Metodi di consegna orale RNA double-stranded per indurre RNAi nel floema e insetti Pentatomomorfi pianta-sap-alimentazione
Summary
In questo articolo vengono illustrate le tecniche romanzo sviluppati per la consegna orale del RNA double-stranded (dsRNA) attraverso i tessuti vascolari delle piante per interferenza del RNA (RNAi) in sap floema insetti d’alimentazione.
Abstract
Floema e pianta sap alimentazione insetti invadono l’integrità delle colture e frutti per recuperare le sostanze nutrienti, nel processo di danneggiare le colture alimentari. Gli insetti Pentatomomorfi rappresentano un certo numero di parassiti economicamente sostanziali delle piante che causano danni alle colture di alimentazione su sap del floema. Il marrone marmorated stink bug (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) e l’Asian psyllid agrumi (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) sono parassiti di insetto ematofago introdotti in Nord America, dove essi sono un parassita agricolo dilagante di agrumi, riga e colture di base e specialità di alto valore, come pure un parassita di fastidio quando raccolgono al chiuso. Resistenza agli insetticidi in molte specie ha portato allo sviluppo di metodi alternativi di strategie di lotta. Double-stranded RNA (dsRNA)-mediata RNA interference (RNAi) è un meccanismo per studi di genomica funzionali che ha applicazioni potenziali come uno strumento per la gestione dei parassiti di insetto il silenziamento genico. DsRNA esogenicamente sintetizzato o short interfering RNA (siRNA) può innescare altamente efficiente del silenziamento genico attraverso la degradazione del RNA endogeno, che è omologo a quello presentato. Uso efficace e ambientale di RNAi come biopesticidi molecolare per biocontrollo di insetti Pentatomomorfi richiede la consegna in vivo di RNAds attraverso l’alimentazione. Qui dimostriamo metodi per la consegna di dsRNA agli insetti: caricamento di dsRNA in fagiolini per immersione e assorbimento di gene-specific del dsRNA con consegna orale attraverso l’ingestione. Inoltre abbiamo delineato non transgenica pianta approcci di recapito utilizzando spray fogliare, inzuppare di radice, iniezioni di tronco così come granuli di argilla, che può essere essenziale per il rilascio prolungato di dsRNA. Consegna efficiente di dsRNA ingerito per via orale è stata confermata come un dosaggio efficace per indurre una diminuzione significativa nell’espressione del gene targeting, come ormone giovanile l’acido O-metiltransferasi (JHAMT) e vitellogenina (Vg). Questi metodi innovativi rappresentano strategie per la consegna di dsRNA da usare nella protezione delle colture e superare le sfide ambientali per la gestione dei parassiti.
Introduction
Gli insetti Pentatomomorfi comprendono alcuni dei parassiti economicamente più significativi di agriculturebecause delle loro capacità per conseguire crescita demografica elevata e diffondere malattie delle piante. BMSB, H. halys Stål, è un parassita invasivo che è stato accidentalmente introdotto nell’emisfero occidentale a Allentown, in Pennsylvania, dall’Asia (Cina, Taiwan, Corea e Giappone) con il primo avvistamento segnalato nel 19961. Sin dalla sua introduzione, BMSB è stato rilevato in 43 Stati, con le popolazioni più alte nel Mid-Atlantic (DE, MD, PA, NJ, VA e WV), così come in Canada e in Europa e rappresenta una potenziale minaccia per l’agricoltura2. Come un parassita polifago, BMSB possono provocare danni ai circa 300 ospiti della pianta identificati tra cui colture di alto valore come mele, uva, piante ornamentali, colture da seme, semi di soia e mais. Danno è causato soprattutto a causa della modalità di alimentazione conosciuto come lacerare e a filo, dove l’animale trafigge il raccolto di host con suo mandrino aghiformi per ottenere l’accesso alle sostanze nutrienti dai tessuti vascolari2,3. BMSB è anche un parassita coperto come essi possono trovare residenza in ambienti quali scuole e case durante l’autunno e inverno2. Prodotti chimici e aeroallergens rilasciato da BMSB sono stati segnalati per illecita reazione allergica negli operai del raccolto di frutta. BMSB può anche contribuire alla malattia allergica che porta alla dermatite da contatto, congiuntivite e rinite allergica in individui sensibili4,5. Un altro insetto ematofago, l’ACP, d. citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), è un parassita serio di agrumi e trasmette i batteri limitato nel floema (Candidatus Liberibacter asiaticus) causando Huanglongbing (HLB), meglio conosciuto come citrus greening malattia6,7. HLB in primo luogo è stato segnalato dalla Cina meridionale e si è diffuso a 40 diversi asiatici, africani, dell’Oceania, Sud e nord americano Paesi7. Citrus greening è un problema in tutto il mondo con minacciose perdite economiche e finanziarie a causa della perdita di agrumi; quindi, gestione dell’ACP è considerato di estrema importanza per prevenire e controllare HLB.
Misure per un effettivo controllo di questi insetti di solito richiede l’applicazione di pesticidi chimici che sono relativamente breve vissuto. Strategie di controllo insetticida chimico spesso mancano strategie di gestione ambientale sicura o essersi ridotta suscettibilità a causa di resistenza agli antiparassitari in pest popolazioni8,9. Quindi, il controllo biologico dei parassiti con biopesticidi molecolare è un’alternativa potenziale, ma il suo utilizzo a livello mondiale rimane modesto, e varie specie di parassitoidi (ad es., Trisolcus japonicus) può anche essere efficace come naturale biologico controlli. il RNAi è un potenziale emergente tecnologia per la gestione dei parassiti di insetto invasivi con biopesticidi molecolare10. il RNAi è un meccanismo di regolazione genica descritta bene che facilita l’efficace post-trascrizionale genico di endogeno nonché invadendo dsRNA in modo sequenza-specifico, che finalmente conduce alla regolazione della espressione genica a mRNA livello11,12. Brevemente, quando dsRNA esogeno è interiorizzato in una cella che viene elaborato in siRNA da un membro della superfamiglia di RNAsi III bidentati nucleasi, chiamata Dicer, che è evolutivamente conservata in vermi, mosche, piante, funghi e mammiferi13, 14 , 15. questi duplex del siRNA di 21-25 nucleotidi sono quindi svolto e integrati nel complesso silenziamento indotto da RNA (RISC) come guida RNAs. Questo complesso RISC-RNA permette di Watson-Crick appaiamento complementare destinazione mRNA; questo alla fine porta alla scissione dalla proteina Argonaute, una proteina di dominio multi contenente un RNasi H-come dominio, che degrada il mRNA corrispondenti e riduce la traduzione della proteina, determinando così il silenziamento genico post-trascrizionale16 , 17 , 18.
RNAi per gestione dei parassiti richiede l’introduzione del dsRNA in vivo per silenziare il gene di interesse, quindi attivazione della via di siRNA. Vari metodi che sono stati utilizzati per la consegna di dsRNA per insetti e cellule di insetto per indurre RNAi sistemica includono alimentazione10,19, ammollo20,21, microinjection22, vettori quali liposomi 23e altre tecniche24. RNAi è stato prima dimostrato in Caenorhabditis elegans al silenzio unc-22 l’espressione genica di Fire e Mello25, seguita da atterramento nell’espressione dei geni frizzled in Drosophila melanogaster26. Gli studi funzionali iniziali utilizzate microiniezione per offrire dsRNA in insetti, come Apis mellifera22,27, Acyrthosiphon pisum28, Blattella germanica29, H. halys30e lepidotteri insetti (recensiti da Terenius et al. 31). microinjection è vantaggiosa per consegnare un dosaggio accurato e preciso per il sito di interesse per l’insetto. Anche se tali punture settici possono suscitare espressione dei relativi geni immuni a causa di trauma32, quindi, escludere la sua praticità nello sviluppo agricolo biopesticidi.
Un altro metodo di consegna dsRNA in vivo è di ammollo, che coinvolge ingestione o assorbimento di dsRNA da sospensione di animali o di cellule generalmente nel mezzo extracellulare contenente dsRNA. Ammollo è stato utilizzato in modo efficiente indurre RNAi in cellule di coltura del tessuto della drosofila S2 per inibire a valle-di-Raf1 (DSOR1) della proteina mitogene-attivata della chinasi della chinasi (MAPKK)20, così come in c. elegans per mettere a tacere la pos-1 gene33. Tuttavia, dsRNA recapitato tramite ammollo è meno efficace per indurre RNAi rispetto a microiniezione20. RNAi mediata silenziamento in un insetto da masticare era primo indicato nella diabrotica del mais (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) infondendo il dsRNA in una dieta artificiale agar10. Rapporti più iniziali sono riassunti i metodi per consegnare dsRNA infuso in diete naturali specifiche di artropodi34. Questi metodi di consegna più ulteriormente sono stati determinati per essere efficace in modo paragonabile ai mezzi artificiali di consegna; come nel caso della mosca tse-tse (Glossina glossinidius glossinidius), dove uguale colpo di un gene di immuno-correlati è stata osservata quando il dsRNA è stato consegnato tramite pasto di sangue o iniettati35. Allo stesso modo, consegna di dsRNA attraverso le goccioline in light brown apple moth (Epiphyas postvittana)36, diamondback moth (Plutella xylostella) larve37, nonché miele le API38,39 indotto RNAi efficiente. Esperimenti di RNAi più efficaci in Pentatomomorfi hanno utilizzato iniezione del dsRNA40 perché la consegna orale di dsRNA negli insetti Pentatomomorfi è ardua, poiché deve essere consegnato attraverso tessuti vascolari della pianta ospite. RNAi efficace inoltre è stata osservata nei paesi ACP e cicaline glassy-winged sharpshooter (esse), Homalodisca vitripennis: dsRNA è stato recapitato tramite agrumi e viti che avevano assorbito dsRNA nei tessuti vascolari attraverso inzuppare radice, fogliare spray, iniezioni di tronco o assorbimento di talee41,42,43,44,45,46. Ciò inoltre ha provocato il primo brevetto per dsRNA contro i paesi ACP (2016, noi 20170211082 A1). Consegna di siRNA e dsRNA utilizzando vettori come nanoparticelle e liposomi conferisce stabilità e aumenti nell’efficacia di dsRNA consegnati stanno rapidamente emergendo23,47,48,49 ,50. Una nuova classe di veicoli di consegna basato su nanoparticelle per acidi nucleici per in vitro e in vivo che è stato ricapitolato specificamente per le applicazioni terapeutiche possono conferire un potenziale immenso come adatto consegna file vettoriale51. Le nanoparticelle come un veicolo di consegna per dsRNA possono avere svantaggi tra cui solubilità, idrofobicità o bioaccumulazione limitata52, ma una consegna di favoreggiamento di polimero adatto può compensare questi svantaggi. Sviluppo e l’utilizzo di auto-consegna nucleotidi stanno emergendo anche chiamati ‘oligonucleotidi antisenso’, che sono single stranded RNA/DNA duplex46.
Vitellogenesi in artropodi sono un fondamentale processo di controllo della riproduzione e regolati da ormone giovanile (JH) o ecdisone, che sono il chiavi induttori di Vg sintesi del grasso di corpo; il Vg è finalmente ripreso dall’ovocita in via di sviluppo via Vg recettore mediata endocytosis53. VG è un gruppo di polipeptidi sintetizzati extraovarially, che è essenziale per lo sviluppo della proteina del tuorlo dell’uovo principali, vitellino54,55, e pertanto, è importante nella riproduzione e invecchiamento56. VG è stato silenziato con successo in nematodi57 come pure in ape del miele (mellifera di Apis) dove RNAi mediata deplezione di Vg è stato osservato in adulti e uova22. RNAi genico post-trascrizionale mediata di Vg è stato testato perché si pensava che suo svuotamento porterebbe ad un effetto fenotipico osservabile come ridotta fertilità e fecondità, per potenzialmente aiutare nel controllo BMSB. Il gene JHAMT che codifica per la S-adenosyl-L-metionina (SAM)-dipendente JH acido O-metiltransferasi, catalizza la tappa finale del JH biosintesi via58. In questo percorso Farnesil pirofosfato (FPP) in sequenza si trasforma da farnesolo, a farnesoic acido seguita dalla conversione di metile farnesoate a JH da JHAMT. Questa via è conservata in insetti e artropodi in particolare per la metamorfosi, un processo che inerente allo sviluppo è regolato da ormoni59,60,61. In b. mori, espressione genica JHAMT e l’attività biosintetica JH i Corpora allata suggeriscono che la soppressione trascrizionale del gene JHAMT è cruciale per la terminazione di JH biosintesi58. Di conseguenza, i geni JHAMT e Vg sono stati selezionati per lo svuotamento mirato mediante RNAi. RNAi è stato testato anche in alberi di agrumi per il controllo dei paesi ACP e di esse. Alberi di agrumi sono stati trattati con dsRNA attraverso inzuppare radice, gambo rubinetto (iniezioni di tronco), così come spray fogliare con RNAds contro insetti specifici arginina chinasi (AK) trascrizioni42,44. L’applicazione topica di dsRNA è stato rilevato tutto sopra il baldacchino di alberi di agrumi, che indica una consegna efficiente attraverso i tessuti di piante vascolari e ha provocato la mortalità aumentata in ACP ed esse41,42, 45.
Nello studio corrente, abbiamo identificato un metodo di consegna dieta naturale per trattamenti quali dsRNA. Questa tecnica di recente sviluppata è stato successivamente utilizzata per mettere a tacere la JHAMT e Vg mRNA mediante dsRNA specifico gene in ninfe BMSB come dimostrato precedenti62. Questi nuovi protocolli di recapito ha dimostrati qui sostituiscono convenzionali sistemi di consegna di RNA che utilizzano spray topici o microiniezioni. Verdure e frutta, staminali rubinetto, suolo inzuppando e assorbenti di argilla in possono essere utilizzati per la consegna di dsRNA, che è fondamentale per il costante sviluppo di biopesticida gestione dei parassiti e patogeni.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNAi ha dimostrato di essere uno strumento importante per esplorare la funzione biologica del gene e regolazione, con un grande potenziale per essere utilizzato per la gestione dei parassiti di insetto19,68,69,70, 71. il design e la scelta di un appropriato geni per silenziamento in una determinata specie di insetti e il metodo di consegna della dsRNA(s) corr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono con gratitudine Donald Weber e Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) per fornire BMSB e HB per la sperimentazione e mantenere le colonie; e Maria T. Gonzalez, Salvador P. Lopez, (USDA, ARS, Fort Pierce, FL) e Jackie L. Metz (University of Florida, Fort Pierce, FL) per manutenzione di Colonia, preparazione dei campioni e le analisi.
Materials
| BMSB (H. halys) insects | USDA | ||
| ACP (D. citri) insects | USDA | ||
| organic green beans | N/A | ||
| Citrus plants | USDA | ||
| sodium hypochlorite solution | J.T. Baker | ||
| green food coloring | McCormick & Co., Inc | ||
| Thermo Forma chambers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Magenta vessel (Culture) | Sigma | ||
| Primers | IDT DNA | ||
| SensiMix SYBR | Bioline | ||
| qPCR ABI 7500 | Applied Biosystems | ||
| Spray bottle | N/A | ||
| Parafilm | American Can Company | ||
| TaKaRa Ex Taq | Clontech | ||
| QIAquick | Qiagen |
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