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Double-Stranded RNA Oral Liefermethoden induzieren RNA-Interferenz im Phloem und Pflanze-Sap-Fütterung Hemipteran Insekten

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57390
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Invasive Insect Biocontrol and Behavior Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Horticultural Research Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

Summary

Dieser Artikel beschreibt neuartige Techniken für mündliche Lieferung doppelsträngige RNA (DsRNA) durch die Leitbündel Gewebe von Pflanzen für die RNA-Interferenz (RNAi) im Phloem Sap Futterinsekten entwickelt.

Abstract

Phloem und Pflanze SAP-Fütterung Insekten dringen in die Integrität von Pflanzen und Früchten zum Abrufen von Nährstoffen in den Prozess Nahrungspflanzen zu beschädigen. Hemipteran Insekten entfallen eine Reihe von wirtschaftlich erhebliche Schädlinge der Pflanzen, die Schäden an Kulturpflanzen durch die Fütterung auf Phloem Sap. Braun Marmorated Gestank Fehler (BMSB), Halyomorpha Halys (Heteroptera: Pentatomidae) und asiatische Zitrus Psyllid (ACP), Diaphorina Citri Teru (Hemiptera: Liviidae) sind hemipteran Schädlinge eingeführt in Nordamerika, wo sie sind Sie eine invasive landwirtschaftlichen Schädlingsbekämpfung hochwertige Spezialität, Zeile, und Nutzpflanzen und Zitrusfrüchte sowie ein Ärgernis-Schädling, wenn sie drinnen aggregieren. Insektizid-Widerstand in vielen Arten führte zu die Entwicklung von alternativen Methoden der Schädlingsbekämpfung-Management-Strategien. Doppelsträngige RNA (DsRNA)-vermittelten RNA-Interferenz (RNAi) ist ein Gen-silencing-Mechanismus für funktionelle Genomforschung Studien, die potenzielle Anwendungen als Werkzeug für das Management von Schadinsekten. Exogen synthetisiert DsRNA oder kleine interferierende RNA (SiRNA) auslösen kann, hocheffiziente gen-silencing durch den Abbau der endogene RNA, die Homolog zu, die vorgestellt wird. Effektive und ökologische Nutzung der RNAi als molekulare Biopestizide für Biocontrol hemipteran Insekten erfordert die in Vivo -Lieferung von DsRNAs durch die Fütterung. Hier zeigen wir Methoden für die Lieferung von DsRNA an Insekten: Laden von DsRNA in grünen Bohnen durch Untertauchen und Absorption von Gen-spezifischen DsRNA mit mündlichen Lieferung durch Verschlucken. Wir haben auch nicht-transgenen Pflanze Lieferung Ansätzen Blatt-Sprays, Wurzel durchnässen, Stamm Injektionen sowie tongranulat, die möglicherweise wichtig für anhaltende Freisetzung von DsRNA skizziert. Effiziente Bereitstellung von oral eingenommenen DsRNA wurde als eine effektive Dosierung induzieren eine signifikante Abnahme der Ausdruck gezielt Gene, wie Juvenilhormon Säure O-Methyltransferase (JHAMT) und Vitellogenin (Vg) bestätigt. Diese innovativen Verfahren stellen Strategien für die Lieferung von DsRNA im Pflanzenschutz und Umwelt meistern zur Schädlingsbekämpfung.

Introduction

Hemipteran Insekten umfassen einige der wirtschaftlich bedeutenden Schädlinge von Agriculturebecause Kräften zu erreichen hohe Bevölkerungswachstum und Krankheiten bei Pflanzen zu verbreiten. BMSB, H. Halys Stål, ist eine invasive Schädling, der versehentlich mit der ersten Sichtung in 19961berichtet in der westlichen Hemisphäre in Allentown, Pennsylvania aus Asien (China, Taiwan, Korea und Japan) eingeführt wurde. Seit seiner Einführung BMSB wurde in 43 Staaten mit den höchsten Bevölkerungen in der Mid-Atlantic (DE, MD, PA, NJ, VA, und WV) sowie in Kanada und Europa, erkannt und stellt eine potenzielle Bedrohung für die Landwirtschaft2. Als polyphag Schädling kann BMSB Schäden an rund 300 identifizierten Pflanze Gastgeber unter anderem hochwertige Kulturen wie Äpfel, Trauben, Zierpflanzen, Feldbestände, Sojabohnen und Mais einzuleiten. Schaden ist in erster Linie durch die Art der Fütterung, bekannt als Worte und bündig, wo das Tier durchdringt die Gastgeber-Ernte mit seinen nadelartigen Mandrin zu den Nährstoffen aus der Vascular Gewebe2,3zugreifen. BMSB ist auch einen indoor-Schädling wie sie Wohnsitz in Wohnbereichen wie Schulen finden können und im Herbst bis Winter2Häuser. Chemikalien und aeroallergene von BMSB veröffentlicht wurden illegale allergische Reaktion bei Frucht Ernte Arbeiter gemeldet. BMSB kann auch zu allergischen Erkrankung führt zu Kontaktdermatitis, Konjunktivitis und Rhinitis bei empfindlichen Personen4,5beitragen. Ein anderes hemipteran Insekt, ACP, D. Citri Teru (Hemiptera: Liviidae) ist eine schwere Pest von Zitrusfrüchten und überträgt die Phloem-limitierte Bakterien (Verbindung Liberibacter Asiaticus) Huanglongbing (HLB), besser bekannt als citrus Greening Krankheit6,7. HLB wurde erstmals berichtet, aus dem südlichen China und auf 40-verschiedener asiatischer, afrikanischer, ozeanischer, Süd- und nordamerikanischen Länder7ausgebreitet hat. Citrus Greening ist ein weltweites Problem mit bedrohlichen wirtschaftlichen und finanziellen Verluste durch den Verlust von Zitrusfrüchten; Management von ACP gilt daher von größter Bedeutung für die Vorbeugung und Bekämpfung von HLB.

Maßnahmen für eine effektive Kontrolle von diesen Schadinsekten erfordert in der Regel, dass die Anwendung von chemischen Pestiziden, die relativ kurz gelebt. Chemischen Insektiziden Kontrollstrategien oft fehlen sichere Umwelt-Management-Strategien oder Anfälligkeit durch Pestizid Widerstand in Pest Populationen8,9abgenommen haben. Daher die biologische Bekämpfung von Schädlingen mit molekularen Biopestizide ist eine mögliche Alternative, aber seine Verwendung weltweit bleibt bescheiden und verschiedene Arten von Parasitoide (z. B. Trisolcus Japonicus) können auch als natürliche biologische wirksam sein Kontrollen. RNAi ist eine neue Technologie für die Verwaltung von invasiver Schadinsekten mit molekularen Biopestizide10Potenzial. RNAi ist gut beschrieben gen Regelmechanismus, das ermöglicht die effektive posttranskritionelle gen-silencing der endogenen sowie Eindringen von DsRNAs in einer Sequenz-spezifische Art und Weise, die schließlich zu die Regulation der Genexpression in der mRNA führt Level11,12. Kurz, wenn exogene DsRNA in eine Zelle verinnerlicht ist, was sie von einem Mitglied der zweizähnigen Nuklease RNase III-Superfamilie zu SiRNAs verarbeitet wird, genannt Dicer, das evolutionär in Worms, fliegen, Pflanzen, Pilze und Säugetiere13, konserviert ist 14 , 15. diese 21-25 Nukleotide SiRNA Maisonetten sind dann abgewickelt und integriert im RNA-induced silencing Komplex (RISC) wie RNAs führen. Diese RISC-RNA-Komplex ermöglicht Watson-Crick-Basenpaarung zu den ergänzenden Zielen mRNA; Dies führt schließlich zur Spaltung durch das Argonaut-Protein, ein Multi Domain Protein enthält eine RNase H-ähnliche Domäne, die verschlechtert sich die entsprechende mRNA und Protein Übersetzung, was wiederum zu posttranskritionelle gen-silencing16 reduziert , 17 , 18.

RNAi für Pflanzenschutz erfordert die Einführung DsRNA in Vivo das Gen des Interesses, zum Schweigen zu bringen, damit Aktivierung des SiRNA-Weges. Verschiedene Methoden, die für die DsRNA Lieferung an Insekten und Insektenzellen verwendet wurden, um systemische RNAi induzieren gehören Fütterung10,19,20,21, Mikroinjektion22, Träger wie Liposomen einweichen 23und anderen Techniken-24. RNAi war erste gezeigt in Caenorhabditis Elegans , Unc-22 Genexpression durch Feuer zum Schweigen zu bringen und Mello25, gefolgt von Zuschlag im Ausdruck der frittierten Gene in Drosophila Melanogaster26. Funktionale ausgangsstudien genutzt Mikroinjektion DsRNA in Insekten, wie z. B. Apis Mellifera22,27, Acyrthosiphon Pisum28, Blattella Germanica29zu liefern, H. Halys30und Lepidoptera Insekten (rezensiert von Terenius Et al. 31). Mikroinjektion ist vorteilhaft, eine genaue und präzise Dosierung an den Ort von Interesse in das Insekt zu liefern. Wenn auch solche septischen Punktionen Expression immun Verwandte Gene durch Trauma32, daher seine Praxistauglichkeit in landwirtschaftlichen Biopestizide Entwicklung auszuschließen entlocken können.

Eine andere Methode der Bereitstellung von DsRNA in Vivo wird durch einweichen, was einschließt, Verschlucken oder Aufnahme von DsRNA durch Aussetzung der Tiere oder Zellen in der Regel im extrazellulären DsRNA-haltigem Medium. Einweichen wurde verwendet, um effizient induzieren RNAi in Drosophila S2 Gewebekultur Zellen hemmen Downstream von Raf1 (DSOR1) Mitogen-activated Protein Kinase-Kinase (MAPKK)20sowie in C. Elegans die zum Schweigen zu bringen POS-1 gen33. DsRNA geliefert mit Einweichen ist jedoch weniger effizient im Vergleich zu Mikroinjektion20RNAi induzieren. RNAi vermittelte Stummschaltung in Kauen Insekt wurde erstmals in der Maiswurzelbohrer (WCR) (Diabrotica Virgifera Virgifera) durch Infusion die DsRNA in eine künstliche Agar Diät10gezeigt. In früheren Berichten haben Methoden zur DsRNA infundiert in natürliche Ernährung speziell für Arthropoden34liefern zusammengefasst. Diese Lieferung Methoden waren weiter entschlossen, vergleichsweise effektiv sein, künstliche Mittel der Lieferung; wie der Fall von der Tsetse-Fliege (Glossina Morsitans Morsitans), wo gleich Knockdown von eine immunvermittelte gen beobachtet wurde als DsRNA entweder durch Blutmehl oder mikroinjiziert35geliefert wurde. Ähnlich, Lieferung von DsRNA durch Tröpfchen in leichte braune Apfel Motte (Epiphyas Postvittana)36, Diamondback Moth (Plutella Xylostella) Larven37sowie Honig Bienen38,39 effiziente RNAi induziert. Am effektivsten RNAi-Experimente in Hemipteran haben Injektion von DsRNA40 verwendet, weil mündliche Lieferung von DsRNA in hemipteran Insekten mühsam ist, da es durch die Wirtspflanze Vascular Gewebe geliefert werden muss. Effektive RNAi wurde auch in AKP-Staaten und glasig-winged Sharpshooter Leafhopper (GWSS), Homalodisca Vitripennisbeobachtet: DsRNA wurde durch Zitrusfrüchten und Weinreben, die in der Vascular Gewebe durch Wurzel durchnässen, Blatt-DsRNA absorbiert hatte geliefert Sprays, Stamm-Injektionen oder Absorption durch Stecklinge41,42,43,44,45,46. Dies führte auch zu das erste Patent für DsRNA gegen die AKP-Staaten (2016, uns 20170211082 A1). Lieferung von SiRNA und DsRNA mit Fluggesellschaften wie Nanopartikel und Liposomen vermittelt Stabilität und Erhöhungen der gelieferten DsRNA Wirksamkeit entstehen schnell23,47,48,49 ,50. Eine neue Klasse von Nanopartikel-basierte auslieferfahrzeuge für Nukleinsäuren für in Vitro und in Vivo , die speziell für therapeutische Anwendungen immenses Potential vermitteln können, wie geeignet Lieferung51Vektoren zusammengefasst wurde. Nanopartikel als Träger für DsRNA möglicherweise Nachteile einschließlich Löslichkeit, Hydrophobie oder begrenzte Bioakkumulation52, aber eine geeigneten Polymers Unterstützung Lieferung kann diese Nachteile zu kompensieren. Entwicklung und Nutzung von selbst liefern Nukleotiden entstehen auch genannt "antisense Oligonukleotide", die einzigen stranded RNA/DNA Duplex46sind.

Vitellogenesis in Arthropoden ist ein Schlüssel Prozess Steuerung Reproduktion und Juvenilhormon (JH) oder Ecdyson geregelt, die sind die wichtigsten Induktoren der Vg Synthese von Körperfett; Das Vg wird schließlich von der entwickelnden Eizelle über Vg Rezeptor-vermittelte Endozytose53aufgenommen. VG ist eine Gruppe von Polypeptiden synthetisiert Extraovarially, die wesentlich für die Entwicklung der großen Ei Eigelb Eiweiß, Vitellin54,55, und daher ist es wichtig bei der Fortpflanzung und Alterung56. VG hat erfolgreich zum Schweigen gebracht worden in Nematoden57 sowie in Honigbiene (Apis Mellifera) wo RNAi Erschöpfung der Vg vermittelte in Erwachsene und Eiern22beobachtet wurde. RNAi vermittelte posttranskritionelle gen-silencing VG wurde getestet, weil man dachte, dass seine Erschöpfung führe zu einem beobachtbaren phänotypische Wirkung wie verringert Fruchtbarkeit und Fruchtbarkeit, um potenziell BMSB Kontrolle zu helfen. Das JHAMT-gen, das die S-Adenosyl-L-Methionin (SAM) kodiert-abhängige JH Säure O-Methyltransferase katalysiert den letzten Schritt der JH Biosynthese Weg58. In diesem Pfad Farnesyl Pyrophosphat (FPP) nacheinander von Farnesol, Farnesoic Säure, gefolgt von der Umwandlung von Methyl-Farnesoate, JH durch JHAMT wandelt sich. Dieser Weg ist konserviert in Insekten und Arthropoden speziell für Metamorphose, ein Prozess, der Hormone59,60,61Entwicklungsgeschichtlich geregelt ist. In B. Morizufolge JHAMT Genexpression und die JH biosynthetische Aktivität in den Corpora Allata die transcriptional Unterdrückung des JHAMT -Gens für die Beendigung der JH Biosynthese58entscheidend. Daher wurden die JHAMT und Vg Gene für gezielte Erschöpfung mit RNAi ausgewählt. RNAi wurde auch Zitrusbäume für die Kontrolle der AKP-Staaten und GWSS getestet. Zitrusbäume mit DsRNA durch Wurzel durchnässen behandelt wurden, ergeben sich Hahn (Stamm Injektionen), sowie Blatt-Sprays mit DsRNAs gegen Insekten bestimmte Arginin Kinase (AK) Abschriften42,44. Die topische Anwendung von DsRNA erkannt wurde überall auf dem Vordach der Zitrusbäume, effiziente Lieferung durch die Pflanzen Vascular Gewebe angibt, und führte zu erhöhten Mortalität in den AKP-Staaten und GWSS41,42, 45.

In der aktuellen Studie haben wir eine natürliche Ernährung Übermittlungsmethode für Behandlungen wie DsRNA identifiziert. Diese neu entwickelte Technik diente anschließend für die JHAMT und Vg-Stummschaltung mit spezifischen DsRNAs gen in BMSB Nymphen als mRNA zeigten frühere62. Diese neue Übermittlungsprotokolle demonstriert hier ersetzen konventionelle RNA-Delivery-Systeme, die topischen Sprays oder Mikroinjektionen verwenden. Obst und Gemüse, Stamm Hahn, Boden Tränken und Ton Absorptionsmittel in können verwendet werden für die Lieferung von DsRNA, die ist entscheidend für die weitere Entwicklung der Schädlinge und Krankheitserreger Management verwand.

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Protocol

(1) BMSB Aufzucht

  1. Hintere BMSB Insekten gemäß standard-Lab-Praxis und zuvor beschriebenen63.
  2. ACP (D. Citri) Insekten auf Citrus Macrophylla in einem Gewächshaus (22 ° C) und natürliches Licht zu erhöhen. Verwenden Sie Erwachsene ACP, bei ca. 5-7 Tage post bewegungsapparate.

2. Auswahl der Genregionen und In vitro- Synthese von dsRNA

  1. Wählen Sie bestimmte Gene BMSB aus bereits veröffentlichten Transkriptom profile32.
  2. Sicherstellen Sie, dass die Regionen von Interesse ausgewählt variieren zwischen 200 bis 500 Basenpaaren.
  3. Führen Sie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit den Bedingungen beschrieben, um verbunden mit dem ausgewählten gen des Interesses aus genomischer DNA Fragmente zu generieren. Siehe Tabelle 1 für die Gen-spezifischen Oligonucleotides.
    1. PCR-Reaktion: In einem 0,25 mL PCR-Röhrchen, kombinieren Sie 5 µL 10 X PCR-Puffer, 4 µL dNTP Mischung (2,5 mM), 2 µL DNA-Vorlage (50 ng/µL), 2,5 µL der Primer 1 und 2 (10 µM), 0,25 µL DNA-Polymerase (5 U/µL) , und DNase/RNase frei Wasser bis zu 50 µL.
    2. PCR-Bedingung: Zyklus die PCR-Reaktion verstärken die Region von Interesse bei 95 ° C für 3 min, gefolgt von 30 Zyklen von 98 ° C für 10 s, 55 ° C für 30 s, 72° C für 1 min inkubieren die Reaktion bei 72 ° C für eine zusätzliche 10 min. Reinigen der PCR-Reaktion mit einer Reinigung-Kit.
  4. Die erhaltenen PCR-Fragmente weiter zu verstärken, mit Gen spezifische Primer flankiert von der T7 RNA-Polymerase-promotorsequenz (5'-GAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA-3') erwähnt als frühere62.
  5. Verwenden Sie für RNAi LacZ gen als Negativkontrolle (Mock).
    Hinweis: LacZ ist ein Gen, das β-Galaktosidase verstärkt aus Escherichiacoli genomischer DNA (die Primer verwendet, sind in Tabelle 1aufgeführt) kodiert.
  6. Führen Sie in Vitro Transkription DsRNA beschrieben früheren62nachzugeben.
  7. Lösen Sie auf und Aufschwemmen Sie der daraus resultierenden DsRNA in 150 µL DNase/RNase freies Wasser, Messen Sie die Konzentration und bei-80 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern.

3. Lieferung der DsRNA mit grünen Bohnen

  1. Wählen Sie früh 4th Instar BMSB Larven geschlüpft aus demselben Ei-Masse und verhungern sie 24 Stunden vor der Fütterung DsRNA.
  2. Wählen Sie schlanke zertifizierten Bio grüne Bohnen (Phaseolus Vulgaris L.) und mit 0,2 % Natriumhypochlorit-Lösung für 5 min waschen.
    Hinweis: Schlanke grüne Bohnen wurden so gewählt, dass die Bohnen leicht in die 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen untergebracht werden können.
  3. Mit DdH2O 3 Mal waschen und an der Luft trocknen.
  4. Schneiden Sie die grünen Bohnen aus dem Kelch Ende auf einer Länge von 7,5 cm mit einer sauberen Rasierklinge.
  5. Tauchen Sie die gewaschenen und geschnittenen grünen Bohnen in einen Cap-Less 2 mL Microcentrifuge Schlauch mit 300 µL Kontrolllösung (eine 01:10 Verdünnung der grüne Lebensmittelfarbe (Zutaten: Wasser, Propylenglykol, Fd & C gelb 5, Fd & C blau 1 und Propylparaben als Konservierungsmittel)).
  6. Machen Verdünnungen des in-Vitro synthetisiert LacZ, JHAMT oder Vg DsRNAs durch Verdünnung 5 µg oder 20 µg in 300 µL RNase/DNase freies Wasser Endkonzentrationen 0.017 µg/µL oder 0.067 µg/µL, bzw. zu liefern.
  7. Tauchen Sie die gewaschenen und geschnittenen grünen Bohnen in einen Cap-Less 2 mL Microcentrifuge Schlauch mit 300 µL DsRNA-Lösung (aus Schritt 3,6).
  8. Wickeln und die Schnittflächen an den Mikrozentrifugenröhrchen umschließt die eingetauchten Bohnen um Verdunstung der DsRNA Lösung zu vermeiden und zu verhindern, dass die Tiere in den Microcentrifuge Schlauch versiegeln.
  9. Positionieren Sie diese Rohre in einer aufrechten Weise bei Raumtemperatur für 3 h auf der DsRNA-Lösung in die grüne Bohnen durch Kapillarwirkung geladen werden können.
  10. Legen Sie diese Rohre in saubere Kulturgefäße (Polypropylen). Platz drei verhungert 4th Instar BMSB Nymphen in der Kulturgefäße.
  11. Behandeln Sie drei Tiere pro Kulturgefäß jeweils drei grüne Bohnen mit grüne Lebensmittel Färbung oder DsRNA Lösung. Halten Sie die Insekten bei 25 ° C und 72 % relativer Luftfeuchtigkeit, unter einem 16 L: 8 Photoperiode im Inkubator.
  12. Ermöglichen Sie die Insekten ernähren sich von den grünen Bohnen (eingetaucht und absorbiert mit DsRNA) für 5 Tage, aber mit frischen Diäten von DsRNA Behandlung grüne Perlen nach 3 Tagen wieder aufzufüllen.

4. Echtzeit-Quantitative (qPCR) Analyse von Gen Ausdruck folgenden RNAi vermittelte Stummschaltung in BMSB

  1. Messen Sie die Wirkung von RNAi auf die Höhe der Abschrift Expression von qPCR.
  2. Die gesamte-RNS von DsRNA behandelt Tiere zu isolieren und Synthese der cDNA-62.
  3. Richten Sie die qPCR-Reaktionen mit einer Echtzeit-PCR-System und die Primer in Tabelle 1aufgeführt. Verwenden Sie die folgenden qPCR Radsport Bedingung: 95 ° C für 10 min gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 15 s, 60 ° C für 1 min, zusammen mit Dissoziation Schritt einschließlich 95 ° C für 15 s, 60 ° C für 1 min, 95 ° C für 15 s , und 60 ° C für 15 s.
  4. Die qPCR Standards: Verwenden Sie die serielle Verdünnung der cDNA aus total RNA isoliert von einem normalen Tier als Referenzstandard für die Quantifizierung vorbereitet.
  5. Verwenden Sie BMSB 18 s RNA als interner Standard für Unterschiede bei den RNA-Wiederherstellung von Gewebe32zu korrigieren.

5. BLATTSPRÜHMITTEL Anwendung in großen Töpfen Zitrusbäumen und Sämlinge

Hinweis: Pflanzen Zitrusfrucht Sorte 'Carrizo' Citrange (Citrus Sinensis XPoncirus Trifoliata, Rutaceae), wurden gepflegt, in einem Gewächshaus unter natürlichem Licht und Temperatur, in 1,2 L Container angebaut. Die Pflanzen wurden ständig beschnitten, zur Förderung des Wachstums der neuen Blatt-Triebe, genannt "bündig". ACP lieber Futter und Eiablage auf die Neubildung von Zitrusfrüchten64.

  1. Wählen Sie Pflanzen oder Sämlinge und nicht Wasser sie für ca. 2-3 Tage vor dem Gebrauch, den Boden zu feucht, aber nicht vollständig trocken trocknen zu lassen.
  2. Mit einer Hand-Pumpe-Sprühflasche 200 mL DsRNA-Lösung (0,5 mg/mL) zur unteren Kappe (Abb. 4A) anwenden.
    Hinweis: Bereiten Sie den oben genannten DsRNA Lösungen im DNase/RNase freies Wasser.
  3. Post-spray Anwendung, lassen Sie die angewandte DsRNA Lösung vollständig durch die Blätter aufgenommen werden.
    Hinweis: Zitrusbäume absorbiert die angewandte DsRNA, und dann Blätter aus entweder neues Wachstum oder Zweige, die vor der Anwendung abgedeckt wurden extrahiert wurden; die DsRNA war nachweisbar mit qPCR und systemischen Bewegung in der oberen Abdeckung baumblätter in 3-4 h44,45,46zeigte.
  4. Probieren Sie das neue Wachstum von zuvor gekrönt Bäumen, nach 25-40 Tage durch das Sammeln von etwa 10 von den Spitzen der vier Niederlassungen Blätter. Die gesamte-RNS zu extrahieren und zu analysieren durch reverse Transkription PCR (RT-PCR) und qPCR auf das Vorhandensein des Triggers angewandte DsRNA unter Verwendung der Zündkapseln in Tabelle 1 aufgeführten und beschriebenen Methoden46.
    Hinweis: Die Musterkollektion, total RNA Isolierung, RT-PCR und qPCR wurden wie zuvor beschrieben46durchgeführt.
  5. In ähnlicher Weise topisch Spritzen Sie 10 mL DsRNA auf den unteren Bereich des ein Sämling oder kleine Eingemachte Baum laub.
    Hinweis: Hemipteran Insekten (AKP-Staaten und GWSS) erhielten Fütterung Zugang normalerweise um 24 Uhr, post-Behandlungen auf neues Wachstum (Blätter), hatte nicht direkt besprüht oder die Wochen später wuchs, oder ganzen Pflanzen. Dies führte zu Insekten, welche positiv getestet für die DsRNA bei 3, 6 und 10 Tage post Fütterung.

6. Boden/Root Drench Anwendung in großen oder kleinen Topfpflanzen, Zitrusbäumen und Setzlinge

  1. Wählen Sie Pflanzen oder Sämlinge und sie nicht für 2-3 Tage vor dem Gebrauch, den Boden um zu feucht aber nicht Austrocknen lassen Wasser vollkommen trocken (es entsteht Luftraum um die flüssige Lösung angewendet werden zu halten).
  2. 1 L DsRNA-Lösung (0,2 mg/mL) auf den Boden der großen Topfpflanzen (ca. 2,5 m) dazugeben Sie und 1 L Wasser (Chaser) nach 1 h.
  3. 100 mL DsRNA Lösung (1,33 mg/mL) in den Boden 1 m hohe Topfpflanzen Bäume in teilweise trockenen Böden anwenden.
  4. Wenden Sie für kleine Sämlinge 10 mL DsRNA-Lösung (1 mg/mL an) auf den Boden in den Zapfen oder die nackten Wurzeln (Abbildung 4 b, C).
  5. Lassen Sie die Pflanzen, die als ein Boden durchnässen für 30 min Einweichen DsRNA-Lösung zu erhalten. Dann bewerben Sie schlicht nur Wasseraufbereitung um Absorption durch Wurzeln (20 mL für Pflanzen in gelben Container) oder 100 mL zu unterstützen, wenn größere Pflanzgefäße > 1 Gallone sind.
    Hinweis: Topisch applizierten DsRNA, Laub führte Erkennung bei den meisten distale Spitzen der Zweige innerhalb 3-6 h Post Behandlungen, systemische Bewegung durch Bäume zeigen. Neue Wachstumsbranchen DsRNA bei 60-90 Tage Post Behandlungen positiv getestet. Stecklinge sind Insekten (AKP-Staaten und GWSS) in einem DsRNA Fütterung Bioassay44zur Verfügung gestellt.

7. Tippen (Baum-Stamm-Injection) Stammapplikation in großen Töpfen Zitrusbäumen und Sämlinge

  1. Wählen Sie Zitrusfrüchte Pflanzgut, neu, oder etwa 3,5 Jahre alte Anlagen zum Einspritzen von DsRNA mit dem Stamm (Stamm Injektionen) Methode tippen.
  2. Bohren Sie Löcher in die Zitruspflanzen mit einer Bohrmaschine und einem 10 mm Bohrer, kümmert sich nicht um mehr als 2 cm oder etwa die Hälfte der Durchmesser des Stammes.
  3. Wickeln Sie die Kupfer Spitze jeder Einspritzdüse 4 - 6 Mal mit einem 0,6 cm (¼ Zoll) breiten Streifen des Versiegelns Film um nahe der Spitze auslaufen.
  4. Füllen Sie die Baum-Stamm-Injektoren mit 6 mL (1,7 mg/mL) DsRNA Lösung in DNase/RNase freies Wasser verdünnt (bezeichnet als farbige Lösung hier).
  5. Spritzen Sie die Lösung in den Stamm des Baumes und lassen Sie den Injektor in den Kofferraum für 6-10 h zur Absorption der DsRNA-Lösung ermöglichen. Die Insekten ernähren sich die Stecklinge von behandelten Bäume von 3, 10 und 30 Tage nach der Behandlung zu ermöglichen.
    Hinweis: Die DsRNA injiziert mit der Stamm-Injektion-Methode beibehalten in den Bäumen für einen Zeitraum von 30-60 Tage41,42,44. Validierung für RNAi wurde von qPCR unter Verwendung der Zündkapseln in Tabelle 1aufgeführten durchgeführt.

8. DsRNA behandelt Tongranulat für Lieferung an Insekten durch Boden

  1. Gießen Sie den Ton saugfähig in ein 50 mL konische Röhrchen bis 35 mL-Markierung (ca. 30 g Ton saugfähig) auf dem Schlauch.
  2. Gießen Sie 20 mL DsRNA Lösung verdünnt in DNase/RNase freies Wasser (100 µg/mL) in das Rohr, das Absorptionsmittel nass. Die konischen Röhrchen, Tipp die Röhre zur Beseitigung von Luft und das Röhrchen.
  3. Legen Sie das Rohr aufrecht und 1 – 2 min. für die tonteilchen absorbieren die Lösung stehen lassen.
  4. Fügen Sie genügend DsRNA-getränkten Ton in die Erdmischung, 1 Gallone Topf zu füllen.
  5. Mischen Sie und drehen Sie den Boden von hand, um der DsRNA-getränkten Ton in die Erde mischen.
  6. Verwenden Sie dieses Bodens, um Sämlinge ausgewählt für die Behandlung von DsRNA Umtopfen.
  7. Wasser den Boden mit 200 mL Leitungswasser ohne DsRNA. Nach 30 min bis 1 h mit 100 mL klarem Wasser folgen. Stellen Sie nach 24 h die Pflanze auf einem normalen Bewässerungsplan.
  8. Testen Sie 4-6 Blätter von den behandelten Topfpflanzen mit Lehm Absorptionsmittel und DsRNA jeden Monat nach der Behandlung für DsRNA sammeln die meisten apikalen Blätter der neuen Pflanzenwachstum.
    Hinweis: Pflanzen oder Stecklinge von diesen behandelten Pflanzen werden gefüttert, Insekten jederzeit nach 24 h nach der Behandlung und konnten bis zur Auslieferung RNAi für bis zu einem Jahr an Insekten (unveröffentlichte Daten).

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Representative Results

Pflanzlichen vermittelten DsRNA Lieferung durch Fütterung in BMSB 4th Instar Nymphen wurde für die Entwicklung der molekularen Biopestizide mit RNAi für invasive Schädlinge getestet. BMSBs Feed mit ihren nadelartigen Stilett durch einen Mechanismus bekannt als Zerfleischen und spülen, wodurch erhebliche Schäden an Kulturpflanzen. Schlanke Bio grüne Bohnen, p. Vulgaris L., wurden verwendet, um zu testen, ob Nährstoffe oder DsRNA in Vivo an BMSB durch Fütterung3geliefert werden konnten. Segmente von grünen Bohnen tauchten in DNase/RNase freies Wasser oder einer Lösung aus Wasser und grüne Lebensmittelfarbe, Lieferung in BMSB (Abbildung 1A) zu testen. Die grüne Lebensmittelfarbe diente als eine visuelle Anzeige DsRNA zu imitieren. Die Aderhaut grüne Bohnen wurden mit grüne Lebensmittelfarbe aufgrund der Strömung des grün gefärbten Lösung durch das Phloem durch Kapillarwirkung62gesättigt. BMSB Nymphen galten Fütterung auf die Segmente des grünen Bohnen durch das Einfügen ihrer Stilett in Vascular Gewebe aus grünen Bohnen (Abbildung 1 b). Grün gefärbten Ausscheidungen Tropfen wurden nach Tag 2 und 3 bei Insekten beobachtet, die gefüttert wurden, auf Bohnen gesättigt mit grüne Lebensmittel Färbung darauf hinweist, das gelieferte Material Oral und durch den Darm vor der Ausscheidung (Abbildung 1, D übergeben worden ).

Anschließend haben wir getestet, wenn erhebliche Dezimierung der gezielten Genexpression mit grüne Bohnen vermittelte Lieferung BMSB spezifische DsRNA durch Einnahme in BMSB erreicht wurde. Grüne Bohnen-Segmente tauchten und absorbiert eine Lösung von 0.067 µg/µL (20 µg in 300 µL DNase/RNase freies Wasser) oder 0.017 µg/µL (5 µg in 300 µL DNase/RNase freies Wasser) in Vitro synthetisiert DsRNA spezifisch für BMSB JHAMT und Vg , beziehungsweise. Grüne Bohnen tauchten auch im Wasser allein, 0.067 µg/µL oder 0.017 µg/µL LacZ DsRNA (Mock) als jeweiligen Steuerelemente. Transkript Ebenen wurden mit qPCR darauf hinweist, dass Expression von JHAMT ausgewertet und Vg mRNA war deutlich reduzierten in Vivo von fast 4,5 - und 2,2-fach, bzw. (Abb. 2A, B). Folglich zeigen die Ergebnisse, dass das DsRNA durch die Leitbündel Gewebe von grünen Bohnen, erfolgreiche RNAi induzieren geliefert werden kann.

Ein weiterer hemipteran Pest, vermittelt der Harlekin-Bug (HB) (Murgantia Histrionica), der Cole Pflanzen auch geprüft wurden schädigt, wenn erfolgreiche Lieferung von Nährstoffen oder DsRNA Behandlungen zugestellt werden konnte, mit dem Gemüse Lieferung. Die 4th Instar HB Nymphen durften ernähren sich von Baby-Grünkohl (Brassica Oleracea Var. Viridis) Eintauchen in Wasser oder einer Lösung aus Wasser mit grüne Lebensmittelfarbe. Ergebnisse zeigten, dass HB gefüttert und aufgenommen, die grüne Lebensmittelfarbe, die offensichtlich von ihrer grünen farbigen Ausscheidungen, im Vergleich zu HB war, die das Gemüse in Wasser getaucht, die klare Ausscheidungen (Abbildung 3) aufgenommen.

Zusätzliche Techniken für die vorübergehende Erbringung von DsRNA Sprühen oder Wurzel/Boden Einweichen Ergebnisse DsRNA Aufnahme aller pflanzlichen Geweben65,66. Versprühbaren RNAi-basierten Produkte sind in der Entwicklung und können bald bis zur Genehmigung vorliegen. Lieferung von DsRNA in den Bereichen mit Sprays oder Wurzel durchnässen kann Hilfe bei der Bewältigung invasive Insekten42,67. Full-Size Zitrusbäumen und Sämlinge wurden die DsRNA entweder durch BLATTSPRÜHMITTEL oder durch Boden oder wurzelnackte Drenchen bzw. (Abbildung 4) ausgesetzt. Ergebnisse zeigten, dass DsRNAs von entweder Sprays oder Boden/nackten Wurzel durchnässen in Zitruspflanzen (2,5 m hoch) für 7 Wochen nach einmaliger Exposition von 2 g DsRNA42nachgewiesen werden konnte. Lieferung und Einnahme von Psyllid DsRNA-AK (20 ng/µL) Psyllid Mortalität um 30-45 % (Abbildung 4)42erhöht.

In-vitro- transkribiert DsRNA kann effizient an polyphag Insekten mit Stiel Tap (Stamm Injektionen) von bestimmten DsRNA gen direkt in das Gefäß Gewebe des Werks, die von den Insekten erworben werden können, bei der Jagd auf solche Pflanzen44 geliefert werden (Abbildung 5). Für Zitrusbäume, die die DsRNA durch Stamm Injektionen ausgesetzt waren, konnte die DsRNA in Alter Zitruspflanzen (ca. 1 m hoch) nachgewiesen werden für 7 Wochen post-ein einmaliger Exposition mit 6 mL von 1,7 mg/mL DsRNA in einer Lösung von DNase/RNase freies Wasser (Abbildung 5A B). Dann durften Phloem-Fütterung hemipteran Insekten ernähren sich von diesen Wirtspflanzen mit DsRNA behandelt. Es wird angenommen, dass die DsRNA wurde erfolgreich infundiert und zog über das Gefäßsystem der Zitruspflanzen für die Einnahme von AKP-Staaten, die Sterblichkeit bei DsRNA-AK42unter Beweis gestellt.

Bioassays wurden von 2008 bis 2012 entwickelt, abgeschirmt durch eine Vielzahl von Topfpflanzen und gezeigt, um Lieferung DsRNA in einer Art und Weise zu erbringen, durch die Pflanzen absorbieren und translozieren DsRNA für systemische DsRNA Verbreitung41,42 . Eine Methode verwendet eine Ton saugfähige Komponente mit DsRNA Adsorption in die Ton-Matrix; Dies umfasst eine Vielzahl von Tonen, Bleicherde, Zeolith, u.a., als auch andere saugfähige Materialien, Zellulose, Nährböden, Biokunststoffe, etc. Clay Partikel Staub frei Nukleinsäure-Träger, die verwendet werden können sind, für die Bereitstellung von Wirkstoffen z. B. DsRNA Böden für Pflanze Aufnahme und schließlich Lieferung an Insekten (Abbildung 6). Komplexe Ton kann auch chemisch konfiguriert werden der DsRNA unter spezifischen pH-Wert oder Ionische Bedingungen freigeben. Clay Liefermethoden von DsRNA in Pflanzen haben gezeigt, Bereitstellung von DsRNA ins Eingemachte Zitrusbäume und andere Pflanzen für mehr als 14 Monate (Daten nicht gezeigt). Diese Delivery-System lässt sich Pflanzeneigenschaften, wie Blütenfarben, Wuchshöhe (verzwergung) oder andere ändern. Derzeit ist die primäre Verwendung dieser Methode für die Entwicklung eines effektiven Insekt-Schädling und Krankheitserreger (Viren) Steuerung oder Management. Der Ansatz kann kosteneffektiv für Baumschulen und Hausbesitzer sein und ist eine nicht-transgenen Methode.

Figure 1
Abbildung 1 . Lieferung von Nährstoffen oder DsRNA durch grüne Bohnen. (A) Segmente des schlanken Bio grüne Bohnen tauchten und absorbiert die Lösung in einem 2 mL Microcentrifuge Schlauch mit 300 µL DdH2O allein oder DdH2O mit grüne Lebensmittelfarbe, 3 h. Drei 4th Instar BMSB Nymphen waren ausgehungert nach 24 h und platziert in Kulturgefäßen zusammen mit 3 grünen Bohnen pro Schiff. (B) BMSB ernähren sich von Segmenten der grünen Bohnen in Wasser getaucht, von piercing durch die grünen Bohnen, die Nährstoffe mit ihren Stilett zu erreichen. (C) Tag 2 von der BMSB Fütterung Bioassay, Pfeile bezeichnen Ausscheidungen. 3. Tag (D); Erhöhte BMSB Ausscheidungen (gekennzeichnet durch den Pfeil) beobachtet Post Einnahme einer Lösung von DdH2O und grüne Lebensmittelfarbe durch grüne Bohnen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 . Quantitative RT-PCR-Analyse, die Niederschrift nach RNAi-vermittelten Erschöpfung der JHAMT und Vg in BMSB messen. Gesamt-RNS aus 3 einzelnen BMSB 4th Instar Nymphen gefüttert JHAMT (A) 20 µg (0.067 µg/µL) und Vg (B) 5 µg (0.017 µg/µL) DsRNAs in 300 µL DdH2O geliefert durch Segmente von grünen Bohnen, wurde isoliert und die Transkript Ebenen wurden durch qPCR gemessen. LacZ DsRNA (Mock) diente als Negativkontrolle. BMSB 18 s RNA wurde als interner Standard verwendet, um Unterschiede in der RNA Wiederherstellung von Gewebe zu korrigieren. Ergebnisse sind aus drei biologische repliziert, und Fehlerbalken zeigen SEM Ein One-Way Varianzanalyse (ANOVA) wurde durchgeführt, um für die statistische Signifikanz der Daten, p < 0,0001 testen. Ergebnisse reproduziert aus Ghosh Et al. 62 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 . Mündlichen Lieferung der Behandlung im Harlekin-Bug (M. histrionica ) mit Baby kohlgrüns. Bio-Baby-Grünkohl mit 0,2 % Natriumhypochlorit gewaschen, getrimmt und eingetaucht in ein 2 mL Cap-Less Microcentrifuge Schlauch mit 300 µL Lösung (A) DNase/RNase frei DdH2O oder (B) DNase/RNase frei DdH2 O-Lösung mit grüne Lebensmittelfarbe, für einen Zeitraum von 3 h. Drei 4. Instar HB Nymphen waren ausgehungert nach 24 h und dann in Kulturgefäßen und ernähren sich von diesen Collard Greens für 3 Tage. Weiße Pfeile zeigen Ausscheidungen am 3. Tag Post Fütterung beobachtet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 . BLATTSPRÜHMITTEL und Wurzel durchnässen Anwendung in Zitrusbäumen und Sämlinge. Der ausgewählten Pflanzen oder Sämlinge vorherige verwenden sind nicht bewässert, für 2-3 Tage, den Boden zu feucht, aber nicht vollständig trocken trocknen zu lassen. (A) die Bäume wurden zuerst gekrönt und 200 mL DsRNA-Lösung (0,5 mg/mL) in DNase/RNase freies Wasser wurde per hand aufgetragen Pumpe Sprühflasche zur unteren Kappe. (B) 100 mL DsRNA Lösung (1 mg/mL) in DNase/RNase freies Wasser wurde auf den Boden der Sämlinge in teilweise trockenen Böden angewendet. (C) 100 mL DsRNA-Lösung (1 mg/mL) in DNase/RNase freies Wasser auf die nackten Wurzeln der Sämlinge für ca. 3 h (D) angewendet wurde ACP Fütterung auf Sämlinge, die DsRNA durch die nackten Wurzeln absorbiert hatte zeigte erhöhten Mortalität von ACP. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 . Zitrus Sämling Baumstamm Injektion. Zitrus Sämlinge ca. 1 m hoch wurden mit DsRNA 1,7 mg/mL injiziert. (A) die Bohrlöcher in Zitrusfrüchten Sämlinge mit einem 10 mm Durchmesser Bohrer die Stängel der Pflanze des Injektors einzufügen. Die exponierten Kupfer Spitze von jedem Injektor war mit einem 0,6 cm (¼ Zoll) breiten Streifen des Versiegelns Film um auslaufen zu verhindern gewickelt. (B) Injektoren mit 6 mL farbige Lösung gefüllt wurden an den Stamm (Stamm) der Sämlinge angewendet. Injektoren wurden für ca. 6-10 h für die komplette Aufnahme der Lösung beibehalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 . Lehm Boden Änderungsantrag Lieferung von DsRNA in Pflanzen durch Boden. Eine neue Linie von liefern Material: Ton, der ein Staub frei Nukleinsäure-Träger für den Einsatz bei der Bereitstellung von Wirkstoffen wie DsRNA Böden für die Aufnahme in Pflanzen und letztlich in Insekten. Ungebrannten Ton (A) und (B) gebacken Ton abbildenden Toleranz/Wassereinlagerungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Potenzielle H. Halys Zielgene
Beitritt Größe Gen Namen/Homologie
XP_014293026.1 491 Vitellogenin-A1-wie (Vg) (Mögliche Isoformen: Vitellogenin-2-Like Isoform X1 XP_014291483.1; Vitellogenin-2-Like Isoform X2 XP_014291484.1).
XP_014290953.1 545 Juvenilhormon Säure O-Methyltransferase-Like (JHAMT) (Mögliche Homolog: Juvenilhormon Säure O-Methyltransferase XP_014283772.1).
Primer
PCR
Gen Namen/Homologie Primer-Name Sequenz
VG BMSB Vitellog P2 F CAATTTGATCCACCGACTGTT
VG BMSB Vitellog P2 R CCGCATGAATCTTACTCTGGA
JHAMT BMSB JH P1 F GGATGCTTATGAATAATCCAG
JHAMT BMSB JH P1 R GTATAGGATTGCCATTTTGG
T7 PCR
VG T7 BMSB Vitellog P2 4263 F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCAAAGTTGGAAGGGAATGA
VG T7 BMSB Vitellog P2 4753 R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCGCATGAATCTTACTCTGGA
JHAMT BMSB JH T7 P1 F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGATGCTTATGAATAATCCAG
JHAMT BMSB JH T7 P1 R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTATAGGATTGCCATTTTGG
LacZ T7 LacZ RNAi F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATGAAAGCTGGCTACAGGA
LacZ T7 LacZ RNAi R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCAGGCTTCTGCTTCAAT
AK DsAK-F TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA
AK DsAK-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC
AK DsAK 50-F TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA
AK DsAK 50-R TAATACGACTCACTATAGGGAGTGAAGCCCTTGTGGTAGTC
AK DsAK 30-F TAATACGACTCACTATAGGGAGACCCGGACTCTGGAGTAGG
AK DsAK 30-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC
GFP DsGFP-F TAATACGACTCACTATAGGGAGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTT
GFP DsGFP-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGTAATGGTTGTCTGGTAAAAGGA
qPCR
VG RT Vitellog P2 F TTGATAGTTGTTTGGATTTTGAAGGT
VG RT Vitellog P2 R TCTTACTTGATCAGCGCTCAGAA
JHAMT BMSB JH RT P1 F AGGAAAACCCAAAATGGCAAT
JHAMT BMSB JH RT P1 R ATGTATTCTTCTTTTGGATCTTTTCTTGAG
18 S BMSB 18 F3 ATGCCCCCGCCTGTCCTTATT
18 S BMSB 18 R3 TGAAAGCAGCCTGAATAGTGG
GFP GFP-F GGTAAAAGGACAGGGCCATC
GFP GFP-R TCAAGGAGGACGGAAACATC
AK AK Quant-F CGGACTTGAGGGAGAACTGA
AK AK Quant-R GTGGTAGATACCGCGACCAG
eine Wanne a-Wanne-F GCGTCTCTTCGGTTTGACGG
eine Wanne a-Wanne-R CACTTCACCATCTGGTTGGC

Tabelle 1. Oligonukleotid-Sequenzen für RNAi. Aufgeführt sind, die Gene und Oligonukleotide zur Erzeugung von PCR-Fragmente, DsRNA und qPCR Primer verwendet, um die Abschrift Ebenen analysieren.

Ergänzende Video 1: Nährböden und Gele als Absorptionsmittel für Lieferung und verzögerter Freisetzung von DsRNA. Hydratisiert, synthetischen oder natürlichen Nährböden und Gele mit DsRNA-Lösung, die als Köder oder Diäten für verschiedene Gliederfüßer verwendet werden kann. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen

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Discussion

RNAi erweist sich ein wichtiges Instrument für die Erkundung von Gen biologische Funktion und Regulation, mit großem Potenzial für die Verwaltung von Schadinsekten19,68,69,70, genutzt werden 71. das Design und die Auswahl an eine geeignete ursächlich für eine bestimmten Insektenarten und die Art der Zustellung der entsprechenden DsRNA(s) auf das Insekt Stummschaltung sind beide von größter Bedeutung. Die optimale Methode für die Bereitstellung von DsRNA in ein Insekt muss empirisch, sowie die relative Dosis-Auswahl für die Lieferung bestimmt werden, da bestimmte Methoden vor- und andere Einschränkungen bieten. Für die Entwicklung eines molekularen verwand, die letztlich zur ökologischen Freigabe geeignet sein kann, ist machbar, effiziente und günstige Versandart erforderlich. Beispielsweise ist topisch applizierten DsRNA gezeigt, um wirksam zur DsRNA Lieferung für Schädlingsbekämpfung, Zitrusfrüchten und Weinreben42,44. Innovative Strategien wie Einsatz von Ködern, Saccharose-Lösungen, Hefe oder Bakterien DsRNA Produktion zur direkten Einnahme, topische Anwendung von DsRNA auf Pflanzen oder Produktion von spezifischen DsRNAs von veränderten transgene Pflanzen, haben die Entwicklung vorangetrieben. wirksame Kontrollen RNAi-basierten19,72.

Ein gutes Beispiel ist hier gezeigt, mit dem Einsatz von grünen Bohnen liefern DsRNA (Abbildung 1 und Abbildung 2) entwickelt, um gezielt beeinflussen und reduzieren einen Insekten-Schädling von globaler Bedeutung. Das neuentwickelte Gemüse vermittelten DsRNA Übermittlungsprotokoll mit Segmenten aus grünen Bohnen eingetaucht und mit DsRNA gesättigt wurde, effektiv die spezifische Zielgene für Larvalentwicklung in BMSB verwendet. Grüne Bohnen sind eine der vielen Gemüse, die durch BMSB verschlungen werden und so dienten diese als Medium DsRNA liefern. Andere Medien der DsRNA Lieferung waren getestet (Daten nicht gezeigt) aber erfolglos bei der Versorgung Ernährung BMSB möglicherweise aufgrund von Unterschieden in der vaskulären Textur. Daher verwendet wir Segmente von grünen Bohnen, in Vitro synthetisiert um DsRNA BMSB Nymphen zu liefern. Die Nukleinsäuren, geliefert durch eine Pflanze oder ein Gemüse vermittelte Technik möglicherweise potenziell induzieren RNAi in das Insekt der Wahl, da hier mit Erschöpfung der JHAMT und Vg Gene BMSB (Abbildung 2)62beobachtet.

Diese pflanzlichen vermittelten DsRNA Übermittlungsprotokoll wurde erfolgreich verwendet, um RNAi in BMSB, sondern auch in HB mit Grünkohl (Abbildung 3), obwohl Bereitstellungsstrategien zu induzieren und Methoden müssen für jedes Gen und Insekt optimiert werden. Daher empfiehlt es sich, dass verschiedene Methoden für die Lieferung sowie über mehrere Gene von Interesse individuell ausrichten oder durch Stapeln von mindestens zwei DsRNAs Erlangung besser phänotypischen Penetranz getestet werden. Verschiedene Methoden wurden zusammengefasst, für die DsRNA Lieferung an Insekten und Insektenzellen einschließlich Fütterung13,22, einweichen73,74, Mikroinjektion75und andere Techniken,76 für verwendet DsRNA Aufnahme systemische RNAi induzieren. Neuere Methoden zur mündlichen Lieferung von DsRNA induzieren RNAi in andere Insekten durch Einnahme an behandelten nicht-transgenen Pflanzen wurden auch erforscht (Abbildung 4, Abbildung 5und Abbildung 6). Zitrusbäume wurden nachgewiesen, DsRNAs entweder durch Wurzeln aufzunehmen, ergeben sich Tap (Stamm Injektionen) oder Blatt-Sprays42,44. Zuvor wurden Zitrusbäumen und Reifen Weinreben mit Insekt spezifische DsRNA entsprechend der AK-gen in AKP-Staaten und GWSS behandelt. Diese behandelten Pflanzen führte zu einem Anstieg in der Sterblichkeit für die AKP-Staaten und GWSS für bis zu verschiedenen Längen der Zeit41,45. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass DsRNA Expression bestimmter Gene in den untersuchten Tieren behindern kann.

Herausforderungen, die erfolgreiche verstummen der Genexpression beeinflussen sind eindeutige Gruppen von DsRNA Nukleasen (DsRNases) zum Ausdruck gebracht, vor allem im Darm Gewebe von Insekten und Speichel Sekrete oder den Darm-pH, die möglicherweise verantwortlich für den Abbau von DsRNA47 ,77,78. Aber um diesen Abbau zu überwinden, systemische RNAi kann induziert werden effizient bei Insekten durch Nutzung höhere Konzentrationen an DsRNA und/oder Nutzung PEG in der Ernährung für die mündlichen Lieferung von Gen-spezifischen DsRNA Überwindung solcher Abbau62, 79. Lieferung und Einführung von DsRNA können ebenfalls stabilisiert werden mit Hilfe der trägermoleküle, wie Nanopartikel80 wie Chitosan48, Liposomen wie Lipofectamine 2000 und Metafectene76, Polyethylenglykol79, Ton Nanosheets81, und Carbon Quantum Dot50. Forschung ist im Gange, um wirksame Verbesserung der DsRNA mit Agar und Gel Stücke mit Gen spezifische DsRNA infundiert (Daten nicht gezeigt, siehe zusätzliche Video-4). Diese Technik kann für die Lieferung von einer wirksamen Dosis von DsRNA an Ameisen verwendet werden, die die DsRNA infundiert, Harz oder Agar zum Nest als Nahrung tragen kann.

Neben der Stabilität der DsRNA ist langfristige Ausdauer der DsRNA in Pflanzengewebe von Bedeutung, insbesondere für landwirtschaftliche Kulturen. DsRNA verteilt durch Vascular Gewebe von Pflanzen, Obst oder Gemüse kann mit reduzierten Enzymaktivität vor wird von Insekten induzieren die RNAi-Mechanismus aufgenommen im Xylem und Phloem ansammeln. Es kann für bestimmte erforderlich sein, dass Anwendungen DsRNA haben für einen kurzen Zeitraum, wie z. B. für 6 Tage in grünen Bohnen oder länger, für 36 h in den Boden62,82 bestehen damit die Anhäufung von Nukleinsäuren in der Umwelt unwahrscheinlich wird. Jedoch Neena Et Al. zeigten, dass Nanosheets große DsRNAs vor vorzeitigem Abbau als schützen sowie vermitteln ihre verzögerter Freisetzung auf Blattoberflächen über einen Zeitraum von mindestens 30 Tagen81.

Insgesamt könnte die DsRNA Bereitstellungsstrategien diskutiert hier verwendet werden, Insekten spezifischer Gene zur Schädlingsbekämpfung zum Schweigen zu bringen. Lieferung von DsRNA Pflanzen durch Bewässerungswasser, Wurzel durchnässen oder Stamm Injektion könnte eine wirksame Strategie für Schadinsekten wie Wurzel Anleger, für die keine wirksame Kontrolle-Methode derzeit verfügbar ist. Lieferung von DsRNA mit einem Träger oder Stabilisierung Medium wie Ton oder Agar kann direkt auf den Boden für die Aufnahme von Pflanzen hinzugefügt werden. Einer der Hauptgründe für langsame Fortschritte bei der Entwicklung von RNAi vermittelte Molekulare Biopestizide wurde der Mangel an effiziente orale Bereitstellung Techniken zur effizienten RNAi und Stabilität unter Umweltbedingungen83zu initiieren. Die mündlichen Lieferung, die hier beschriebenen Methoden in der Zukunft verwendet werden können für die Bereitstellung von Nukleinsäure-vermittelte gen-silencing Behandlungen um zu Pflanzen sap Fütterung sowie kauen Insekten Insektenbefall in der globalen Nahrungsmittelproduktion reduzieren und entwickeln nachhaltige ökologische Schädlingsbekämpfung Management.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren erkennen dankbar Donald Weber und Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) für die Bereitstellung von BMSB und HB für Experimente und Pflege der Kolonien; und Maria T. Gonzalez, Salvador P. Lopez, (USDA, ARS, Fort Pierce, FL) und Jackie L. Metz (Universität von Florida, Fort Pierce, FL) für Kolonie Wartung, Probenvorbereitung und Analysen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMSB (H. halys) insects  USDA
ACP (D. citri) insects  USDA
organic green beans N/A
Citrus plants USDA
sodium hypochlorite solution J.T. Baker
green food coloring  McCormick & Co., Inc
Thermo Forma chambers  Thermo Fisher Scientific
Magenta vessel (Culture) Sigma
Primers  IDT DNA
SensiMix SYBR Bioline
qPCR ABI 7500 Applied Biosystems 
Spray bottle N/A
Parafilm American Can Company
TaKaRa Ex Taq Clontech
QIAquick Qiagen

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Umweltwissenschaften Ausgabe 135 Lieferung braune Marmorated Gestank Bug asiatische citrus Psyllid RNA-Interferenz Einnahme Hemiptera
Double-Stranded RNA Oral Liefermethoden induzieren RNA-Interferenz im Phloem und Pflanze-Sap-Fütterung Hemipteran Insekten
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Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B., Park, A. L., Gundersen-Rindal, D. E. Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects. J. Vis. Exp. (135), e57390, doi:10.3791/57390 (2018).

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