¢ per il confronto dimensioni). (A), il nucleo di hyperdrive; (B), lo scudo protettivo; (C), il cappuccio di protezione; (D), la colonna centrale; (E), il dado; (F), il distanziale; (G), la navetta; (H) il bullone di navetta. Barra della scala: 1 cm. Questi componenti sono stati creati da una stampante di UnionTech RSPro450 utilizzando il materiale plastico Somos evolvere 128. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: accessori personalizzati per la costruzione di hyperdrive. Questi accessori sono stati progettati specificamente per aiutare nella preparazione dell'iperguida. Loro componenti principali sono stati creati da stereolithographic stampa. (A) il titolare di bullone di navetta, che fissa il bullone di navetta mentre toccando i thread. Stazione (B) l'Assemblea microdrive, che guida l'inserimento della cannula nella navetta. (C) il microdrive cremagliera, che consente di testare i Microdrive assemblati e li mantiene in posizione durante l'incollaggio le cannule. 1: una base di rack microdrive; 2: un rack di microdrive con viti completamente inserite negli slot; 3: un rack di microdrive pronto per l'uso. (D) titolare del dado, che detiene il dado hyperdrive quando filettare il foro. Stazione (E), il nucleo di hyperdrive, che protegge il nucleo mentre martella le barre di guida. (F) l'utensile di tornitura, che aziona il bullone di navetta per ruotare in navetta. (G) il titolare di hyperdrive, che aiuta a collocare l'iperguida sotto uno stereoscopio. Il titolare inoltre protegge i tetrodi dopo che sono stati caricati nell'iperguida. (H) l'asta posizionamento complesso, che aiuta a posizionare le barre filettate e guidare canne nel nucleo hyperdrive. 1: principali componenti del complesso; 2: la parte superiore del complesso dopo il montaggio; 3: una canna posizionamento complesso in uso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: preparazione dell'iperguida parti prima dell'assemblaggio. Immagini che mostrano il processo di preparazione del nucleo di hyperdrive e il microdrive, come pure altri hyperdrive parti preparate. (A) A filettato hyperdrive dado. (B) preparazione del nucleo hyperdrive. 1: il nucleo con filettature esterne create per il dado; 2: il nucleo inserito in una stazione di base con viti completamente inserite negli slot; 3: Guida aste posizionati la verga posizionamento complesso, pronto a essere martellato nel nucleo; 4: riempire lo spazio rimanente negli slot con cemento dentale diluito; 5: parte superiore di un nucleo di hyperdrive preparati. (C) preparazione di microdrive. 1: un bullone di navetta collocato in una navetta bullone titolare, nota di base l'apertura più piccola è rivolto verso lo sperimentatore; 2: infilatura del filo all'interno dell'otturatore di navetta; 3: inserimento della navetta bullone in navetta; 4: un microdrive collocato nella stazione di assemblaggio di microdrive base con la cannula guidata dal coperchio stazione, pronto per essere inserite; 5: un microdrive con l'esterno la metà della punta della cannula superiore rimosso (indicato dalla freccia); 6: assemblati microdrives testato su rack microdrive. (D), una colonna centrale con fori filettati e dadi inseriti. (E) A cap hyperdrive con quattro magneti incollati nei pozzetti. Bundle di cannula in Guida (F) A 36 mm di lunghezza, con la parte saldata sulla sinistra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: montaggio dell'iperguida. Immagini che mostrano le fasi di montaggio l'iperguida. Inserimento nel nucleo (A) le cannule di guida. 1: il bundle di cannula guida scivolata il tubo in silicone e il distanziale; 2: cannula una guida essendo collocato nel suo apposito foro nel nucleo. Scrittura della mano viene illustrata l'organizzazione della Guida cannule; 3: Guida cannule ha spinti il nucleo; 4: il nucleo con le cannule di guida inserito e bloccato dal dado. (B) montaggio del Microdrive al nucleo. 1: il nucleo con Microdrive caricati; 2: i Microdrive con polyimide tubi inseriti nelle cannule. (C) inserimento dei fili terra nel nucleo. (D) allegato della scheda di interfaccia di elettrodo. 1: l'hyperdrive con la colonna centrale inserita; 2: l'hyperdrive con scheda di interfaccia di elettrodo collegato alla colonna centrale. (E) collegamento del cavo di terra per l'apposito foro nella scheda di interfaccia di elettrodo. (F) un finalizzato hyperdrive pronta per l'impianto (20 g di peso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: segnali neurali registrati dall'iperguida. Rappresentante registrazioni risultati attività neurale unità e campo locale potenziale nel cervello di un topo si comporta. Cluster bidimensionale (A) diagrammi illustranti picchi individuali da parte dei neuroni simultaneamente registrate da un tetrodo situato nella corteccia postrinale (profondità: 2.1 mm). Sinistra: scatter plot che mostrano la relazione tra picco-picco ampiezze dei picchi registrati da due elettrodi del tetrodo. Ogni punto corrisponde ad uno spuntone. Cluster di picchi sono probabile che provengono dalla stessa cellula. Quattro grappoli sono codificati a colori. Barra della scala: 20 µV. A destra: spike forme d'onda (mezzi ± S.D.) delle cellule con codifica a colori sulla sinistra. Notare la piccola variazione delle forme d'onda. Barra della scala: 200 µs. (B) tracce di campo locale potenziale nella gamma di frequenza theta registrati contemporaneamente da quattro differenti tetrodi situati nella corteccia entorinale mediale (profondità: 3.4-3.7 mm) quando il ratto era liberamente foraggiamento. Barra della scala in basso a sinistra: 500 µV; barra della scala in basso a destra: 100 ms. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementari: I file supplementari includono 20 file nel formato. STL dettagliare i componenti di hyperdrive e accessori pronto per stereolithographic stampa (unità in mm), e 1 file in formato. pdf che è il modello di utensile di tornitura suggerimento pronto per la lavorazione. I file di modello 3D originale sono stati creati con il software AutoCAD in formato DWG, che sarà disponibile su richiesta. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Qui, descriviamo il processo di costruzione di una nuova concezione hyperdrive composto da diciotto tetrodi indipendentemente mobili. L'unità può essere costruito da conveniente pezzi acquistati presso molti negozi di hardware disponibile, combinati con componenti creati da stereolithographic stampa. L'iperguida possa essere cronicamente impiantato sul cranio di un topo utilizzando le procedure chirurgiche standard ed è in grado di registrare l'attività neurale extracellulare mentre l'animale esegue varie attività comportamentali.

L'iperguida conserva molte delle caratteristiche desiderabili dell'iperguida McNaughton originale, tra cui i Microdrive treppiede che sono orientati verso l'esterno di 30 gradi dalla unità centro¹³, che fornisce un supporto affidabile per i tetrodi. Una volta impiantato, l'iperguida permette l'esecuzione di piccoli movimenti di tetrodi all'interno del cervello di un animale sveglio con notevole precisione. Un giro completo di un servizio navetta su barra filettata corrisponde ad uno spostamento lineare del 317.5 µm. Con una formazione adeguata, uno sperimentatore può avanzare una navetta in passi di 1/16 Disabilita (20 µm). Abbiamo progettato l'iperguida per uso in ratti adulti, ma l'unità potrebbe essere facilmente utilizzato in qualsiasi animale con una dimensione corporea di 350g o maggiore (limitata dalla dimensione della testa). Una limitazione del dispositivo può essere osservata nella profondità con restrizioni di registrazione, come la lunghezza della corsa massima di tetrodi lungo le aste filettate è circa 7 mm, che potrebbe cadere a corto di strutture più profonde nel cervello di alcuni animali.

Stereolithographic stampa prevede una risoluzione sufficiente per creare componenti plastici in grande dettaglio con la massima fedeltà e precedentemente è stata usata in hyperdrive fabbricazione^12,19,20. In questo caso, è stata utilizzata una stampante industriale comunemente disponibile attraverso impianti di produzione di terze parti. Lì tutti i componenti di hyperdrive sono stati stampati precisamente, tra cui il nucleo di hyperdrive, nonostante la sua geometria complessa e le piccole strutture come il ø 0,6 mm attraverso i fori e le pareti sottili di 0,3 mm. Questa precisione rende la scelta ideale per la produzione di componenti di hyperdrive stereolitografia. Basato su esperienze pregresse, meno costose, desktop 3D stampanti sono meno probabile di avere la precisione necessaria per la riproduzione affidabile l'hyperdrive componenti necessari. Ancora, la tecnologia stereolithographic ha i suoi limiti. In primo luogo, ha una selezione limitata di materiali. La plastica che abbiamo scelto per l'iperguida era più durevoli di quelli che abbiamo testato, ma è ancora non ottima per la fabbricazione di pezzi molto piccoli. Le navette e i bulloni di navetta devono essere maneggiata con estrema cautela perché possono rompersi durante la preparazione. I componenti in plastica non sono autoclavabili, come la temperatura di deviazione di calore del materiale è di circa 50 ° C. Inoltre, il materiale di stampa utilizzato non è resistente all'acetone. Questi problemi potrebbero essere risolti quando nuovi materiali di stereolitografia sono sviluppati e testati. Ancora, considerando i costi relativamente bassi di stereolitografia, i vantaggi della tecnica e costi superano di gran lunga i difetti. In secondo luogo, a causa della natura di stereolitografia, durante il quale fotopolimeri fotochimico sono solidificati da un laser UV per formare un singolo strato del modello 3D desiderato²¹, gli oggetti creati da stereolithographic stampa sono vulnerabili alla luce UV. Di conseguenza, esponendoli ai forti raggi UV (ad es., luce solare diretta) per molte ore irreversibilmente ridurrà loro forza fisica (basata su comunicazione personale con il negozio di stampa). Considerando l'UV ambientale nello spazio laboratorio (per esempio, dalle luci fluorescenti), si consiglia di conservare i componenti di stereolithographic in una scatola scuro quando non in uso, che manterrà la forza fisica dei componenti per anni. Inoltre, è importante utilizzare altri metodi oltre a luce UV per disinfettare la superficie hyperdrive prima della chirurgia. Questa prova hyperdrive è rimasto impiantato sul ratto in buone condizioni in un ambiente di laboratorio ordinarie nel corso di quattro mesi, senza alcuna indicazione di una riduzione della forza fisica o prestazioni.

La natura 3D stampabile di questo hyperdrive consente inoltre modifiche rapide e flessibili riprogettazione. Ad esempio, l'iperguida può essere facilmente modificata per destinazione separati più cervello regioni¹¹. Inoltre, questa unità può essere regolata per consentire il monitoraggio simultaneo di attività neurale e manipolazione di cervelli locali. Incorporazione di una sonda per Microdialisi con la matrice di tetrodi permette farmacologica attivazione e disattivazione dei neuroni dall'infusione di varie droghe durante registrazione neurali²². Inoltre, i neuroni ingegnerizzati per canali express sensibili alla luce possono essere attivati o disattivati dall'incorporazione di una fibra ottica a tetrodo bundle e optogenetica tecnica¹⁹. Inoltre, l'unità può essere facilmente ridimensionato con un minor numero di tetrodi per gli animali con la testa più piccole, come topi o ratti giovani.

In sintesi, la mutevolezza facile accoppiato con il metodo più semplice, più accessibile della costruzione di un impianto di registrazione neurali efficace che può essere riprodotto in modo affidabile e preciso, fa questo hyperdrive uno strumento potente nel campo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Welding rod	Blue Demon	ER308L-035-01T	Stainless steel, 0.035" in diameter
Screw	McMaster	91771A060	Stainless steel, flat head, 0-80 thread, 5/8" in length
Screw	McMaster	91772A051	Stainless steel, pan head, 0-80 thread, 5/32" in length
Screw	McMaster	92196A056	Stainless steel, socket head, 0-80 thread, 5/16" in length
Screw	McMaster	92196A055	Stainless steel, socket head, 0-80 thread, 1/4" in length
Screw	McMaster	95868A131	Nylon,  socket head, 2-56 thread, 3/16" in length, black
Screw nut	McMaster	90730A001	Stainless steel, narrow hex,  0-80 thread
Shoulder screw	McMaster	90298A213	Stainless steel, 8-32 thread, 3/16" in diameter, 1/4" in length
Cup screw	McMaster	92313A105	Stainless steel, 4-40 thread, 3/16" in length
Thumb screw	McMaster	94323A592	Nylon, 8-32 thread, 3/8" in length, black
Magnet	Apex	M3X1MMDI	Neodymium, 3 mm X 1 mm disc
Metal tubing	Small Parts	B00137QHNS	Stainless steel, 23 gauge, 0.0253" OD, 0.013" ID, 0.006" wall
Metal tubing	New England Small Tube	Custom-made	Stainless steel, 30 gauge, 0.012/0.0125" OD, 0.007/0.008" ID, full hard
Heat-shrink tubing	McMaster	7856K72	0.09" ID before shrinking, blue
Silicone tubing	A-M Systems	807300	0.040" ID, 0.085" OD
Polyimide tubing	A-M Systems	823400	0.0045" ID, 0.0005" wall
Ground wire	A-M Systems	791500	0.005" bare, 0.008" coated, half hard
Tetrode wire	California Fine Wire	Custom-made	0.0007" in diameter, platinum-iridium (90%-10%), HML and VG coating
EIB	Neuralynx		EIB-72-QC-Large
Gold pins	Neuralynx		large EIB pins
Tap	Balax	01302-000	M1.2 thread size
Tap	McMaster	2522A811	0-80 thread size, bottoming
Tap	McMaster	2522A771	0-80 thread size, plug
Tap	McMaster	26955A94	3/8"-24 thread size, bottoming
Tap	McMaster	2522A713	2-56 thread size
Tap	McMaster	2522A715	4-40 thread size
Tap	McMaster	2522A718	8-32 thread size
Die	McMaster	2576A457	3/8"-24 thread size, 1" OD
Drill bit	McMaster	30585A82	Wire gauge 65, 0.035" in diameter
Drill bit	McMaster	30585A83	Wire gauge 66, 0.033" in diameter
Drill bit	McMaster	30585A87	Wire gauge 70, 0.028" in diameter
Drill bit	McMaster	30585A88	Wire gauge 71, 0.026" in diameter
Drill bit	McMaster	30585A91	Wire gauge 73, 0.024" in diameter
Drill bit	McMaster	8870A23	3/16" in diameter
Dremel disc	Wagner	31M	Diamond coated, 22 mm in diameter, 0.17 mm in thickness
Steel wire	Precision Brand	21212	0.012" in diameter, full hard
Steel wire	Precision Brand	21007	0.007" in diameter, full hard
Steel wire	A-M Systems	792700	0.003" in diameter, half hard
Super glue	Loctite	LT-40640	# 406
Super glue	Loctite	LT-41550	# 415
Dental acrylic powder	Teets	223-3773	Coral
Dental acrylic liquid	Teets	223-4003