Summary
Este estudo explora o uso inovador da tecnologia de matriz (MEA) enzimáticos microeletrodos para monitorar a atividade em vivo do neurotransmissor em leitões. A hipótese foi que essa desregulação glutamato contribui para o mecanismo de neurotoxicidade anestésica. Aqui, apresentamos um protocolo para adaptar a tecnologia MEA para estudar o mecanismo de neurotoxicidade induzida por anestesia.
Abstract
Todos os anos, milhões de crianças são submetidos a anestesia para uma infinidade de procedimentos. No entanto, estudos em animais e seres humanos têm posto em causa a segurança da anestesia em crianças, implicando anestésicos como potencialmente tóxicas para o cérebro em desenvolvimento. Até à data, nenhum estudo com sucesso ter elucidado o mecanismo (s) pelo qual anestesia pode ser neurotóxico. Estudos em animais permitem a investigação de tais mecanismos, e Neonatais leitões representam um excelente modelo para estudar estes efeitos devido a suas similaridades marcantes no desenvolvimento do cérebro humano.
Este protocolo adapta-se a utilização de tecnologia de microeletrodos enzimáticos matriz (MEA) como uma nova maneira de estudar o mecanismo (s) de neurotoxicidade induzida por anestesia (AIN). MEAs permitem monitoramento em tempo real da atividade de neurotransmissor na vivo e oferecem excepcional resolução temporal e espacial. Supor que a neurotoxicidade anestésica é causada em parte pela desregulação de glutamato e MEAs oferecem um método para medir o glutamato. A romance implementação da tecnologia MEA em um modelo de Leitão apresenta uma oportunidade única para o estudo de AIN.
Introduction
Todos os anos, milhões de crianças são submetidos a anestesia para procedimentos invasivos e não-invasiva no Estados Unidos1. Durante anos, provedores de anestesia tem tranquilizado os pais da segurança dos anestésicos, mesmo em crianças pequenas e neonatos. No entanto, em 1999 foi encontrado naquela transitório bloqueio do subtipo de receptores de glutamato durante o início da vida de N-metil-D-aspartato (NMDA) poderia causar apoptose neuronal generalizado em ratos2. Recentemente, a FDA lançou uma comunicação de segurança de drogas que exigirão os rótulos de drogas anestésicas para incluir um aviso sobre anestésicos gerais e seu potencial efeito negativo sobre o cérebro em desenvolvimento de crianças menores de 3 anos de idade (alimento de Estados Unidos e Drug Administration, 2017). No entanto, ainda há uma necessidade de elucidar possíveis mecanismos e medidas de potencial neuroprotetor.
Atividade normal de neurotransmissores como o glutamato e ácido gama-amino butírico (GABA) são críticos para o neurodesenvolvimento normal ocorra. Embora a maioria das vias envolvidas em AIN são ainda elusiva, sistemas neurotransmissor são muito susceptíveis de estar envolvido desde anestésicos são conhecidos de modular estas vias para produzir inconsciência. Em particular, o neurotransmissor excitatório glutamato causa excitotoxicidade quando sua atividade é prejudicado. Este neurotransmissor é geralmente envolvido na neurogênese, plasticidade neural, crescimento sináptico e neural e um número de outras funções cerebrais criticamente importante. No entanto, prolongada ativação dos receptores de glutamato pode causar excitotoxicidade e apoptose neuronal, particularmente sob condições de estresse, tais como cirurgia, privação de oxigênio e energia reduzida disponibilidade3. Ligação do glutamato ao NMDA receptor foi mostrado para causar at+ e o influxo de Cl− . A subsequente despolarização é pensada para originar Ca2 + canal abertura e liberação de Ca intracelular2 + armazena4. Esta disfunção provavelmente leva a uma cascata de transtornos metabólicos que eventualmente diminuir a proliferação neuronal, aumentar a inflamação e levar à morte neuronal. Apesar dessas hipóteses, o verdadeiro mecanismo (s) de AIN permanecem pouco claras5. Devido ao seu papel na apoptose, desregulação de glutamato representa um caminho de romance que pode contribuir para o mecanismo da apoptose neuronal anteriormente documentados, uma característica de AIN.
Dentre os obstáculos no estudo dos processos neuronais é sua alta complexidade, especialmente no cenário do desenvolvimento neuronal. Os primeiros meses de vida são o período de vulnerabilidade máxima à lesão, durante o qual a maioria das etapas importantes do desenvolvimento neuronal como apoptose fisiológica (poda neuronal), gliogenesis, sinaptogênese e mielinização tomam lugar6 . Dada a natureza complexa de comunicação neuronal e a dificuldade de estudar estes processos sem interromper a função normal do CNS, novas tecnologias foram desenvolvidas que visam na vivo de detecção e quantificação de elementos importantes de comunicação neuronal.
Enzima-lig MEA tecnologia foi utilizada neste estudo como uma forma nova para estudar os mecanismos de AIN em um modelo de Leitão clinicamente relevante. Esta tecnologia pode ser usada para estudar complexo na vivo processos de eletroquímica do cérebro, incluindo o glutamato hipotalâmica. Os sites incorporado 4 canais de gravação de platina da MEAs (2 sites sensíveis ao glutamato e sentinela 2 sites) permitem a auto-referência, que contribui para a precisão da deteção. Além disso, é aplicada uma camada de exclusão para cada eletrodo, confere seletividade, impedindo que outras moléculas interferentes sendo detectado7. Além disso, o design de baixo perfil do MEA permite trauma mínima dos tecidos, em comparação com tecnologias anteriores. Esta mesma característica confere para mim, como uma maior resolução espacial, que facilita o estudo de regiões microscópicas no cérebro. Por exemplo, discretas regiões do hipocampo (giro denteado, CA1, CA2) podem ser especificamente estudadas8. Detalhes específicos sobre a funcionalidade de MEAs foram descritas anteriormente9.
Em comparação com a eletroquímica MEA, microdialysis incorpora uma membrana colocada entre a solução de interesse e uma solução de composição semelhante, permitindo a deteção de fluido extracelular altera10. Embora microdialysis é dos pilares da neuroquímica e tem sido muito utilizado para a detecção de neurotransmissores, tem a desvantagem de tempo de baixa resolução, retardada deteção da mudança de glutamato e tecido significante trauma11.
MEAs indiretamente podem detectar os neurotransmissores como glutamato, acetilcolina e colina, usando enzimas oxidase apropriado que produzem moléculas de repórter eletroativos tais como H2O2 ou O212,13 .
Tecnologia MEA tem sido amplamente utilizada em ratos e primatas não humanos para o estudo de neurotoxicidade no contexto dos processos fisiopatológicos diferentes AIN7,14. Entre alguns desses processos fisiopatológicos, MEA tecnologia tem sido utilizada para o estudo da doença de Alzheimer, epilepsia, traumatismo cranioencefálico e o efeito de compostos farmacológicos na comunicação sináptica8,15 , 16 , 17. embora MEAs foram usados para estudar estas patologias em ratos e primatas não-humanos, a alta similaridade no desenvolvimento entre os humanos e os miolos Leitão faz a adaptação da tecnologia MEA em leitões uma técnica altamente adequada para o estudo de AIN mecanismo (s)18.
Protocol
Leitões (Sus scrofa) são recebidos através de uma fazenda local pre-aprovada pelo cuidado de Animal institucional a Universidade de estado de Ohio (OSU) e Comissão de utilização (IACUC). Após a aprovação do protocolo, experimentações animais são feitas em conformidade com a política IACUC.
1. leitões e manipulação de Leitão
- Utilize os leitões machos e fêmeas de forma sistemática e randomizada para eliminar quaisquer potenciais confundidores baseada em sexo em conformidade com diretrizes de chegada19.
Nota: Uma vez que o período de crescimento máximo do cérebro é dentro de 3-5 dias após o nascimento de leitões, experimentação é feita exclusivamente com leitões 3-5 dias de idade. - Certifique-se de leitões chegam em viveiro de pelo menos 24 h antes da experimentação para permitir que a aclimatação ao ambiente.
Nota: O pessoal veterinário treinado fornece rotineiro cuidados com animais. Os leitões são mantidos em gaiolas individualmente temperatura mantida, continuamente monitoradas e recebem um sucedâneo de leite nutricionalmente completa ad libitum para prevenir hipoglicemia. Os leitões são também mantidos sem substituição de leite (a zero por sistema operacional), pelo menos 3h antes da anestesia e são fornecidos com cobertores e brinquedos para garantir níveis normais de estimulação. Se possível, manter leitão múltiplas na mesma gaiola para permitir que a socialização.
2. desenvolvimento e customização de MEAs para estudos AIN em um modelo de Leitão
Nota: Esta tecnologia usa MEAs enzimáticos que são pré-revestidas com enzima e galvanizadas com dicloridrato de m-Fenilenodiamina (mPD). Os eletrodos foram personalizados projetado com um eixo rígido-40mm e fabricado para uso em leitões (Figura 1).
- Para evitar redundância, consulte que a descrição detalhada de MEA preparação e calibração conforme descrito anteriormente15 (Figura 2).
3. anestesia e uso de aparelhos estereotáxicos personalizados para o leitão
- Anestesiar animais usando uma estação de trabalho de anestesia com um ventilador apropriado e dispositivos de monitorização e monitorar os parâmetros fisiológicos, tais como a oximetria de pulso, pressão arterial não-invasiva, eletrocardiografia e temperatura durante todo o totalidade do experimento conforme descrito anteriormente19. Intubar e ventilar os leitões e administrar anestesia de sevoflurano em 1 concentração alveolar mínima (MAC) (cerca de 2,5-3%) para 3,5 h. Assegure-se que o pessoal de laboratório treinados são membros apresenta para essas experiências. Pele sobrejacente a área cirúrgica é removido usando tosquiadeiras elétricas antes da preparação da pele.
Nota: A concentração e a duração do anestésico usado permite que o experimento simular o comprimento de tempo de exposição real anestesia durante um procedimento cirúrgico. Além disso, o sevoflurano é mais comumente utilizaram anestesia geral na população pediátrica, tornando a investigação em torno de sua segurança de suma importância. - Antes da colocação no armação estereotáxica, começar um rocurônio carregando dose de 2,5 mg/kg e uma infusão de 1,5 mg/kg/h para evitar a circulação de animais enquanto segura no quadro.
- Coloque o leitão na armação estereotáxica Leitão-específicos depois de uma adequada profundidade da anestesia é confirmada pelo dedo do pé-pitada.
- Fornece o preenchimento adequado dentro do quadro estereotáxica, colocando o leitão sobre uma almofada de aquecimento de ar forçado com enchimento adicional (por exemplo, posicionador fluidizado) para evitar úlceras de pressão.
- Coloque os dentes da mandíbula superior sobre o dente da barra (Figura 3).
Nota: A barra de dente deve ser em um nível suficiente para segurar o crânio muito firmemente no lugar. - Fixe e aperte as barras de orelha penetrante dentro das orelhas, tendo o cuidado de garantir que o leitão está em posição mediana. Posição as pontas pontiagudas da lateral ocupa dentro do canal auditivo e insira a orelha bares firme o suficiente para ouvir o som "pop" associado com a penetração da membrana timpânica. Unir as barras de orelha no crânio firmemente e inserir a profundidade igual de cada lado para evitar movimento do crânio durante o experimento (Figura 4painel A).
Nota: É extremamente importante manter o leitão quente (~ 37,8-38,6 ° C) e monitorar continuamente a temperatura durante todo o procedimento para a manutenção de normotermia. Isto pode ser realizado através de um cobertor e/ou uma lâmpada de calor. Não se esqueça de colocar a lâmpada de calor a uma distância adequada para evitar a queima da pele do animal.
- Crie uma incisão de 4-6 cm ao longo do crânio com cautela para evitar marcar o crânio com o bisturi. Uma vez que a incisão é feita, usar retração suave e dissecção romba, para elevar o couro cabeludo do crânio. Esfregue suavemente o crânio com uma gaze para remover todo o tecido conjuntivo e expor as linhas de sutura (Figura 4painel B).
Nota: Não é necessário manter a esterilidade durante experimentos não-sobrevivência. No entanto, a esterilidade deve ser mantida durante as experiências de sobrevivência. - Refletir mais o couro cabeludo, se necessário, para expor a área de interesse e determinar a localização pretendida para a craniotomia (Figura 5painel A). Use uma broca cirúrgica para criar uma janela de craniotomia de aproximadamente 0,25 cm2 (pode ser maior ou menor, dependendo das metas experimentais) sobrejacente a estrutura de interesse, com cuidado para não machucar a dura-máter ou o cérebro subjacente (Figura 5 , Painel B). Use uma tesoura cirúrgica fina para excisar a dura-máter sobrejacente o tecido cerebral (Figura 5Painel C).
- Posicione o eletrodo mais verticalmente possível sobre o bregma fixando o braço metálico do headstage para o micromanipulador de stereotax o leitão. Baixe o eletrodo o máximo possível sem tocar a superfície do crânio. Grave as coordenadas do bregma (Figura 6painel A).
- Determinar o ântero-posterior e medial-lateral coordenadas, bem como a profundidade da estrutura de interesse, como eles se relacionam com o bregma. Determine as coordenadas estereotáxicos usando uma espécie e idade apropriada estereotáxica atlas. Nesse caso, use um atlas estereotáxica desenvolvido especificamente para leitões20.
- Reposicione o eletrodo para que ele tenha uma localidade ântero-posterior e medial-lateral apropriada, garantindo que o microeléctrodo e os aparelhos são perpendiculares à superfície. Coloque o eléctrodo de referência pseudo sob o couro cabeludo, garantindo o contato com o animal (Figura 6painel B).
- Lenta e suavemente, abaixe o eletrodo para a profundidade apropriada para o cérebro usando o braço estereotáxica. Para o final 2 mm, use um microdrive hidráulico para mais rígido o eletrodo para a localização exata (Figura 6Painel C).
Nota: A posição do eletrodo deve overlie janela craniotomia. A profundidade do eletrodo pode variar dependendo da estrutura do cérebro de interesse. Não é necessário fechar a incisão após a conclusão da coleta de dados em experimentos não-sobrevivência.
4. medição de glutamato extracelular sob anestesia sevoflurano
- Certifique-se que o leitão está sob monitorização fisiológica contínua em toda a totalidade deste procedimento. Leitões são anestesiados inhalationally (através do cone de rosto) em preparação para o procedimento.
- Após o implante do MEA, espere 30 min para permitir que o eletrodo alcançar a linha de base para assegurar que medição correta será obtida para 3h (Figura 7).
- bupivacaína 0,25% (1 mL/kg) é administrada por via subcutânea no local da cirurgia para tratamento da dor pós-operatória. Além disso, a buprenorfina liberação sustentada é dada por via subcutânea q72h conforme necessário.
5. perfusão e sacrifício
- Execute os procedimentos de coleta de tecido da perfusão e cérebro como descrito anteriormente,21. Para cirurgias não-sobrevivência, os animais são sacrificados imediatamente após a experimentação enquanto estava sob anestesia geral.
- Leve brutos secções transversais do cérebro Leitão fixo e usar microscopia de luz para visualizar a faixa do eletrodo como descrito anteriormente22 para permitir a verificação da colocação de MEA, garantindo uma colocação adequada na área de interesse.
Representative Results
Este estudo de prova de conceito com enzima cerâmica MEA tecnologia baseada em um modelo de Leitão pode fornecer uma visão excepcional para a dinâmica de glutamato subjacente AIN. Este estudo ainda demonstra que tecnologia MEA enzimáticos pode ser adaptada com sucesso no modelo de Leitão para medir mudanças fisiológicas e associada a anestesia na atividade neurotransmissor com alta sensibilidade e alta espacial e temporal resolução. Homeostase fisiológica foi mantida ao longo de nossas experiências usando métodos clinicamente relevantes e padrões, e o leitão não exibiu sinais de perturbações fisiológicas.
Os dados obtidos indicam a capacidade de MEAs para medições de neurotransmissor em estruturas cerebrais corticais e sub cortical de resolver precisamente e espacialmente. O uso de um aparelho estereotáxica permite identificação clara de uma estrutura de superfície de referência (bregma) a fim de localizar consistentemente a região de interesse, independentemente das diferenças individuais no tamanho de Leitão e anatomia. Visualização clara das suturas facilita colocação regional consistente do MEA com precisão em escala micrométrica (Figura 4). Obtenção de acesso à superfície cortical do cérebro é minimamente traumática com sangramento negligenciável, garantindo que qualquer dinâmica de glutamato na vivo não é devido a não-intencional insulto sistêmico ou local (Figura 5). O MEA personalizado, rígida é então alinhada perpendicularmente ao plano frontal do leitão (Figura 6). Falha para alinhar corretamente o MEA antes da inserção pode impedir a gravação espacial exata da região alvo, especialmente para as regiões subcorticais.
Em tempo real na vivo glutamato medidas foram feitas no hipocampo dos leitões velhos, 3-4 dias (n = 4) sob anestesia de sevoflurano 2,5-3% (aproximadamente 1 MAC). Amperometry medições foram gravadas em 4 Hz e convertidas em concentração usando uma regressão linear, com base nos parâmetros de calibração (Figura 8painel A). Para cada ponto de tempo, os sinais dos dois sites sensíveis ao glutamato foram em média antes subtraindo-se o sinal de sentinela em média para produzir um sinal de glutamato corrigida. Estas medições contínuas foram suavizadas pela aplicação de uma média móvel para visualizar melhor a tendência global ao longo do tempo (Figura 8painel B). A concentração média de glutamato basal foi calculada para ser 4,61 ± 0,02 µM e manteve-se relativamente estável ao longo da exposição anestésica. Atividade transitória glutamatérgico foi identificada em um animal através da análise de picos no sinal que não foram correlacionados com o sinal de sentinela (R2 < 0.5) e ultrapassado uma relação sinal-ruído de 3 (Figura 9o painel A). Um total de 116 picos transientes foram detectados ao longo de um período de 3,5 h (Figura 10painel A). A amplitude dos picos transientes resultantes observou-se, geralmente, estar ao alcance 1 µM (Figura 10painel B). De forma a quantificar a duração de cada transeunte, obteve-se o tempo (t80) necessário para cada valor de pico máximo a decadência 80% (Figura 9painel B). O médio t80 de todos os transientes de glutamato durante o período de gravação de 3,5 h era 4.68 s ± 0,82 (Figura 10Painel C). Estes dados demonstram que é possível medir com precisão tanto atividade prolongada e transitória neurotransmissor em uma região subcortical do cérebro anestesiado leitão.
Figura 1: comparação Visual de SG-2 tipos de matriz de microeletrodos. SG-2 matrizes contêm dois locais sensíveis ao glutamato e dois locais sentinela diferenciação de glutamato (150 µm x 20 µm por site). (A) uma matriz de microeletrodos de eixo flexível é mostrado à esquerda. A matriz de microeletrodos rígida-eixo foi projetados para uso em leitões e autorizações de implantação mais profundo em animais de grandes porte. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: visão geral do processo de preparação e calibração de matriz de microeletrodos. A preparação total do MEA e calibração duram cerca de uma semana. A enzima de revestimento, camada de exclusão e calibração analitos são específicos para o neurotransmissor de interesse. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: colocação de Leitão no aparato estereotáxica. A boca do leitão é colocada na barra de boca diretamente posterior para os dentes caninos. As barras de orelha penetrante são inseridas os canais de orelha para prenda a extremidade posterior do crânio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: colocação de Leitão no aparato estereotáxica para craniotomia. (A) o leitão do cabeça está firmemente seguro dentro do quadro estereotáxica personalizado, garantindo o posicionamento consistente do MEA. Equidistante colocação de barras de orelha penetrante é visível. (B) incisão ântero-posterior ao longo do couro cabeludo. Pontuação do crânio foi evitada para visualizar as suturas coronais e sagitais e otimizar a visualização do bregma. Barra de escala é mostrada para indicar o tamanho relativo da incisão e a localização da janela de craniotomia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: craniotomia para acesso ao hipocampo. (A), o couro cabeludo também reflectida para expor a localização aproximada da inserção do MEA de acordo com coordenadas estereotáxicos. A área de um círculo é marcada (ponto preto) para orientar a craniotomia. (B) a janela de craniotomia (0,25 cm2) com crânio flap removida para expor a dura-máter subjacente. (C) as meninges cuidadosamente removido para expor superficial córtex cerebral sem trauma do tecido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: MEA posicionamento e inserção no hipocampo. (A) colocação de MEA no bregma para determinar uma localização estereotáxica relativo do hipocampo. (B) posicionamento estereotáxica da MEA na superfície do cérebro para determinar a profundidade de inserção do hipocampo. Eletrodo de referência pseudo prata firmemente colocado sob o couro cabeludo (indicado pela seta). (C) o MEA inserida na profundidade apropriada para obter em tempo real, na vivo glutamato extracelular medições no hipocampo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: comportamento MEA durante o período de linha de base 30-min. O rápido aumento inicial corresponde a descida do MEA no hipocampo usando o micromanipulador. O período de base começa uma vez que o MEA alcançou a profundidade apropriada (linha pontilhada). Medições de glutamato extracelular irão diminuir ao longo de um período de 30 min e não devem ser interpretadas como leituras fisiológicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: medições em tempo real de glutamato extracelular no hipocampo de um porco neonatal sob anestesia sevoflurano. (A) a movimentação média da concentração de glutamato no hipocampo de um porco neonatal sob anestesia sevoflurano (usando 10 pontos de dados). Medidas foram feitas em 4Hz para 3h após um período de linha de base breve 30 min. (B) suavização das medições de glutamato utilizando uma média móvel de 100 pontos cada 15 min para visualizar melhor a tendência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: identificação de glutamato transiente de atividade no hipocampo de um porco neonatal sob anestesia sevoflurano. Picos de glutamato transitória (A) (em vermelho) estão indicados sobre o rastreamento de glutamato em tempo real. Picos foram considerados significativos quando o sinal à relação de ruído excedeu 3 e seu sinal correlacionou-se não com o sinal de sentinela (R2 < 0.5). (B) um pico transitório representante identificado na Figura 9painel A. Linhas pontilhadas indicam a duração total necessária para o pico a decadência de 80%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: caracterização dos transientes de glutamato no hipocampo de um porco neonatal sob anestesia sevoflurano. (A), A número de picos de glutamato transiente em caixas de 15 min. Picos foram considerados significativos quando o sinal à relação de ruído excedeu 3 e seu sinal correlacionou-se não com o sinal de sentinela (R2 < 0.5). (B) a amplitude de transiente glutamato picos. Barras de erro indicam o erro padrão da média. (C) T dizer80 dos picos de glutamato transitória. Barras de erro indicam o erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Desde o início do experimento, homeostase fisiológica o leitão deve ser mantida, conforme descrito em publicação prévia21 deste laboratório. Monitorização mínima deve incluir a eletrocardiografia, oximetria de pulso, capnografia, pressão arterial não-invasiva e temperatura. Os investigadores treinados são necessários para que as perturbações fisiológicas (por exemplo, hipo/hipertermia, hipóxia, hipotensão, arritmia) podem ser corrigidas adequadamente.
Antes da indução, em vitro calibrações de MEA são realizadas para estabelecer a funcionalidade e a seletividade da MEA sob condições conhecidas. A calibração e chapeamento de MEAs é crítico para o uso efetivo da tecnologia. Existem muitas possíveis erros que podem surgir durante a calibração. Calibração pode identificar estas questões, bem como o chapeamento inadequado, que leva a resposta incorreta interferent. Um relato mais detalhado de tabular de erros que podem ocorrer em resposta MEA foi compilado, junto com notáveis causas e soluções sugeridas, que deveria provar um instrumento útil para solucionar problemas de probabilidade (tabela 1). É importante notar que antes tanto a calibração e o chapeamento, o eletrodo de referência de vidro deve ser verificado para a presença de bolhas de ar ou descoloração branca, como também afetará negativamente função MEA e precisão de gravação.
| Sintoma | Causa | Ação corretiva |
| Sem sinal | Eletrodo não conectado | Conecte corretamente eletrodo headstage e headstage ao sistema de amperometry rápido. |
| Não há energia para o sistema de amperometry rápido | Ligue o interruptor de alimentação na parte traseira do sistema rápido | |
| Sinal-ruído | Eletrodo contaminado por sangue | Irrigar continuamente a superfície do cérebro durante a inserção de eletrodo |
| Enxaguar o eletrodo imediatamente em dH2O | ||
| O revestimento da enzima é solto | Limpar e revestir novamente o eletrodo | |
| Eletrodo de referência não foi inserido ou revestido | E colocar o eletrodo de referência mais distante sob o couro cabeludo | |
| Eletrodo é detectar o movimento da superfície do cérebro | Geralmente ocorre em estruturas superficiais. Inserir o eletrodo mais profundo (1 mm de cada vez) se possível | |
| Circulação de animais | Animal é inadequadamente protegido | Mova o animal na direção posterior para melhor seguro earbars no crânio. Se necessário, eleve o tronco para permitir melhor alinhamento do corpo. |
| Animal é anestesiado inadequadamente | Verificar a integridade do equipamento anestésico. Titula-se o anestésico de uma dose efectiva e administrar uma dose intramuscular de rocurônio (5 mg/kg) | |
| Colocação do eletrodo impreciso | Eletrodo não está alinhado corretamente | Reajuste o eletrodo, mantendo a conexão apropriada para o headstage. |
| Estereotáxicos coordenadas são imprecisas | Certifique-se de que o atlas de Leitão sendo referenciado não usa outro ponto de referência ou plano de alinhamento. | |
| Tenha cuidado para não obscurecer as marcas de sutura marcando o crânio. |
Tabela 1: instruções para a solução de MEA usam em leitões. Possíveis causas e ações corretivas para ajudar com otimização e solução de problemas.
Um atlas estereotáxica para o leitão é usado para determinar as coordenadas estereotáxicos da área de interesse em relação a um ponto conhecido como bregma18. Barras de orelha devem ser devidamente protegidas para garantir que o crânio está totalmente imobilizado e nível. Deve ter cuidado durante a incisão mediana do couro cabeludo para evitar marcar o crânio como isso pode afetar a visualização das linhas de sutura. A janela de craniotomia deve ser suficientemente grande para acomodar o MEA.
Este protocolo apresenta um número de desafios técnicos que necessitam de uma sala de operações bem abastecida e uma investigador/equipe qualificada nos aspectos do protocolo cirúrgicos e anestésicos. O modelo além disso apresenta limitações financeiras em que o modelo de Leitão é mais caro que o modelo de roedor; no entanto, é significativamente menos dispendiosa do que a utilização de primatas não-humanos, que pode custar milhares de dólares. O uso da tecnologia MEA apresenta seus próprios desafios, como o procedimento de revestimento e chapeamento os eléctrodos manualmente requerem um investigador hábil ou Assistente para assegurar a seletividade suficiente e função de confiança. Os próprios microeletrodos são frágeis, como eles são feitos de cerâmica e assim facilmente danificados se cuidado apropriado não for observado. Microeletrodos estão sujeitas à interferência de outros dispositivos elétricos, que podem criar ruído nas gravações e de sangue no local da operação, que pode obstruir os locais de gravação. A necessidade de equipamento especializado apresenta um encargo adicional como uma armação estereotáxica cirúrgica deve ser personalizada construído para imobilizar o crânio Leitão durante a implantação. A armação estereotáxica, oxidase glutamato e os eletrodos se são muito caros. Além disso, a falta de um atlas de Leitão estereotáxica de dentro da última década coloca limitações técnicas que exigem perícia particular para determinar a localização específica das estruturas profundas do cérebro de Leitão. Desenvolvimento de um novo atlas estereotáxica, talvez usando ressonância magnética, poderia aumentar consideravelmente a capacidade de usar esta tecnologia em leitões.
O leitão é um modelo clinicamente relevante para o estudo de AIN, em grande parte devido as semelhanças existentes entre esta espécie e o neonato humano, como ambos possuem desenvolvimento e estrutura cerebral similar. Ao contrário dos modelos mais comumente usados como ratos ou ratos, o leitão tem uma maior similaridade de CNS para os seres humanos, que empresta a Traduzibilidade os próprios dos resultados do modelo. O modelo de Leitão é adicionalmente mais barato e envolve manipulação menos complicada do que um modelo de primatas não humanos. O modelo de Leitão destina-se a examinar o processo pelo qual anestesia pode induzir neurotoxicidade do desenvolvimento, medir sua contribuição para danos neurológicos e combater a questão dos danos causados por variáveis de confusão. Por exemplo, a hipóxia pode ser mal interpretada pelos danos causados pelos anestésicos como tem efeitos globais sobre o cérebro. O leitão é utilizado com as mesmas condições cirúrgicas e anestésicas, como aqueles usados em medicina humana para garantir a fidelidade dos resultados.
O uso de tecnologia baseada em cerâmica MEA elimina várias das desvantagens associadas com a técnica contemporânea do microdialysis. Microdialysis limitou a resolução temporal e espacial, em comparação com amperométrico métodos tais como o MEA, que pode continuamente gravar eventos de glutamato em múltiplas, regiões microscópicas em até 10 Hz23. Esta taxa de amostragem rápida elimina o fator de confundimento de difusão localizadas neurotransmissor que é inerente aos métodos de amostragem lento como microdialysis24. Além disso, o MEA é um método menos invasivo do que uma sonda de microdialysis, que pode causar gliosis significativo durante a inserção e pode alterar a atividade do neurotransmissor para o local de inserção22.
Estudos anteriores, utilizando uma variedade de modelos de mamíferos, técnicas de medição e regiões do cérebro, demonstraram níveis basais de glutamato comparáveis àquelas encontradas usando esta técnica. Isto sugere que tecnologia MEA, quando adaptado ao modelo Leitão, fornece válidas gravações de concentração na vivo glutamato (tabela 2).
| Autor (ano) | Técnica de gravação | Modelo animal | Idade | Ou regiões do cérebro | Significa concentração Basal de glutamato (µM) |
| Hascup et al (2008)23 | MEA (enzimáticos) | Roedor | 20 - 24 semanas | Córtex pré-frontal, Striatum | 3.3 ± 1,0; 5.0 ± 1,2 |
| Hascup et al (2010)25 | MEA (enzimáticos) | Roedor | 3 - 6 meses | Hipocampo | 4.7-10.4 |
| Rutherford et al (2007)9 | MEA (enzimáticos) | Roedor | 3 - 6 meses | Córtex pré-frontal, Striatum | 44,9 ± 4,7; 7,3 ± 0,9 |
| Miele et al (1996)26 | Microdialysis (enzimáticos) | Roedor | - | Corpo estriado | 3,6 ± 0,5 |
| Dia et al (2006)27 | MEA (enzimáticos) | Roedor | 3 - 6 meses | Córtex frontal, corpo estriado | 1.6 ± 0,3; 1,4 ± 0.2 |
| Quintero et al (2007)28 | MEA (enzimáticos) | Primatas não - humanos | 5.3-5,5 anos | Cortéx pré-motor, córtex Motor | 3.8 ± 1,7; 3,7 ± 0,9 |
| Stephens et al. (2010) 29 | MEA [Spencer-Gerhardt-2 (SG-2)] | Primatas não - humanos | 11 - 21 anos | Putâmen | 8,53 |
| Kodama et al (2002)30 | Microdialysis (enzimáticos) | Primatas não - humanos | - | Córtex pré-frontal | 1.29-2.21 |
| Galvan et al (2003)31 | Microdialysis (enzimáticos) | Primatas não - humanos | Juvenil | Corpo estriado | 28.74 ± 2,73 |
| Durante o e Spencer (1993)32 | Microdialysis (enzimáticos) | Humana | 18 - 35 anos | Hipocampo | 20,3 ± 6.6 |
| Reinstrup et al (2000)33 | Microdialysis (enzimáticos) | Humana | - | Córtex frontal | 16 ± 16 |
| Cavus et al (2005)34 | Microdialysis (enzimáticos) | Humana | 15 - 52 anos | Neocórtex | 2.6 ± 0,3 |
Tabela 2. Comparação dos níveis basais de glutamato extracelular vários modelos animais. Uma revisão selecionada de estudos que estabelece níveis de glutamato extracelular normal em animais anestesiados e acordados saudáveis usando microdialysis ou microeletrodos.
O uso da tecnologia MEA para monitorar na vivo concentrações de glutamato no modelo Leitão pode permitir a avaliação futura da anestesia pós de Leitão resultados neurológicos. Experiências de sobrevivência foram planejadas, que irá promover uma compreensão do impacto a longo prazo da anestesia no neurocognitivos bem-estar dos neonatos humanos. Experiências de sobrevivência permitirá testes comportamentais e monitoramento de glutamato muda muito tempo após a exposição de anestesia. Também é comum que as crianças se submeter a anestesia em condições onde eles podem experimentar estresse fisiológico sob a forma de intervenção cirúrgica. Futuros estudos abordando a influência da cirurgia em termos de lesão neurológica e aumento em neurotoxicidade permitiria mais precisos de modelagem de um ambiente clínico comum para crianças. O uso de modelos animais alternativos também é viável, como é o estudo desses vários modelos através da implantação de crônica, permitindo-nos controlar as alterações comportamentais associadas com a neurotoxicidade. Tecnologia MEA em si é versátil, para estudos futuros não precisam ser limitado a análise dos níveis de glutamato (por exemplo, GABA, colina, lisina, etc. poderia ser analisado).
Disclosures
Greg Gerhardt é o principal proprietário da Quanteon LLC. Jorge Quintero e Jason Burmeister serviram como consultores para Quanteon LLC.
Acknowledgments
Os autores gostaria de reconhecer as contribuições da Universidade de Kentucky centro de microeletrodos tecnologia (CenMeT) e o Ohio estado Universidade laboratório Animal Resource Center (ULAR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advance Liqui-Wean Pig Milk Replacer | PBS Animal Health | 292-13 | |
| Piglet Anesthesia Face-Cone Mask | VetEquip | 921428 | |
| Integra SL Anesthesia Workstation | DRE Veterinary | 2350 | This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention. |
| Sevoflurane | Ultane | 0074-4456-04 | |
| Rocuronium Bromide Injection | Hospira | 0409-9558-05 | |
| Medfusion 4000 IV Infusion | Smiths Medical | ||
| Model 1530 Heavy-Duty Research Model Stereotax | Kopf | custom made | |
| Model 1541 Piglet Adaptor | Kopf | custom made | |
| Infrared Spot Lamp | Amazon | B000HHQ94C | |
| Bair Hugger Torso Blanket | 3M | 540 | |
| Bair Hugger | 3M | 750 | |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Fisherbrand | 22-363-750 | |
| Carbon Steel Rib-Back Surgical Blade | Bard-Parker | #10 | |
| Scalpel Handel | Havel's | HAN-G4 | |
| Surgical Scissors | World Precision Instruments | 504615 | |
| Mosquito Forceps | Sklar Surgical Instruments | 17-1225 | |
| Gauze Pads | Fisherbrand | 22-246-069 | |
| Adson Tissue Forceps | Teleflex | 181223 | |
| Dremel 111 Engraving Cutter | Amazon | Dremel 111 | |
| Microelectrode Array | Center for Microelectrdoe Technology, University of Kentucky | S2 4Ch MEA; custom made | |
| Headstage | Quanteon | 2pA/mV | |
| Wire, silver, PFA, .008" Bare, .0110" coated | A-M Systems | 786500 | |
| Fine Micromanipulator | Narishige Scientific Instrument Lab | MO-8 |
References
- Hall, M. J., DeFrances, C. J., Williams, S. N., Golosinskiy, A., Schwartzman, A. National hospital discharge Survey: 2007 summary. Natl Health Stat Report. (29), 1-24 (2010).
- Ikonomidou, C., et al. Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science. 283 (5398), 70-74 (1999).
- Mattson, M. P. Glutamate and neurotrophic factors in neuronal plasticity and disease. Ann N Y Acad Sci. 1144 (1), 97-112 (2008).
- Atlante, A., et al. Glutamate neurotoxicity, oxidative stress and mitochondria. FEBS Lett. 497 (1), 1-5 (2001).
- Kavitha, J., Durga, P., Ramachandran, G. Inhalational agents in anesthesia induced developmental neurotoxicity - Recent advances. Trends in Anaesthesia and Critical Care. 11 (1), 14-18 (2016).
- Zanghi, C. N., Jevtovic-Todorovic, V. A holistic approach to anesthesia-induced neurotoxicity and its implications for future mechanistic studies. Neurotoxicol Teratol. 60 (2), 24-32 (2017).
- Fan, X., et al. In situ real-time monitoring of glutamate and electrophysiology from cortex to hippocampus in mice based on a microelectrode array. Sensors (Basel). 17 (1), 1-8 (2016).
- Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
- Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Strömberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
- Benveniste, H. Brain microdialysis. J Neurochem. 52 (6), 1667-1679 (1989).
- Kohno, T., et al. An improved method for the detection of changes in brain extracellular glutamate levels. J Neurosci Methods. 81 (1-2), 199-205 (1998).
- Hascup, K. N., Hascup, E. R. Electrochemical techniques for subsecond neurotransmitter detection in live rodents. Comp Med. 64 (4), 249-255 (2014).
- Rooij, N. F., Koudelka-Hep, M., Frey, O. Biosensor microprobe array for in vivo monitoring of neurotransmitters. EPFL. , Lausanne. (2010).
- Fan, X. T., et al. Cortical glutamate levels decrease in a non-human primate model of dopamine deficiency. Brain Res. 1552, 34-40 (2014).
- Hunsberger, H. C., et al. Using enzyme-based biosensors to measure tonic and phasic glutamate in Alzheimer's mouse models. J Vis Exp. (123), (2017).
- Hill, A. J., Jones, N. A., Williams, C. M., Stephens, G. J., Whalley, B. J. Development of multi-electrode array screening for anticonvulsants in acute rat brain slices. J Neurosci Methods. 185 (2), 246-256 (2010).
- Defranchi, E., et al. Feasibility assessment of micro-electrode chip assay as a method of detecting neurotoxicity in vitro. Front Neuroeng. 4 (6), (2011).
- Whitaker, E. E., et al. Use of a piglet model for the study of anesthetic-induced developmental neurotoxicity (AIDN): A translational neuroscience approach. J Vis Exp. (124), (2017).
- Kilkenny, C., et al. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Salinas-Zeballos, M., Ceballos, G., Gootman, P. A stereotaxic atlas of the developing swine (Sus scrofa) forebrain. , 887-906 (1986).
- Whitaker, E. E., et al. A novel, clinically relevant use of a piglet model to study the effects of anesthetics on the developing brain. Clin Transl Med. 5 (1), (2016).
- Hascup, E. R., et al. Histological studies of the effects of chronic implantation of ceramic-based microelectrode arrays and microdialysis probes in rat prefrontal cortex. Brain Res. , 12-20 (2009).
- Hascup, K. N., Hascup, E. R., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Second-by-second measures of L-Glutamate and other neurotransmitters using enzyme-based microelectrode arrays. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 324 (2), 725-731 (2008).
- Rice, M. E., Cragg, S. J. Dopamine spillover after quantal release: rethinking dopamine transmission in the nigrostriatal pathway. Brain Res Rev. 58 (2), 303-313 (2008).
- Hascup, E. R., et al. Rapid microelectrode measurements and the origin and regulation of extracellular glutamate in rat prefrontal cortex. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1608-1620 (2010).
- Miele, M., Boutelle, M. G., Fillenz, M. The source of physiologically stimulated glutamate efflux from the striatum of conscious rats. J Physiol. 497 (Pt 3), 745-751 (1996).
- Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), 1626-1635 (2006).
- Quintero, J. E., et al. Amperometric measures of age-related changes in glutamate regulation in the cortex of rhesus monkeys. Exp Neurol. 208 (2), 238-246 (2007).
- Stephens, M. L., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A., Zhang, Z. Real-time glutamate measurements in the putamen of awake rhesus monkeys using an enzyme-based human microelectrode array prototype. J Neurosci Methods. 185 (2), 264-272 (2010).
- Kodama, T., Hikosaka, K., Watanabe, M. Differential changes in glutamate concentration in the primate prefrontal cortex during spatial delayed alternation and sensory-guided tasks. Exp Brain Res. 145 (2), 133-141 (2002).
- Galvan, A., Smith, Y., Wichmann, T. Continuous monitoring of intracerebral glutamate levels in awake monkeys using microdialysis and enzyme fluorometric detection. J Neurosci Methods. 126 (2), 175-185 (2003).
- During, M. J., Spencer, D. D. Extracellular hippocampal glutamate and spontaneous seizure in the conscious human brain. Lancet. 341 (8861), 1607-1610 (1993).
- Reinstrup, P., et al. Intracerebral microdialysis in clinical practice: baseline values for chemical markers during wakefulness, anesthesia, and neurosurgery. Neurosurgery. 47 (3), 701-710 (2000).
- Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
