Summary
Denne studien utforsker romanen bruk av enzym-baserte microelectrode matrise (MEA) teknologi for å overvåke i vivo nevrotransmitter aktivitet i grisunger. Hypotesen var at glutamat feilregulering bidrar til mekanisme bedøvende nevrotoksisitet. Her presenterer vi en protokoll for å tilpasse MEA teknologi for å studere mekanismen for anestesi-indusert nevrotoksisitet.
Abstract
Hvert år gjennomgår millioner av barn anestesi for en rekke prosedyrer. Men har både dyr og mennesker kalt inn spørsmålet sikkerheten til anestesi i barn, implicating bedøvelse som potensielt giftig for hjernen i utvikling. Hittil har ingen studier ble belyst mechanism(s) som anestesi kan være nevrotoksiske. Dyrestudier at etterforskningen av slike mekanismer, og neonatal grisunger representerer en utmerket modell å studere disse effektene på grunn av sin slående utviklingsmessige likheter med den menneskelige hjernen.
Denne protokollen tilpasser bruken av enzym-baserte microelectrode matrise (MEA) teknologi som en ny måte å studere mechanism(s) av anestesi-indusert nevrotoksisitet (AIN). Tiltak aktiverer sanntids overvåking i vivo nevrotransmitter aktivitet, og tilbyr eksepsjonell timelige og romlig oppløsning. Det er en teori om at bedøvende nevrotoksisitet skyldes delvis glutamat feilregulering og tiltak tilbyr en metode for å måle glutamat. Romanen gjennomføringen av MEA teknologi i piglet modell presenterer en unik mulighet for studiet av AIN.
Introduction
Hvert år gjennomgår millioner av barn anestesi for både invasive og ikke-invasive prosedyrer i USA1. For år, har anestesi leverandører beroliget foreldre for anestesi, selv i små barn og nyfødte. Men i 1999 ble det funnet at midlertidig blokkering av N-methyl-D-aspartate (NMDA) undertypen av glutamat reseptorer i løpet av tidlig liv føre utbredt neuronal apoptose rotter2. Nylig FDA ut en narkotika sikkerhet kommunikasjon som krever etikettene bedøvende narkotika inkluderer en advarsel om generell anestesi og deres potensielle negativ effekt på utvikling hjernen barn yngre enn 3 år (USAs mat og Drug Administration, 2017). Men er det fortsatt behov for å belyse mulig mekanismer og potensielle neuroprotective tiltak.
Normal aktivitet av nevrotransmittere som glutamat og gamma-amino butyric acid (GABA) er avgjørende for normal neurodevelopment oppstår. Selv om de fleste veier i AIN er fortsatt flyktig, er nevrotransmitter systemer svært sannsynlig å være involvert siden anestesi er kjent for å modulere disse stier å produsere bevisstløshet. Spesielt forårsaker eksitatoriske signalstoffet glutamat excitotoxicity når det er dysregulated. Denne nevrotransmitter er normalt involvert i neurogenesis, neural plastisitet, synaptic og nevrale vekst og en rekke andre kritisk viktig hjernefunksjoner. Men kan langvarig aktivering av glutamat reseptorer forårsake excitotoxicity og neuronal apoptose, spesielt under stress forhold som kirurgi, oksygenmangel og redusert energi tilgjengelighet3. Binding av glutamat til NMDA har reseptor vist å forårsake Na+ og Cl− tilstrømningen. Den påfølgende depolarization antas å føre til Ca2 + kanal åpning og utgivelsen av intracellulær Ca2 + lagrer4. Dette dysfunksjon sannsynlig fører til en kaskade av metabolske derangements som til slutt redusere neuronal spredning, forhøye inflammation og føre til nevronale døden. Til tross for disse hypoteser fortsatt de sanne mechanism(s) av AIN uklart5. På grunn av sin rolle i apoptose representerer glutamat feilregulering en ny sti som bidrar til at mekanismen av tidligere dokumenterte neuronal apoptose, en funksjon i AIN.
En av hindringer på studier av neuronal prosesser er høy kompleksitet, spesielt i innstillingen for neuronal utvikling. De første månedene av livet er perioden av maksimal sikkerhetsproblemet for skade, under som de fleste av de viktige trinnene neuronal utvikling som fysiologiske apoptose (neuronal beskjæring), synaptogenesis, gliogenesis og myelination ta sted6 . Gitt den komplekse naturen neuronal kommunikasjon og vanskelighetene med å studere disse prosessene uten å forstyrre normal CNS-funksjon, har ny teknologi blitt utviklet som mål i vivo gjenkjenning og kvantifisering av viktige elementer neuronal kommunikasjon.
Enzym knyttet MEA teknologien ble brukt i denne studien som en ny måte å studere mekanismer for AIN i en klinisk relevante piglet modell. Denne teknologien kan brukes til å studere kompleks i vivo elektrokjemiske hjernen prosesser, inkludert glutamat feilregulering. Webområdene innarbeidet 4-kanals platina opptak av tiltak (2 glutamat-sensitive områder og 2 sentinel nettsteder) tillate selvrefererende, som bidrar til gjenkjenning nøyaktighet. I tillegg en utelukkelse lag gjelder hver elektrode, overdragelse selektivitet ved å hindre at andre forstyrrende molekyler blir oppdaget7. Videre gir Lavprofils utforming av MEA minimal vev traumer sammenlignet med tidligere teknologier. Denne samme funksjonen gir til tiltak høyere romlig oppløsning, som muliggjør studiet av mikroskopiske regioner i hjernen. Diskrete områder av hippocampus (dentate gyrus, CA1, ca 2) kan for eksempel være spesielt studerte8. Detaljerte opplysninger om funksjonaliteten til tiltak har vært beskrevet tidligere9.
I forhold til MEA elektrokjemi, microdialysis inneholder en membran mellom løsningen rundt og en løsning av lignende komposisjon, slik at påvisning av ekstracellulære væske endres10. Selv om microdialysis er en bærebjelke i neurochemistry og har lenge vært brukt for påvisning av nevrotransmittere, har det ulempen med lav tid oppløsning, forsinket påvisning av glutamat endring og betydelig vev traumer11.
Tiltak kan indirekte oppdage signalstoffer som glutamat, acetylcholine og kolin, ved hjelp av riktig oksidase enzymer som produserer electroactive reporter molekyler som H2O2 eller O212,13 .
MEA teknologi har vært mye brukt i rotter og ikke-menneskelige primater for studier av nevrotoksisitet i sammenheng med patofysiologiske prosesser enn AIN7,14. Blant noen av prosessene patofysiologiske, har MEA teknologien vært brukt for studier av Alzheimers, epilepsi, traumatisk hjerneskade og effekten av farmakologiske forbindelser på synaptic kommunikasjon8,15 , 16 , 17. selv om tiltak har blitt brukt til å studere disse patologi i rotter og ikke-menneskelige primater, høy utviklingsmessige likheten mellom mennesker og piglet hjernen gjør tilpasning av MEA teknologien i grisunger en velegnet teknikk for å studere AIN mechanism(s)18.
Protocol
Grisunger (Sus scrofa) mottas gjennom gården forhåndsgodkjent av The Ohio State University (OSU) institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC). Etter godkjenning av protokollen, dyr experimentations er gjort i henhold til IACUC policy.
1. grisunger og Piglet håndtering
- Bruke mannlige og kvinnelige grisunger i en systematisk og randomiserte måte å eliminere alle potensielle sex-baserte forstyrrende faktorer i samsvar med ANKOMME retningslinjer19.
Merk: Siden maksimal hjernens vekst er innen 3-5 dager fødselsdato piglet, eksperimentering er gjort utelukkende med grisunger 3-5 dager gamle. - Sikre grisunger ankom vivarium minst 24 timer før forsøket å tillate acclimation å miljøet.
Merk: Erfarne veterinær personalet yter rutinemessig dyr omsorg. Grisunger blir holdt i individuelt temperatur vedlikeholdt, overvåkes kontinuerlig bur og motta en ernæringsmessig komplett melk ombytte annonse libitum for å hindre hypoglykemi. Grisunger blir også holdt uten melk erstatning (null per os), minst 3 h før anestesi og leveres med tepper og leker å sikre normale nivåer av stimulering. Hvis mulig, holde flere grisunger i samme buret slik at sosialisering.
2. utvikling og tilpasning av tiltak for AIN studier i Piglet modell
Merk: Denne teknologien bruker enzym-baserte tiltak som er pre-belagt med enzym og galvanisert med m-phenylenediamine dihydrochloride (mPD). Elektrodene var tilpasset designet med en 40 mm stive aksel og produsert for bruk i grisunger (figur 1).
- For å unngå redundans, kan du se en detaljert beskrivelse av MEA forberedelse og kalibrering som tidligere beskrevet15 (figur 2).
3. anestesi og bruk av egendefinerte Stereotaxic apparater for Piglet
- Bedøve dyr bruker en bedøvelse arbeidsstasjon med en passende vifte og overvåking enheter og overvåke fysiologiske parametre som puls oximetry, ikke-invasiv blodtrykk, electrocardiography og temperatur i hele den helheten av eksperimentet som tidligere beskrevet19. Intubate og ventilere grisunger og administrere desflurane anestesi på 1 minimum alveolar konsentrasjon (MAC) (ca 2,5-3%) for 3,5 h. Kontroller at utdannet laboratorium stab medlemmer er presentere for disse eksperimentene. Pels overliggende det kirurgiske området fjernes med elektrisk avklipt før utarbeidelsen av huden.
Merk: Konsentrasjonen og varigheten av bedøvelse brukes tillater å simulere lengden faktisk anestesi eksponering under en kirurgisk prosedyre. Dessuten er desflurane de vanligvis benyttes general anesthetic i pediatric befolkningen gjør etterforskningen rundt sin sikkerhet av største betydning. - Før plassering i stereotaxic rammen, starter en rocuronium lasting dose 2,5 mg/kg og en infusjon av 1.5 mg/kg/t å forhindre dyr bevegelse mens sikret i rammen.
- Sted piglet i piglet-spesifikke stereotaxic ramme etter en tilstrekkelig dybde av anestesi er bekreftet av toe-klype.
- Gi tilstrekkelig polstring i stereotaxic rammen ved å plassere piglet på en tvungen luft oppvarming blokk med ekstra polstring (f.eks, fluidized positioner) å unngå Press magesår.
- Plasser tennene av øvre mandible over tannen bar (Figur 3).
Merk: Baren tann bør være på et tilstrekkelig nivå å holde skallen veldig godt på plass. - Fastsette og stram de gjennomtrengende øret stolpene i ørene, ta vare for å sikre at piglet er i midtlinjen. Plasser pekte tips av sideveis holder i ørekanalen og sett inn øret barer godt nok høre "pop" lyden forbundet med utbredelsen av trommehinnen. Godt feste øret barer til skallen og sett til samme dybde på hver side for å hindre bevegelse på skallen under eksperimentet (Figur 4Panel A).
Merk: Det er viktig å holde piglet varme (~ 37,8-38,6 ° C) og kontinuerlig overvåke temperaturen under hele prosedyren for vedlikehold av normothermia. Dette kan oppnås via et teppe og/eller en varmelampe. Husk å plassere varme lampen på en passende avstand å unngå brenning av dyrets hud.
- Opprette en 4-6 cm midtlinjen snitt langs skallen bruke forsiktig for å unngå scoring skallen med skalpell. Når i snitt er gjort, kan du bruke milde retraction og sløv disseksjon for å heve hodebunnen fra skallen. Forsiktig skrubbe skallen med en gauze pute å fjerne alle bindevev og utsette Sutur linjene (Figur 4panelet B).
Merk: Det er ikke nødvendig for å opprettholde sterilitet under ikke-overlevelse eksperimenter. Imidlertid må sterilitet opprettholdes under overlevelse eksperimenter. - Videre reflektere hodebunnen, hvis nødvendig, til å vise området av interesse og finne plasseringen for craniotomy (figur 5Panel A). Bruke en kirurgisk drill til å lage et craniotomy vindu ca 0,25 cm2 (kan være større eller mindre avhengig av eksperimentelle mål) overliggende strukturen av interesse, bruker forsiktig ikke for å skade dura eller underliggende hjernen (figur 5 , Panel B). Bruke fine kirurgisk saks for å avgiftsdirektoratet dura overliggende hjernevev (figur 5panelet C).
- Plasser elektroden som vertikalt som mulig over bregma ved å sikre metall armen av headstage til micromanipulator av piglet stereotax. Lavere elektroden som mulig uten å berøre overflaten av skallen. Registrere koordinatene til bregma (figur 6Panel A).
- Bestemme anterior-posterior og mediale-lateral koordinater og dybden av interesse i forhold til bregma. Bestemme stereotaxic koordinatene ved hjelp av en art og alder-passende stereotaxic atlas. I dette tilfellet, bruk en stereotaxic atlas utviklet spesielt for grisunger20.
- Omplasser elektroden slik at beliggenheten er riktig anterior-posterior og mediale-lateral, at både i microelectrode og apparatet er vinkelrett på overflaten. Sted pseudo referanse elektroden under hodebunnen, sikrer kontakt med dyr (figur 6panelet B).
- Sakte og forsiktig, lavere elektroden til riktig dybden i hjernen ved hjelp av stereotaxic armen. For de siste 2 mm, bruke en hydraulisk microdrive for ytterligere å styrke elektroden den nøyaktige plasseringen (figur 6panelet C).
Merk: Elektrode stillingen skal skal ligge over vinduet craniotomy. Elektroden dybden vil variere avhengig av hjernen strukturen av interesse. Det er ikke nødvendig å lukke innsnitt ved ferdigstillelse av datainnsamling i ikke-overlevelse eksperimenter.
4. måling av ekstracellulære glutamat Under desflurane anestesi
- Kontroller at piglet er under kontinuerlig fysiologiske overvåking gjennom hele denne prosedyren. Grisunger er anesthetized inhalationally (via ansikt membran) i forberedelse til prosedyren.
- Etter implantasjon av MEA, vente 30 min å tillate elektroden nå planlagt for å sikre at riktig mål oppnås 3 h (figur 7).
- 0.25% bupivacaine (1 mL/kg) administreres subcutaneously på stedet av kirurgi for postoperativ smerte ledelse. I tillegg er vedvarende-release buprenorfin gitt subcutaneously q72h etter behov.
5. perfusjon og offer
- Utføre perfusjon og hjernen vev samlingen prosedyrer som beskrevet tidligere21. For ikke-overlevelse operasjoner euthanized dyr umiddelbart etter eksperimentering mens fortsatt under narkose.
- Ta brutto tverrsnitt av fast piglet hjernen og bruk * lys for å visualisere sporet av elektroden som beskrevet tidligere22 tillate verifisering av MEA plassering, sikre riktig plassering i området rundt.
Representative Results
Denne proof-of-concept studie med enzym-basert keramiske MEA teknologi i en piglet modell kan gi enestående innsikt i glutamat dynamikken underliggende AIN. Denne studien videre viser at enzym-basert MEA teknologi kan tilpasses vellykket i piglet modellen å måle fysiologiske og anestesi-assosiert nevrotransmitter aktivitet med høy følsomhet, og høy romlig og tidsmessige oppløsning. Fysiologiske homeostase ble opprettholdt gjennom hele våre eksperimenter ved hjelp av klinisk relevante metoder og standarder, og ingen piglet viser tegn til fysiologiske forstyrrelser.
Dataene innhentet angir evne til tiltak for å nøyaktig og romlig løse nevrotransmitter målinger i kortikale og sub kortikale hjernen strukturer. Bruk av en stereotaxic apparater kan klare identifikasjon av en referanse overflaten struktur (bregma) for å finne konsekvent regionen rundt, uavhengig av individuelle forskjeller piglet og anatomi. Tydelig visualisering av bildet forenkler konsekvent regionale plassering av MEA med nøyaktighet i området mikrometer (Figur 4). Å få tilgang til kortikale overflaten av hjernen er minimal traumatisk med ubetydelig blødning, sikre at alle i vivo glutamat dynamics ikke er på grunn av utilsiktet systemisk eller lokale fornærmelse (figur 5). Egendefinert, stive MEA justeres deretter vinkelrett frontal flyet piglet (figur 6). Unnlatelse av å riktig justere MEA før innsetting kan hindre nøyaktig romlige opptak av målrettet regionen, spesielt for subkortikal regioner.
Sanntid i vivo glutamat målinger ble tatt i hippocampi av 3-4-dagers gammel grisunger (n = 4) under 2,5-3% desflurane anestesi (ca 1 MAC). Amperometry mål var innspilt på 4 Hz og konvertert til konsentrasjon bruke en lineær regresjon basert på kalibrering parametere (Figur 8A-panelet). For hvert punkt, var signalene fra to glutamat-sensitive områder gjennomsnitt før trekke gjennomsnitt sentinel signalet til en korrigert glutamat signal. Disse kontinuerlig målinger ble glattet ved å bruke et glidende gjennomsnitt for bedre å visualisere den generelle trenden over tid (Figur 8panelet B). Mener basale glutamat konsentrasjonen var beregnet til 4.61 ± 0,02 µM og relativt stabilt i løpet av bedøvende eksponering. Midlertidig glutamatergic aktivitet ble identifisert i ett dyr ved å analysere toppene i signalet som ikke var korrelert med sentinel signalet (R2 < 0,5) og overskredet signal-til-støy forholdet 3 (figur 9A-panelet). Totalt 116 forbigående topper oppdaget over en periode på 3,5 t (Figur 10Panel A). Amplituden til de resulterende forbigående toppene ble vanligvis observert for å være innen 1 µM (Figur 10panelet B). For å kvantifisere varigheten av hver forbigående, ble tiden (t80) som kreves for hver maksimal toppverdien forfalt 80% oppnådd (figur 9panelet B). Mener t80 av alle glutamat transienter i 3,5 h opptaket perioden var 4,68 ± 0,82 s (Figur 10panelet C). Disse dataene viser at det er mulig å måle både langvarig og forbigående nevrotransmitter aktivitet i en subkortikal regionen bedøvet piglet hjernen.
Figur 1: Visual sammenligning av SG-2 microelectrode matrisetyper. SG-2 matriser inneholder to glutamat-sensitive og to glutamat-ufølsom sentinel områder (150 µm x 20 µm per område). (A) en fleksibel-aksel microelectrode matrise vises til venstre. Stive-aksel microelectrode matrisen var spesiallaget for bruk i grisunger og tillatelser dypere implantasjon i store dyr. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: oversikt over microelectrode matrise forberedelse og kalibrering prosessen. Totalt MEA forberedelse og kalibrering siste omtrent en uke. Den belegg enzym, utelukkelse lag og kalibrering analytter er spesifikke for nevrotransmitter rundt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: plassering av piglet i stereotaxic apparatet. Piglet munnen er plassert på munnen bar direkte bakenfor canine tennene. Gjennomtrengende øret barer settes inn i det øre kanaler å sikre den bakre enden av skallen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: plassering av piglet i de stereotaxic apparatet for craniotomy. (A) piglet's hode er tett sikret i egendefinerte stereotaxic rammen, sikrer konsekvent plassering av MEA. Equidistant plassering av gjennomtrengende øret barer er synlig. (B) midtlinjen anterior-posterior snitt langs hodebunnen. Scoring av skallen ble unngått å visualisere koronale og sagittal suturer og optimere visualisering av bregma. Skala-linjen vises som angir den relative størrelsen på snittet og plasseringen av craniotomy-vinduet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Craniotomy for tilgang til hippocampus. (A) hodebunnen ytterligere reflektert for å avsløre den omtrentlige posisjonen til MEA innsettingspunktet etter stereotaxic koordinater. Innringet området merkes (svart prikk) for å lede craniotomy. (B) i craniotomy vinduet (0,25 cm2) med skallen klaff fjernet for å avsløre den underliggende dura mater. (C) meninges forsiktig fjernet for å avsløre overfladisk hjernebarken uten vev traumer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: MEA posisjonering og innsetting hippocampus. (A) plassering av MEA på bregma å bestemme en relativ stereotaxic plassering av hippocampus. (B) Stereotaxic plassering av MEA på hjernen overflaten å fastsette innsetting hippocampus. Sølv pseudo referanse elektrode trygt plassert under hodebunnen (angitt med pil). (C) MEA inn på riktig dybde å få sanntid, i vivo ekstracellulære glutamat målinger prefiks. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: MEA atferd i 30-minutters baselining perioden. Den første raske økningen tilsvarer nedstigningen av MEA i hippocampus ved hjelp av micromanipulator. Den opprinnelige perioden begynner når MEA har nådd passer dybden (stiplet linje). Ekstracellulære glutamat mål reduseres over en periode på 30 min, og bør ikke tolkes som fysiologiske målinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: sanntid ekstracellulære glutamat målinger prefiks av en neonatal gris under desflurane anestesi. (A) bevegelige gjennomsnittet av glutamat konsentrasjonen prefiks av en neonatal gris under desflurane anestesi (med 10 datapunkt). Målinger ble tatt ved 4Hz for 3t etter en kort 30 min baselining periode. (B) glatting av glutamat mål med et glidende gjennomsnitt 100 poeng i hvert 15 min bedre visualisere trenden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: Identifikasjon av forbigående glutamat aktiviteten prefiks av en neonatal gris under desflurane anestesi. (A) forbigående glutamat topper (i rødt) angis sporing i sanntid glutamat. Toppene ble vurdert betydelig når signalet til støyforhold overskredet 3 og deres signal ikke er korrelert med sentinel signalet (R2 < 0,5). (B) en representant forbigående peak identifisert i figur 9A-panelet. Stiplede linjer angir total varighet kreves for toppen forfalt 80%. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10: karakterisering av glutamat transienter prefiks av en neonatal gris under desflurane anestesi. (A) A antall forbigående glutamat topper i 15 min hyller. Toppene ble vurdert betydelig når signalet til støyforhold overskredet 3 og deres signal ikke er korrelert med sentinel signalet (R2 < 0,5). (B) amplituden til forbigående glutamat topper. Feilfelt viser standard feil av gjsnitt. (C) mener T80 av forbigående glutamat topper. Feilfelt viser standard feil av gjsnitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Fra starten av eksperimentet, må piglet's fysiologiske homeostase vedlikeholdes som beskrevet i dette laboratoriet forhånd publikasjon21. Minimal overvåking bør inkludere puls oximetry, electrocardiography, capnography, ikke-invasiv blodtrykk og temperatur. Utdannet etterforskere er nødvendig for at fysiologiske forstyrrelser (f.eks, hypo/hypertermi, hypoksi, hypotensjon, arytmi) kan bli riktig korrigert.
Før induksjon utføres i vitro MEA kalibreringer for å etablere funksjonalitet og selektivitet av MEA under kjent forhold. Kalibreringen og plating av tiltak er avgjørende for effektiv bruk av teknologi. Det er mange mulige feil som kan oppstå under kalibrering. Kalibreringen kan identifisere disse problemer samt uriktig plating, som fører til feil interferent svar. En mer detaljert tabell beretning om feil som kan oppstå MEA svar er utarbeidet, sammen med kjente årsaker og foreslåtte løsninger, som bør være et nyttig verktøy for sannsynlig feilsøking (tabell 1). Det er viktig å merke seg at før både kalibrering og plating, skal glass referanse elektrode kontrolleres for luftbobler eller hvit misfarging, som enten vil negativt påvirke MEA funksjon og opptak nøyaktighet.
| Symptom | Årsak | Korrigerende tiltak |
| Ingen Signal | Elektroden ikke tilkoblet | Koble riktig elektroden til headstage og headstage rask amperometry systemet. |
| Ingen strøm til rask amperometry systemet | Slå på strømbryteren på baksiden av rask system | |
| Signal bråk | Elektroden forurenset av blod | Kontinuerlig vanne hjernen overflaten under elektrode innsetting |
| Stoffet elektroden i dH2O | ||
| Enzym belegg er løs | Rengjør og recoat elektroden | |
| Referanse elektrode ikke er satt inn eller belagt | Pels og plasserer referanse elektrode lenger under skalpen | |
| Elektroden registrerer bevegelse av hjernen overflate | Vanligvis oppstår i overfladisk strukturer. Sett inn elektroden dypere (1 mm samtidig) hvis mulig | |
| Dyr bevegelse | Dyr er mangelfullt sikret | Flytte dyret i bakre retning til bedre sikre earbars på skallen. Eventuelt heve torso å tillate bedre kroppen justering. |
| Dyr er ikke tilstrekkelig anesthetized | Kontroller integriteten til anestesi utstyret. Sjarmere anesthetic til en effektiv dose og administrere en intramuscular rocuronium dose (5 mg/kg) | |
| Unøyaktig elektrodeplassering | Elektroden ikke er riktig justert | Justere elektroden mens riktig kobling til headstage. |
| Stereotaxic koordinatene er unøyaktig | Kontroller at piglet atlas refereres ikke bruker et annet referansepunkt eller fly av justering. | |
| Pass på at du ikke skjule Sutur merkene scoret skallen. |
Tabell 1: instruksjoner for feilsøking MEA bruke grisunger. Mulige årsaker og korrigerende tiltak for å hjelpe med søkemotoroptimalisering og feilsøking.
En stereotaxic atlas for piglet brukes til å bestemme stereotaxic koordinatene til området av interesse med hensyn til et kjent punkt som bregma18. Øret barer skal være ordentlig sikret for å sikre at skallen nivå og fullt immobilisert. Forsiktighet bør utvises under midtlinjen innsnitt av hodebunnen å unngå scoret skallen som dette kan påvirke visualisering av Sutur linjene. Vinduet craniotomy bør være store nok til å huse MEA.
Denne protokollen presenterer en rekke tekniske utfordringer som krever en velfylt drift suite og en etterforsker/team dyktige i kirurgiske og anesthetic aspekter av protokollen. Modellen presenterer i tillegg økonomiske begrensninger i at piglet modellen er dyrere enn den gnagere modellen; Det er imidlertid betydelig mindre kostnadskrevende enn bruk av ikke-menneskelige primater, som kan koste tusenvis av dollar. Bruk av MEA teknologi presenterer sine egne utfordringer, som av belegg og plating elektrodene manuelt krever dyktige etterforsker eller assistent å sikre tilstrekkelig selektivitet og pålitelig funksjon. Microelectrodes selv er skjøre, som de er laget av keramikk, og dermed lett skadet hvis riktig forsiktighet ikke er observert. Microelectrodes er utsatt for interferens fra andre elektriske enheter, som kan lage støy i innspillinger, og blod på operative området, som kan occlude webområdene opptak. Behovet for spesialisert utstyr presenterer en ekstra byrde som en stereotaxic kirurgisk ramme må være tilpasset bygget for å nakkens piglet skallen under implantasjon. Stereotaxic rammen og glutamat oksidase elektrodene seg er alle kostbare. I tillegg utgjør mangel på en piglet stereotaxic atlas fra innenfor det siste tiåret tekniske begrensninger som krever spesialkompetanse å bestemme spesifikke plasseringen av dype strukturer i hjernen piglet. Utviklingen av en ny stereotaxic atlas, muligens bruker magnetisk resonans imaging, ville øke muligheten for å bruke denne teknologien i grisunger.
Piglet er en klinisk relevante modell for studiet av AIN hovedsakelig på grunn av parallellene som eksisterer mellom denne arten og menneskelige neonate, som begge har lignende hjernens struktur og utvikling. I motsetning til vanlige modeller som mus eller rotter har piglet en større CNS likhet til mennesker, som låner til translatability modellen resultater. Piglet modellen er i tillegg billigere og innebærer mindre komplisert behandling enn en ikke-menneskelige primas modell. Piglet modellen skal undersøke prosessen av hvilke anestesi kan indusere utviklingsmessige nevrotoksisitet måle dens bidrag til nevrologiske skader og bekjempe spørsmålet om skader forårsaket av confounding variabler. For eksempel, kan hypoksi bli feiltolket for skader forårsaket av bedøvelse som har global effekter på hjernen. Piglet benyttes med samme kirurgiske og anesthetic vilkår som brukes i human medisin slik gjengivelse av resultater.
Bruk av keramisk-basert MEA teknologi eliminerer flere ulemper med moderne teknikk for microdialysis. Microdialysis har begrenset timelige og romlig oppløsning i forhold til amperometric metoder som MEA, som kan registrere kontinuerlig glutamat arrangementer i flere, mikroskopiske regioner opptil 10 Hz23. Denne rask samplingsfrekvens eliminerer forvirrende faktor på lokaliserte nevrotransmitter diffusjon som er iboende til langsom Prøvetaking metoder som microdialysis24. Dessuten er MEA en mindre invasiv metode enn en microdialysis sonde, som kan forårsake betydelig gliosis under innsetting og kan endre nevrotransmitter aktivitet på innsetting området22.
Tidligere studier utnytte en rekke pattedyr modeller, måling teknikker og områder av hjernen, har vist basale glutamat nivåer sammenlignes med de funnet ved hjelp av denne teknikken. Dette tyder på at MEA teknologi, når tilpasset piglet modellen, gir gyldig opptak i vivo glutamat konsentrasjon (tabell 2).
| Forfatter (år) | Opptak teknikk | Dyremodell | Alder | Hjernen områdene | Mener basale glutamat konsentrasjon (µM) |
| Hascup et al. (2008)23 | MEA (enzym-basert) | Gnagere | 20 - 24 uker | Prefrontal Cortex, Striatum | 3.3 ± 1.0; 5.0 ± 1.2 |
| Hascup et al. (2010)25 | MEA (enzym-basert) | Gnagere | 3 - 6 måneder | Hippocampus | 4.7-10.4 |
| Rutherford et al. (2007)9 | MEA (enzym-basert) | Gnagere | 3 - 6 måneder | Prefrontal Cortex, Striatum | 44,9 ± 4.7; 7.3 ± 0,9 |
| Miele et al. (1996)26 | Microdialysis (enzym-basert) | Gnagere | - | Striatum | 3.6 ± 0,5 |
| Dag et al. (2006)27 | MEA (enzym-basert) | Gnagere | 3 - 6 måneder | Frontal Cortex, Striatum | 1.6 ± 0,3; 1,4 ± 0,2 |
| O Quinteiro et al. (2007)28 | MEA (enzym-basert) | Ikke - menneskelige primas | 5.3-5.5 år | Premotor Cortex, motorisk Cortex | 3.8 ± 1.7; 3.7 ± 0,9 |
| Stephens et al. (2010) 29 | MEA [Spencer-Gerhardt-2 (SG-2)] | Ikke - menneskelige primas | 11 - 21 år | Putamen | 8,53 |
| Kodama et al. (2002)30 | Microdialysis (enzym-basert) | Ikke - menneskelige primas | - | Prefrontal Cortex | 1,29-2.21 |
| Galvan et al. (2003)31 | Microdialysis (enzym-basert) | Ikke - menneskelige primas | Juvenile | Striatum | 28.74 ± 2,73 |
| Under og Spencer (1993)32 | Microdialysis (enzym-basert) | Menneskelige | 18 - 35 år | Hippocampus | 20,3 ± 6.6 |
| Reinstrup et al. (2000)33 | Microdialysis (enzym-basert) | Menneskelige | - | Frontal Cortex | 16 ± 16 |
| Cavus et al. (2005)34 | Microdialysis (enzym-basert) | Menneskelige | 15 - 52 år | Neocortex | 2.6 ± 0,3 |
Tabell 2. Sammenligning av basale ekstracellulære glutamat levelsacross ulike dyr modeller. En valgte gjennomgang av studier å etablere normale ekstracellulære glutamat nivåer i friske våken og bedøvet dyr med microdialysis eller microelectrodes.
Bruk av MEA teknologi for å overvåke i vivo glutamat konsentrasjoner i piglet modellen kan tillate fremtidige evalueringen av piglet nevrologiske resultater etter anestesi. Overlevelse eksperimenter er planlagt, som vil ytterligere en forståelse av den langsiktige virkningen av bedøvelsen på nevrokognitive velvære menneskelige nyfødte. Overlevelse eksperimenter vil tillate atferdsmessige testing og overvåking av glutamat endrer lenge etter anestesi eksponering. Det er også vanlig for barn å gjennomgå anestesi i forhold der de kan oppleve fysiologiske stress i form av kirurgiske inngrep. Fremtidige studier påvirkning av kirurgi nevrologiske skader og økning i nevrotoksisitet ville tillate for mer nøyaktig modellering av en vanlig klinisk setting for barn. Bruk av alternative dyr modeller er også mulig, som er studiet av disse ulike modeller gjennom kronisk implantasjon, slik at vi kan spore opptreden endre forbundet med nevrotoksisitet. MEA teknologien i seg selv er allsidig, slik at fremtidige studie ikke trenger være begrenset til analyse av glutamat nivåer (f.eksGABA, kolin lysin, osv. kunne analyseres).
Disclosures
Greg Gerhardt er hovedeier av Quanteon LLC. Jorge Quintero og Jason Burmeister har fungert som konsulenter til Quanteon LLC.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne bidrag av University of Kentucky senter for Microelectrode teknologi (CenMeT) og Ohio State University laboratorium dyr Resource Center (Sirkelformet).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advance Liqui-Wean Pig Milk Replacer | PBS Animal Health | 292-13 | |
| Piglet Anesthesia Face-Cone Mask | VetEquip | 921428 | |
| Integra SL Anesthesia Workstation | DRE Veterinary | 2350 | This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention. |
| Sevoflurane | Ultane | 0074-4456-04 | |
| Rocuronium Bromide Injection | Hospira | 0409-9558-05 | |
| Medfusion 4000 IV Infusion | Smiths Medical | ||
| Model 1530 Heavy-Duty Research Model Stereotax | Kopf | custom made | |
| Model 1541 Piglet Adaptor | Kopf | custom made | |
| Infrared Spot Lamp | Amazon | B000HHQ94C | |
| Bair Hugger Torso Blanket | 3M | 540 | |
| Bair Hugger | 3M | 750 | |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Fisherbrand | 22-363-750 | |
| Carbon Steel Rib-Back Surgical Blade | Bard-Parker | #10 | |
| Scalpel Handel | Havel's | HAN-G4 | |
| Surgical Scissors | World Precision Instruments | 504615 | |
| Mosquito Forceps | Sklar Surgical Instruments | 17-1225 | |
| Gauze Pads | Fisherbrand | 22-246-069 | |
| Adson Tissue Forceps | Teleflex | 181223 | |
| Dremel 111 Engraving Cutter | Amazon | Dremel 111 | |
| Microelectrode Array | Center for Microelectrdoe Technology, University of Kentucky | S2 4Ch MEA; custom made | |
| Headstage | Quanteon | 2pA/mV | |
| Wire, silver, PFA, .008" Bare, .0110" coated | A-M Systems | 786500 | |
| Fine Micromanipulator | Narishige Scientific Instrument Lab | MO-8 |
References
- Hall, M. J., DeFrances, C. J., Williams, S. N., Golosinskiy, A., Schwartzman, A. National hospital discharge Survey: 2007 summary. Natl Health Stat Report. (29), 1-24 (2010).
- Ikonomidou, C., et al. Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science. 283 (5398), 70-74 (1999).
- Mattson, M. P. Glutamate and neurotrophic factors in neuronal plasticity and disease. Ann N Y Acad Sci. 1144 (1), 97-112 (2008).
- Atlante, A., et al. Glutamate neurotoxicity, oxidative stress and mitochondria. FEBS Lett. 497 (1), 1-5 (2001).
- Kavitha, J., Durga, P., Ramachandran, G. Inhalational agents in anesthesia induced developmental neurotoxicity - Recent advances. Trends in Anaesthesia and Critical Care. 11 (1), 14-18 (2016).
- Zanghi, C. N., Jevtovic-Todorovic, V. A holistic approach to anesthesia-induced neurotoxicity and its implications for future mechanistic studies. Neurotoxicol Teratol. 60 (2), 24-32 (2017).
- Fan, X., et al. In situ real-time monitoring of glutamate and electrophysiology from cortex to hippocampus in mice based on a microelectrode array. Sensors (Basel). 17 (1), 1-8 (2016).
- Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
- Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Strömberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
- Benveniste, H.
- Kohno, T., et al. An improved method for the detection of changes in brain extracellular glutamate levels. J Neurosci Methods. 81 (1-2), 199-205 (1998).
- Hascup, K. N., Hascup, E. R. Electrochemical techniques for subsecond neurotransmitter detection in live rodents. Comp Med. 64 (4), 249-255 (2014).
- Rooij, N. F., Koudelka-Hep, M., Frey, O. Biosensor microprobe array for in vivo monitoring of neurotransmitters. EPFL. , Lausanne. (2010).
- Fan, X. T., et al. Cortical glutamate levels decrease in a non-human primate model of dopamine deficiency. Brain Res. 1552, 34-40 (2014).
- Hunsberger, H. C., et al. Using enzyme-based biosensors to measure tonic and phasic glutamate in Alzheimer's mouse models. J Vis Exp. (123), (2017).
- Hill, A. J., Jones, N. A., Williams, C. M., Stephens, G. J., Whalley, B. J. Development of multi-electrode array screening for anticonvulsants in acute rat brain slices. J Neurosci Methods. 185 (2), 246-256 (2010).
- Defranchi, E., et al. Feasibility assessment of micro-electrode chip assay as a method of detecting neurotoxicity in vitro. Front Neuroeng. 4 (6), (2011).
- Whitaker, E. E., et al. Use of a piglet model for the study of anesthetic-induced developmental neurotoxicity (AIDN): A translational neuroscience approach. J Vis Exp. (124), (2017).
- Kilkenny, C., et al. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Salinas-Zeballos, M., Ceballos, G., Gootman, P. A stereotaxic atlas of the developing swine (Sus scrofa) forebrain. , 887-906 (1986).
- Whitaker, E. E., et al. A novel, clinically relevant use of a piglet model to study the effects of anesthetics on the developing brain. Clin Transl Med. 5 (1), (2016).
- Hascup, E. R., et al. Histological studies of the effects of chronic implantation of ceramic-based microelectrode arrays and microdialysis probes in rat prefrontal cortex. Brain Res. , 12-20 (2009).
- Hascup, K. N., Hascup, E. R., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Second-by-second measures of L-Glutamate and other neurotransmitters using enzyme-based microelectrode arrays. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 324 (2), 725-731 (2008).
- Rice, M. E., Cragg, S. J. Dopamine spillover after quantal release: rethinking dopamine transmission in the nigrostriatal pathway. Brain Res Rev. 58 (2), 303-313 (2008).
- Hascup, E. R., et al. Rapid microelectrode measurements and the origin and regulation of extracellular glutamate in rat prefrontal cortex. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1608-1620 (2010).
- Miele, M., Boutelle, M. G., Fillenz, M. The source of physiologically stimulated glutamate efflux from the striatum of conscious rats. J Physiol. 497 (Pt 3), 745-751 (1996).
- Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), 1626-1635 (2006).
- Quintero, J. E., et al. Amperometric measures of age-related changes in glutamate regulation in the cortex of rhesus monkeys. Exp Neurol. 208 (2), 238-246 (2007).
- Stephens, M. L., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A., Zhang, Z. Real-time glutamate measurements in the putamen of awake rhesus monkeys using an enzyme-based human microelectrode array prototype. J Neurosci Methods. 185 (2), 264-272 (2010).
- Kodama, T., Hikosaka, K., Watanabe, M. Differential changes in glutamate concentration in the primate prefrontal cortex during spatial delayed alternation and sensory-guided tasks. Exp Brain Res. 145 (2), 133-141 (2002).
- Galvan, A., Smith, Y., Wichmann, T. Continuous monitoring of intracerebral glutamate levels in awake monkeys using microdialysis and enzyme fluorometric detection. J Neurosci Methods. 126 (2), 175-185 (2003).
- During, M. J., Spencer, D. D. Extracellular hippocampal glutamate and spontaneous seizure in the conscious human brain. Lancet. 341 (8861), 1607-1610 (1993).
- Reinstrup, P., et al. Intracerebral microdialysis in clinical practice: baseline values for chemical markers during wakefulness, anesthesia, and neurosurgery. Neurosurgery. 47 (3), 701-710 (2000).
- Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
