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Cancer Research

सामान्य बृहदांत्र और कोलोरेक्टल कार्सिनोमा से मानव Endothelial कोशिकाओं का अलगाव-एक बेहतर प्रोटोकॉल

Published: April 4, 2018 doi: 10.3791/57400
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 4, 4, 2, *2, *1
1Division of Molecular and Experimental Surgery, Department of Surgery, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Surgery, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 3Division of Nephropathology, Department of Pathology, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 4Department of Pathology, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg
* These authors contributed equally

Summary

ट्यूमर endothelial कोशिकाओं ट्यूमर microenvironment के महत्वपूर्ण निर्धारकों और रोग के पाठ्यक्रम हैं । यहां, मानव कोलोरेक्टल कार्सिनोमा और सामांय बृहदांत्र से शुद्ध और व्यवहार्य endothelial कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल के लिए दवा परीक्षण और रोगजनन अनुसंधान में इस्तेमाल किया जाएगा वर्णित है ।

Abstract

प्राथमिक मानव कार्सिनोमा से अलग कोशिकाओं मूल्यवान उपकरण रोगजनकों रोग के विकास और प्रगति के लिए योगदान तंत्र की पहचान कर रहे हैं । विशेष रूप से, endothelial कोशिकाओं (ईसी) वाहिकाओं की भीतरी सतह का गठन, सीधे ऑक्सीजन वितरण, पोषक तत्वों की आपूर्ति में भाग लेने, और अपशिष्ट उत्पादों को हटाने के लिए और ट्यूमर से, और कर रहे है जिससे ट्यूमर के संविधान में प्रमुखता से शामिल microenvironment (टीएमई) । ट्यूमर endothelial कोशिकाओं (TECs) ट्यूमर और stromal कोशिकाओं के बीच संचार द्वारा स्थापित intratumoral microenvironment के सेलुलर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । TECs भी चिकित्सा के लक्ष्य के रूप में सेवा करते हैं । तदनुसार, संस्कृति में इन कोशिकाओं की प्रतिक्रिया या विरोधी angiogenic उपचार के लिए प्रतिरोध के तंत्र पर अध्ययन की अनुमति । हाल ही में, यह पाया गया कि TECs मानव कोलोरेक्टल कार्सिनोमा (सीआरसी) से अलग स्मृति प्रदर्शन विशिष्ट टीएमई वे से प्राप्त किए गए के आधार पर प्रभाव की तरह । इसके अलावा, इन TECs सक्रिय रूप से विभिंन कारकों के स्राव द्वारा एक विशिष्ट टीएमई की स्थापना के लिए योगदान करते हैं । उदाहरण के लिए, एक prognostically अनुकूल Th1-टीएमई में TECs विरोधी angiogenic ट्यूमर-दमन कारक स्रावित प्रोटीन, अम्लीय और cysteine में अमीर-1 की तरह (SPARCL1) । SPARCL1 पोत homeostasis को नियंत्रित करता है और ट्यूमर सेल प्रसार और प्रवास को रोकता है । इसलिए, शुद्ध, व्यवहार्य मानव ठोस ट्यूमर से अलग TECs की संस्कृतियों tumorigenesis में संवहनी प्रणाली की भूमिका पर कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं । यहां, एक नया अप करने की तारीख सामांय बृहदांत्र से प्राथमिक चुनाव आयोग के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सीआरसी वर्णित है । तकनीक यांत्रिक और एंजाइमी ऊतक पाचन, immunolabeling, और प्रतिदीप्ति सक्रिय कोशिका छँटाई (FACS)-ट्रिपल पॉजिटिव कोशिकाओं (CD31, VE-cadherin, CD105) की छंटाई पर आधारित है । इस प्रोटोकॉल के साथ, व्यवहार्य टेक या सामांय endothelial सेल (पूर्वोत्तर क्षेत्र परिषद) संस्कृतियों ६२.१२% की सफलता की दर के साथ बृहदांत्र ऊतकों से अलग किया जा सकता है जब FACS के अधीन-छंटाई (41 66 ऊतक नमूनों से शुद्ध ईसी संस्कृतियों) । तदनुसार, इस प्रोटोकॉल सामांय बृहदांत्र और सीआरसी से मानव चुनाव आयोग संस्कृतियों को अलग करने के लिए एक मजबूत दृष्टिकोण प्रदान करता है ।

Introduction

ट्यूमर microenvironment (टीएमई) ट्यूमर स्ट्रोमा, जो कोशिकाओं के endothelial कोशिकाओं (ईसी), pericytes, fibroblasts, चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं, या प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में शामिल है के साथ ट्यूमर कोशिकाओं के एक करीबी बातचीत के रूप में परिभाषित किया गया है । इन सेलुलर डिब्बों के बीच संचार paracrine कारकों (जैसे, angiogenic वृद्धि कारकों, साइटोकिंस), extracellular मैट्रिक्स, या सीधे सेल सेल से संपर्क द्वारा संचालित किया जा सकता है । stromal डिब्बे को बढ़ावा या ट्यूमर दीक्षा या प्रगति प्रतिक्रिया, विशिष्ट स्थापित टीएमई के आधार पर हो सकता है ।

एक ट्यूमर की क्षमता पोत प्रणाली के साथ कनेक्ट करने के लिए प्रगति और रोग के मेटास्टेसिस के लिए महत्वपूर्ण है । पोत प्रणाली ट्यूमर मुख्य रूप से ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के वितरण के रूप में अच्छी तरह से अपशिष्ट उत्पादों1,2,3को हटाने के लिए पहुंच प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है । चुनाव आयोग के जहाजों की भीतरी सतह का गठन, और इसलिए महत्वपूर्ण सेलुलर घटक है कि सक्रिय रूप से इस प्रक्रिया में भाग लेते हैं । यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि ट्यूमर endothelial कोशिकाओं (टेक) उनके इसी सामांय endothelial कोशिकाओं को अलग कर रहे है (परिषद) कई सुविधाओं के द्वारा इस तरह के संवहनी पेड़, पोत leakiness, या की कम संख्या के रूप में उदाहरण के रूप में कम परिपक्वता के परेशान पदानुक्रम pericytes/भित्ति कोशिकाओं है कि केवल ढीला चुनाव आयोग से जुड़ी4।

इसलिए, TECs कैंसरजनन अध्ययन करने के लिए मूल्यवान सेलुलर उपकरण हैं । TECs मुख्य रूप से ट्यूमर विकास और प्रगति3को बढ़ावा देने के लिए विचार किया गया । इस प्रकार, TECs के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि निगरानी और रोगजनक प्रक्रियाओं की पहचान की अनुमति है कि आरंभ, पालक, या प्रतिक्रिया tumorigenesis । इसके अलावा, वे क्लिनिक5में चिकित्सीय लक्ष्य हैं । नतीजतन, पृथक TECs और इसी एनईसीएस भी उपकरणों के लिए प्रतिक्रिया या विरोधी angiogenic उपचार के लिए प्रतिरोध के तंत्र को समझने के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

अतीत में, हम एक प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए इन कोशिकाओं को अलग6,7 और पहचान की है कि TECs एनईसीएस से ही अलग नहीं हैं, लेकिन यह भी टीएमई वे8से प्राप्त किए गए थे पर निर्भर करता है एक दूसरे से अलग । इस दृष्टिकोण के माध्यम से, यह दिखाया गया है कि कुछ TMEs में TECs सक्रिय रूप से SPARCL1 जैसे विरोधी angiogenic ट्यूमर दमन प्रोटीन के स्राव द्वारा ट्यूमर के विकास और प्रगति को प्रभावहीन कर सकते हैं । यह संकेत दिया कि TECs सक्रिय रूप से मानव कोलोरेक्टल कार्सिनोमा (सीआरसी)8में एक prognostically अनुकूल टीएमई की स्थापना में योगदान दे रहे हैं ।

पिछला अध्ययन ठोस ट्यूमर से मानव TECs को अलग करने का प्रयास किया । इन अध्ययनों का एक महत्वपूर्ण लक्ष्य था, जैसे, नए ट्यूमर endothelial सेल मार्करों (TEMs)9की पहचान । लेजर microdissection के बाद TECs के तत्काल उपयोग की रणनीति में परिवर्तन या संस्कृति में टेक phenotype के नुकसान से बचने के लिए लागू किया गया था । हालांकि, अनुवर्ती अध्ययन के इस दृष्टिकोण के एक गंभीर खामी के रूप में भित्ति कोशिकाओं की एक प्रदूषित जनसंख्या की पहचान10। हमारी प्रयोगशाला पहले एक प्रोटोकॉल है कि शुद्ध के अलगाव की अनुमति विकसित करने के लिए किया गया था, मानव सीआरसी के रोगियों से व्यवहार्य TECs6,7। TECs के कई चुंबकीय सेल चयन (एमएसीएस) दौर के साथ एक दृष्टिकोण है कि अलग ईसी संस्कृतियों की उच्च शुद्धता सुनिश्चित चुना गया था । हालांकि, इस दृष्टिकोण एक अपेक्षाकृत लंबी खेती की अवधि (औसत पर 6 सप्ताह), जो संस्कृति प्रेरित कलाकृतियों के जोखिम में वृद्धि की आवश्यकता है । इसलिए, अगले कदम में, उद्देश्य पहले शुद्ध संस्कृति की सर्जरी और फसल के बीच खेती के समय को कम करने के लिए किया गया था । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, एक उंनत प्रोटोकॉल प्रारंभिक ट्यूमर के एक संयुक्त यांत्रिक और एंजाइमी आधारित ऊतक पृथक्करण, प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटाई (FACS)-ट्रिपल-लेबल ईसी की छंटाई, विकसित किया गया था के बाद रोजगार । यह औसत पर तीन सप्ताह के लिए अलगाव समय कम, शुद्ध टेक और कार्यात्मक अध्ययन के लिए वृद्धि की व्यवहार्यता के साथ परिषद संस्कृतियों में जिसके परिणामस्वरूप । शुद्ध व्यवहार्य टेक और परिषद संस्कृतियों का अलगाव उच्च सफलता दर के साथ मानव ऊतकों से रोगी के लिए नए रास्ते खोल सकते है विशेष दवा परीक्षण व्यक्तिगत चिकित्सा परहेजों के विकास के दौरान । आइसोलेशन approach निम्न अनुच्छेदों में विस्तृत है ।

Protocol

यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर Erlangen (#159_15 बी, TuMiC-स्टडी) की स्थानीय एथिक्स कमेटी द्वारा आइसोलेशन प्रक्रिया को मंजूरी दे दी गई है । रोगी शामिल किए जाने के मानदंडों के रूप में इस प्रकार थे: सीआरसी, UICC चरण मैं चतुर्थ, भड़काऊ आंत्र रोग का कोई इतिहास, और कोई neoadjuvant उपचार ।

1. सर्जरी और एकल कोशिका अलगाव के लिए ऊतक की तैयारी

  1. एक सीआरसी रोगी से सर्जरी द्वारा नमूना प्राप्त करें (कार्सिनोमा ऊतक > 0.5 जी, केंद्रीय गैर-गल ट्यूमर; सामान्य बृहदांत्र ऊतक > 10 सेमी दूर ट्यूमर साइट से) ।
  2. प्राप्त ऊतक टुकड़े कार्सिनोमा के लिए ज्यादातर < 1 जी रहे हैं, लेकिन > 1 सामांय बृहदांत्र के लिए जी । यदि टुकड़े > 1 जी प्राप्त कर रहे हैं, उंहें कई 1 जी टुकड़ों में विभाजित आगे ऊतक प्रसंस्करण के लिए एक ताजा स्केलपेल का उपयोग कर ।
    नोट: ट्यूमर ऊतक टुकड़ा शुरुआत से 0.5 जी नीचे है, तो अलगाव आमतौर पर विफल रहता है ।
  3. ताजा unbalanced ऊतक बर्फ ठंड हैंक्स संतुलित नमक समाधान (HBSS) के साथ पूरक के 40 मिलीलीटर में बाँझ संदंश का उपयोग टुकड़े लीजिए पेनिसिलिन/streptomycin/amphothericin बी (1% HBSS-पेन/strep/अमफो) में 50 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब और उंहें जल्दी से हस्तांतरण प्रयोगशाला.
    नोट: पेट के ऊतकों अक्सर अत्यधिक शुरू से बैक्टीरिया/कवक के साथ दूषित है । अलगाव की पूरी प्रक्रिया के दौरान, कलम strep/अमफो सभी समाधान के लिए जोड़ा जाना चाहिए ताकि दूषित जीवों को खत्म करने के लिए ।
  4. प्रत्येक ऊतक टुकड़ा धो 40 मिलीलीटर बर्फ ठंड HBSS-कलम के साथ कम से 4 बार/strep/अमफो (चरण 1.3 देखें) में 50 मिलीलीटर ऊतक टुकड़े स्थानांतरित करके क्रमिक रूप से एक केंद्रापसारक ट्यूब से अगले ट्यूब बाँझ संदंश का उपयोग करके ।
    1. स्वच्छ संदंश 70% इथेनॉल के साथ हर कदम के बाद ।
    2. कार्सिनोमा और सामांय बृहदांत्र ऊतक टुकड़े के लिए अलग संदंश का प्रयोग करें ।
    3. सभी ऊतक टुकड़े तौलना ।
      नोट: वजन के लिए किसी स्केल पर सीधे टिशू पीस न रखें । धोने के बाद, पहले और ऊतक टुकड़े में प्रवेश करने के बाद ऊतक युक्त पिछले केंद्रापसारक ट्यूब वजन । घटाव द्वारा व्यक्तिगत ऊतक टुकड़े के वजन की गणना ।

2. एकल कोशिका निलंबन की पीढ़ी

नोट: यह ऊतक हर समय moisturized रखने के लिए सिफारिश की है ।

  1. अगर यह मौजूद है, एक बाँझ कोशिका संस्कृति पेट्री पकवान बाँझ संदंश का उपयोग करके संलग्न वसा, अन्य गैर-ट्यूमर ऊतक, सर्जरी नमूना से या संभावित रूप से गल ऊतक भागों में ऊतक टुकड़े स्थानांतरित द्वारा हटा दें ।
    1. ऊतक टुकड़े HBSS-कलम/strep/अमफो के 3-5 मिलीलीटर जोड़कर हर समय moisturized रखें ।
    2. ऊतक टुकड़े ट्रिम कर दीजिए एक ताजा बाँझ स्केलपेल का उपयोग (चित्रा 1). मामले में एक पैथोलॉजिस्ट से परामर्श करें ऊतक पहचान अस्पष्ट है ।
  2. छोटे टुकड़ों में शेष ऊतक कीमा (लगभग 2 × 2 × 2 मिमी3) एक घुमावदार ब्लेड के साथ एक ताजा स्केलपेल का उपयोग कर । ऊतक पृथक्करण ट्यूबों में बाँझ संदंश के साथ स्थानांतरण ऊतक टुकड़े (उदाहरण के लिए, gentleMACS सी ट्यूबों) पूर्व से भरा-गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) सेल कल्चर मीडियम (Dulbecco ´ एस संशोधित ईगल मीडियम [DMEM] बेसल माध्यम) के अनुसार निर्माता के निर्देश.
    नोट: एक रॉकिंग उपकरण की तरह स्केलपेल का उपयोग करने का प्रयास करें । ऊतक क्षति से बचने के क्रम में कोशिकाओं निचोड़ नहीं है ।
  3. डाइजेस्ट/अलग कर देना ऊतक के टुकड़ों का उपयोग कर एक ऊतक dissociator (जैसे gentleMACS Octo dissociator) मानव ऊतक के लिए ट्यूमर पृथक्करण किट के साथ संयोजन में कार्यक्रम का उपयोग कर "37C_h_TDK_1" निर्माता ´ एस निर्देशों का पालन ।
  4. केंद्रापसारक 1 मिनट के लिए पृथक्करण ट्यूबों 300 x जी में कमरे के तापमान पर (RT) ।
  5. पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) के 10 मिलीलीटर जोड़ें 0.5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) (DMEM-कम) के साथ पूरक DMEM प्रत्येक ट्यूब का उपयोग कर एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट और सेल एक सेल छलनी (100 µm ताकना आकार) के शीर्ष पर एक 50-एमएल केंद्रापसारक ट्यूब सेल pipetting द्वारा का उपयोग कर निलंबन फ़िल्टर फ़िल्टर के शीर्ष पर निलंबन ।
  6. DMEM के 10 मिलीलीटर-कम एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट द्वारा प्रत्येक एमएसीएस-ट्यूब को फिर से जोड़ें और शेष कोशिकाओं को 50 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब के शीर्ष पर सेल छलनी करने के लिए स्थानांतरण ।
  7. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर DMEM-कम माध्यम के अतिरिक्त 10 मिलीलीटर के साथ एक बार सेल छलनी धो लें ।
  8. 7 मिनट के लिए आरटी पर 300 x जी में सेल निलंबन केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
  9. पूर्व गर्म endothelial बेसल मध्यम (इबीएम) -2-microvascular (एमवी) मध्यम (Lonza) पेन के साथ पूरक के 5 मिलीलीटर में पुनर्निलंबित/strep/अमफो में ही 50 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब ।
  10. एक टी में प्लेट सेल सस्पेंशन-25 सेल संस्कृति कुप्पी पूर्व-1.5% जिलेटिन-फास्फेट के साथ रात में लेपित (पंजाब) 37 ° c के साथ 5% सह2।
  11. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2में 24 ज के लिए कोशिकाओं की मशीन, पंजाब के लगभग 5 मिलीलीटर के साथ दो बार ध्यान से कोशिकाओं को धोने, और ताजा माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें ।
  12. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सह पर कोशिकाओं की खेती2 जब तक 80-90% प्रवाह (आमतौर पर 5-7 दिन) मध्यम नवीकरण के 48 घंटे के अंतराल के साथ ।

3. FACS-Endothelial कोशिकाओं की छंटाई

नोट: किसी भी बिंदु पर कोशिकाओं को खोने से बचने के लिए, एक एकल एजेंट ट्यूब में कोशिकाओं की मशीन के लिए धुंधला प्रक्रिया सीमित द्वारा उदा की कोशिश करो ।

  1. accutase के 1 मिलीलीटर (लगभग 10 मिनट) के साथ कोशिकाओं को अलग करें, और पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) इबीएम-2-एमवी मध्यम के 4 मिलीलीटर जोड़ें ।
  2. एक स्वचालित कक्ष गिनती डिवाइस (रेंज 10-25 µm) का उपयोग कर सेल गिनती निर्धारित करें ।
  3. आर टी पर 250 x जी के साथ 4 मिनट के लिए सेल निलंबन केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
  4. सेल काउंट (5 x 106µ) के अनुसार पूर्व-उष्ण FACS-बफ़र (1x पंजाबस, 2.5% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन [BSA], 5 mM EDTA pH 8.0, 10/mL m Y-२७६३२) में कक्षों को पुनः निलंबित करें ।
  5. सेल गणना/FACS-बफर मात्रा के अनुसार FACS-धुंधला एंटीबॉडी जोड़ें: CD31-FITC (100 µ एल/एमएल = 1/10), CD144/संवहनी endothelial (VE)-cadherin-PE (100 µ l/एमएल = 1/10), CD105-APC (25 µ एल/एमएल = 1/40), मिश्रण और प्रकाश से सुरक्षित आरटी पर 7 मिनट के लिए मशीन; धीरे झटका और एक और 8 मिनट के लिए मशीन (15 मिनट की कुल मशीन समय के लिए) ।
  6. सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करके लेबल किए गए कक्ष में 2 मिलीलीटर FACS-बफ़र जोड़ें ।
  7. आर टी पर 250 x जी के साथ 4 मिनट के लिए केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
  8. FACS-बफर के 2 मिलीलीटर जोड़कर दो बार धो, और 4 मिनट के लिए आरटी पर 250 x जी में एक बाद के केंद्रापसारक आचरण और supernatant त्यागें ।
  9. पूर्व गर्म इबीएम के 500 µ एल में कोशिकाओं reसस्पेंड-2-एमवी-कलम/strep/अमफो और FACS-छँटाई साधन करने के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण ।
    1. Endothelial कोशिकाओं जल्दी छंटाई प्रक्रिया के दौरान मर जाएगा अगर FACS-साधन ठंडा है । इसलिए, आरटी पर endothelial कोशिकाओं की छंटाई बाहर ले और तुरंत बाद में 37 डिग्री सेल्सियस मशीन के लिए एकत्र कोशिकाओं को स्थानांतरित ।
      नोट: FACS-साधन आम तौर पर अनबाँझ है!
  10. ट्रिपल-सकारात्मक कोशिकाओं को सीधे एक सेल कल्चर डिश में क्रमबद्धकरें (उदा., 24-अच्छी प्लेट से पूर्व लेपित-1.5% जिलेटिन-पंजाबियों के साथ रातोंरात) पूर्व गर्म ताजा मध्यम (इबीएम-2-MV-pen/strep/अमफो) की 0.5 मिलीलीटर से भरा ।
    नोट: एक खुर्दबीन का उपयोग छंटाई के बाद सेल निलंबन की जांच करें । यदि कक्ष एक साथ क्लस्टर, उंहें धीरे से मिश्रण या मध्यम जोड़ने के द्वारा सेल संस्कृति डिश में एक भी सेल वितरण प्राप्त करने का प्रयास करें ।
  11. 90 तक कोशिकाओं की खेती-100% मध्यम नवीकरण के 48 घंटे के अंतराल के साथ प्रवाह और वांछित संस्कृति पकवान आकार (24 अच्छी तरह से प्लेट → 12 अच्छी तरह से प्लेट → 3.5 cm डिश → टी 25 → टी-75) के लिए कोशिकाओं का विस्तार ।

4. फसल और शुद्ध Endothelial कोशिकाओं के लक्षण वर्णन

  1. 90 पर फसल कोशिकाओं-100% प्रवाह और उंहें एक उपयुक्त विधि द्वारा विशेषताएं (उदा, FACS, cytochemistry, मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR), या endothelial सेल समारोह परख7,8) ।
  2. जो भी लक्षण वर्णन विधि के साथ पृथक कोशिकाओं का विश्लेषण चुना है ।

Representative Results

एक संयुक्त यांत्रिक द्वारा मानव सीआरसी से विकास परिषद और टेक के अलगाव/enzymatical ऊतक पृथक्करण, बाद में CD31 द्वारा पीछा/CD105/VE-cadherin चालित FACS-छंटाई यहां वर्णित है (चित्रा 1) । यह प्रोटोकॉल पिछले एमएसीएस-आधारित प्रोटोकॉल की तुलना में शुद्ध, व्यवहार्य endothelial कोशिकाओं की पहली फसल जब तक एक कम समय खिड़की के साथ एक बेहतर प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करता है7।

परिषद और टेक मानव सीआरसी से अलग निंनलिखित कदम का उपयोग कर रहे थे: (1) संयुक्त यांत्रिक और एंजाइमी ऊतक पृथक्करण और इन कोशिकाओं के विकास के द्वारा एक एकल सेल निलंबन के उत्पादन 80-90% प्रवाह (चित्रा 1), (2) चुनाव आयोग के लेबल ट्रिपल CD31/CD105/VE-cadherin fluorochrome-युग्मित एंटीबॉडी, और (3) FACS-संबंधित ट्रिपल पॉजिटिव कोशिकाओं की छंटाई (चित्रा 2) । ध्यान दें, अलगाव की प्रक्रिया और कोशिकाओं की व्यवहार्यता की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण कदम जल्दी से अलगाव की प्रक्रिया (एकल कक्ष निलंबन के बाद < 1 घंटे की पीढ़ी) के लिए शल्य चिकित्सा नमूना विषय है । FACS का प्रयोग-छंटाई, 12,500 टेक का मतलब (एन = 12) और १७,८०० परिषद (एन = 12, चित्रा 2बी, वाम) 3.6 और कुल सेल जनसंख्या का 5.6% की एक औसत का प्रतिनिधित्व (चित्रा 2बी, सही) अलग हो सकता है । बाद में, कोशिकाओं को विस्तारित किया गया टी-75 (अवधि बीतने 1) और या तो काटा या आगे विश्लेषण के लिए कार्रवाई की । नोट की, पिछले एमएसीएस-आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, ४९.६% की एक औसत अलगाव सफलता प्राप्त किया गया था (n = 58 शुद्ध चुनाव आयोग संस्कृतियों के साथ = 117 TECs8रोगियों के लिए शुद्ध ईसी के साथ) 6 सर्जरी के बाद सप्ताह के औसत पर उपलब्ध है । नए FACS-आधारित प्रोटोकॉल का प्रयोग यहां वर्णित है, पहले शुद्ध ईसी संस्कृतियों औसत पर 3 सप्ताह ६२.१% की एक अलगाव सफलता दर के साथ सर्जरी के बाद प्राप्त किया (n = 41 शुद्ध चुनाव आयोग n से प्राप्त 66 एकल कोशिकाओं निलंबन FACS-छंटाई के अधीन) थे । इसलिए, 6 से 3 सप्ताह से खेती के समय की कमी के साथ समानांतर में 12.5% द्वारा अलगाव दर की वृद्धि हासिल की गई । खेती के समय की यह कमी कोशिका व्यवहार्यता और लंबे समय तक जीवन की स्थापना की संस्कृतियों के संभावित संस्कृति पर निर्भर कलाकृतियों की प्रेरण के लिए कम जोखिम के साथ में सुधार के लिए नेतृत्व किया ।

चुनाव आयोग पवित्रता का लक्षण वर्णन पहले CD31 द्वारा आयोजित किया गया था-cytochemistry (चित्रा 3ए) । यदि संस्कृतियों CD31-नकारात्मक कोशिकाओं से रहित थे (चित्रा 3ए, टेक और पूर्वोत्तर क्षेत्र विकास परिषद), वे एक और अधिक विस्तृत रिवर्स प्रतिलेखन मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (RT-qPCR) द्वारा टाइपिंग सेल के अधीन थे (चित्रा 3बी) । चुनाव आयोग के लिए सेल प्रकार विशिष्ट प्राइमरों (CD31, CD105, VE-cadherin, और वॉन Willebrand फैक्टर [vWF]), ल्यूकोसाइट्स (CD45), उपकला कोशिकाओं (cytokeratin [CK]-20), और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं/fibroblasts (desmin) इस्तेमाल किया गया (चित्रा 3बी). इस qPCR-आधारित सेल टाइपिंग का उपयोग करना, 0.1-2% की श्रेणी में अन्य कोशिकाओं द्वारा ईसी संस्कृतियों के संभावित संदूषण, कोशिका प्रकार के आधार पर,8का पता लगाया जा सकता है ।

विशेष रूप से, हम पहले टेक संस्कृतियों में vWF प्रोटीन अभिव्यक्ति की उनकी इसी परिषद संस्कृतियों7की तुलना में तरजीही नुकसान की सूचना दी । इन निष्कर्षों की पुष्टि की नव स्थापित अलगाव प्रोटोकॉल के साथ (चित्रा 3सी, मतलब सीटी नुकसान परिषद-टेक = ०.६८७, पी = ०.१७३, युग्मित टी परीक्षण) हो सकता है । संस्कृतियों सफलतापूर्वक इन गुणवत्ता नियंत्रण गुजर माइकोप्लाज्मा संक्रमण के लिए परीक्षण किया गया और बाद में आगे के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल ।

Figure 1
चित्र 1 : शुद्ध endothelial कोशिकाओं FACS-छँटाई द्वारा मानव सामान्य बृहदांत्र और सीआरसी से पृथक किया जा सकता है । (A) ईसी आइसोलेशन प्रक्रिया के आवश्यक चरणों का प्रवाह चार्ट । (ख) वसा ऊतक (पीला), अन्य गैर-ट्यूमर भागों, या संभावित रूप से गल ऊतक भागों (ब्राउन) सर्जरी नमूना (बाएँ और मध्य पैनल) से हटा दिया गया था और ट्यूमर 2-3 मिमी की ओर लंबाई के क्यूब्स में विघटित किया गया था ऊतक पृथक्करण करने से पहले ( दायां फलक) । (ग) एकल सेल निलंबन के बाद प्राप्त ऊतक पृथक्करण (बाएं पैनल) सेल संस्कृति व्यंजन में 24 ज के लिए मशीन था । बाद में, गैर अनुयाई कोशिकाओं सज्जन (मध्य पैनल) का उपयोग कर कपड़े धोने से हटा दिया गया था और कोशिकाओं को 80-90% FACS से पहले प्रवाह (सही पैनल) को उगाया गया । निचले पैनल (सी) के चित्र चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहीत किए गए थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : एकल सेल निलंबन के 3.6-5.6% की एक औसत मानव सीआरसी रोगियों से अलग और FACS द्वारा क्रमबद्ध ट्रिपल-सकारात्मक चुनाव आयोग थे । (क) परिषद और टेक FACS थे-विरोधी CD31,-CD105 और-VE-cadherin एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं के एक ट्रिपल लेबलिंग का उपयोग कर हल । (B) 12,500 TECs (n = 12) और १७,८०० एनईसीएस (n = 12) का माध्य FACS-सॉर्टिंग (CD31) का उपयोग करके मानव सामान्य बृहदांत्र या सीआरसी से पृथक किया जा सकता है । CD105 और VE-cadherin-सकारात्मक कोशिकाओं, बाएँ पैनल), जो औसत 3.6 और कुल सेल के 5.6% (दाएँ पैनल) पर प्रतिनिधित्व करता है लोकसंख्या कार्यरत आहे. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : विकास परिषद और मानव सीआरसी एक्सप्रेस से टेक ठेठ endothelial सेल मार्करों । सामांय बृहदांत्र endothelial कोशिकाओं (परिषद, एन = 10) और ट्यूमर endothelial कोशिकाओं (टेक, n = 10) मानव सीआरसी से CD31 है (ईसी मार्कर)-, CD105 (ईसी मार्कर)-, VE-cadherin (ईसी मार्कर)-, vWF (ईसी मार्कर)-पॉजिटिव और CK20 (सीआरसी सेल मार्कर)-, desmin (fibroblast/एसएमसी मार्कर)-, CD45 ( ल्युकोसैट मार्कर)-ऋणात्मक के रूप में (A) CD31-immunocytochemistry (धनात्मक कोशिकाएं = लाल) और (B) RT-qPCR (डैश्ड रेखा के नीचे डेटा पॉइंट्स के नमूने ऋणात्मक होने का पता लगाया जाता है) । (ग) vWF अभिव्यक्ति के रूप में एक ही रोगियों से इसी टेक/परिषद के नमूने के लिए RT-qPCR द्वारा निर्धारित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

मुख्यतः, तीन विभिंन तरीकों से नियोजित किया गया है इस प्रकार अभी तक के लिए शुद्ध और व्यवहार्य एनईसीएस और TECs मानव ठोस ऊतकों से अलग है, अर्थात् (1) immunomagnetic संवर्धन, (2) लेजर microdissection, और (3) FACS-ईसी अंश की छंटाई । अधिकांश प्रकाशनों में, यांत्रिक विघटन द्वारा एक एकल कोशिका निलंबन के बाद की कोशिकाओं के immunomagnetic संवर्धन11,12,13का उपयोग किया गया था । उदाहरण के लिए, E-selectin एंटीबॉडी द्वारा मानव अधययन microvascular ईसी (HDMEC) का immunomagnetic शुद्धिकरण ट्यूमर परिगलन कारक के बाद (TNF)-नवजात चमड़ियों से α उपचार13 ऊतक द्वारा तंत्रिकाबंधार्बुद से मानव चुनाव आयोग के अलगाव के लिए सूचित किया गया है डाइजेस्ट, percoll ढाल, और चयन विरोधी CD31/CD105 और VE-cadherin-एंटीबॉडी12, या विरोधी द्वारा मानव स्तन कार्सिनोमा11से CD105 एंटीबॉडी का उपयोग कर । लेजर microdissection या FACS-छंटाई कार्यरत प्रोटोकॉल कम बार रिपोर्ट किया गया है । लेजर microdissection इस्तेमाल किया गया था, उदाहरण के लिए, संभावित पैन-ट्यूमर endothelial सेल मार्करों (TEMs) की पहचान करने के लिए तुरंत विच्छेदन9के बाद कोशिकाओं के विश्लेषण के साथ मानव कोलोरेक्टल कार्सिनोमा से व्युत्पंन । FACS-विरोधी CD31-एंटीबॉडी का उपयोग कर छंटाई सफलतापूर्वक विभेदित मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं14से ईसी अंश के अलगाव के लिए प्रदर्शन किया गया था ।

इन तरीकों अलग फायदे और नुकसान है कि विचार किया जाना है । immunomagnetic के लिए लाभ-दृष्टिकोण आधारित है कि कोई व्यापक उपकरणों की आवश्यकता है, चयन किसी भी समय आयोजित किया जा सकता है, और सेल संवर्धन तेजी से (लगभग 15 मिनट) के रूप में FACS की तुलना में (लगभग 1 ज) छंटाई । समय की एक लंबी अवधि के लिए मैट्रिक्स की कमी anoikis द्वारा चुनाव आयोग के सेल मौत पैदा कर सकता है । इसलिए, FACS बफ़र के लिए rho कळेनासे अवरोधक Y-२७६३२ के अलावा सेल anoikis15को रोकने के लिए नियोजित किया गया था ।

immunomagnetic संवर्धन के नुकसान है कि चयन के कई दौर के लिए 99% से ऊपर शुद्धता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं । इसके अलावा, संवर्धन के बीच सेल खेती सेल वसूली, जो संस्कृति प्रेरित कलाकृतियों का समर्थन संस्कृतियों की उंर बढ़ जाती है के लिए आवश्यक है । लेजर microdissection लाभ है कि कोशिकाओं को तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है जो संस्कृति प्रेरित कलाकृतियों को कम कर देता है, लेकिन आसन्न ऊतक क्षेत्रों से कोशिकाओं द्वारा संदूषण के जोखिम में शामिल10. इसके अलावा, microdissection हर प्रयोगशाला में स्थापित नहीं है । FACS के नुकसान-छंटाई आधारित दृष्टिकोण में शामिल हैं, लेजर microdissection के समान है, कि उपकरण विस्तृत और लागत गहन है । तदनुसार, यह उपकरण किसी भी समय सुलभ नहीं हो सकता है । एक नैदानिक सेटिंग में, जहां ब्याज के ऊतकों की उपलब्धता बिल्कुल नहीं की योजना बनाई जा सकता है, यह एक और नुकसान जोड़ सकते हैं ।

हालांकि, FACS-छंटाई के प्रमुख लाभ है कि चुनाव आयोग अंश समानांतर में एकाधिक एंटीबॉडी द्वारा लेबल किया जा सकता है । इस प्रकार, एक कड़े गेटिंग रणनीति नियोजित किया जा सकता है जो एक उच्च शुद्धता सुनिश्चित करेगा । अनुभव के आधार पर, कोई फिर से चुनाव आयोग अंश की छंटाई की आवश्यकता थी, पिछले एमएसीएस आधारित प्रोटोकॉल के विपरीत, जहां चयन के कई दौर के लिए नियोजित किया जाना था । इस FACS दृष्टिकोण में तीन सप्ताह के लिए छह सप्ताह (एमएसीएस दृष्टिकोण) से शुद्धता तक एक काफी कम खेती के समय के लिए नेतृत्व किया, एक सुधार कक्ष व्यवहार्यता विश्लेषण के एक लंबे समय तक खिड़की को सक्षम करने में जिसके परिणामस्वरूप । अंत में, FACS-छंटाई आधारित रणनीति, समग्र अलगाव सफलता दर के एक सुधार का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है (12.5% की वृद्धि हुई है) । अंत में, FACS-छँटाई आधारित संयुक्त यांत्रिक और एंजाइमी ऊतक पाचन द्वारा ऊतक पचाने के बाद समानांतर में 3 एंटीबॉडी को रोजगार रणनीति कई फायदे है कि TECs के अलगाव के लिए पसंद की विधि के रूप में इस प्रोटोकॉल की स्थापना की थी और मानव कोलोरेक्टल कार्सिनोमा और बृहदांत्र से एनईसीएस ।

Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी रुचि नहीं है ।

Acknowledgments

हम ईसाई Flierl, Katja Petter, क्रिस्टीना Schnürer (आणविक और प्रायोगिक सर्जरी के सभी प्रभाग), Uwe Appelt, माइकल Mroz (कोर यूनिट FACS-छंटाई) और साइमन Völkl (कोर यूनिट FACS-Immunomonitoring) उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए धंयवाद । यह काम विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र Erlangen के नैदानिक अनुसंधान (IZKF) के लिए अनुशासनात्मक केंद्र के एन/एमएस के लिए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG: २४३८ के लिए, SP2) और Lutz-Stiftung, एक अनुदान द्वारा रॉबर्ट-Pfleger-Stiftung को VSS के रूप में अच्छी तरह के रूप में जर्मन अनुसंधान फाउंडेशन [DFG: KFO257 (उप परियोजना 4), SFB (उप परियोजना B9) से एमएस को संमानित किया अनुदान द्वारा] ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS 1x Gibco by Life Technologies 14175-053
Penicillin-streptomycin Gibco by Life Technologies 15140-122
amphotericin B Gibco by Life Technologies 15290-026
Scalpels, disposable Feather No. 23
gentleMACS octo dissociator Miltenyi Biotec 130-095-937
gentleMACS C-tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
human tumor dissociation kit Miltenyi Biotec 130-095-929
DMEM Gibco by Life Technologies 21969-035
EGM-2-MV BulletKit Lonza CC-3202
Cell strainer, 100 µm Falcon 352360
StemPro Accutase  Gibco by Life Technologies A11105-01
Cell counter, automated Coulter Counter Z1
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503
CD31-FITC BD Pharmingen 555445
CD144/VE-cadherin-PE BD Pharmingen 560410
CD105-APC BD Pharmingen 562408
gelatin from bovine skin Sigma-Aldrich G9391
FACS-Sorting device Beckman Coulter MoFlo XDP

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 134 Endothelial कोशिकाओं पोत कोलोरेक्टल कार्सिनोमा ट्यूमर सामांय बृहदांत्र CD31 VE-cadherin CD105 FACS-छंटाई ऊतक पृथक्करण ट्यूमर Microenvironment Fibroblasts
सामान्य बृहदांत्र और कोलोरेक्टल कार्सिनोमा से मानव Endothelial कोशिकाओं का अलगाव-एक बेहतर प्रोटोकॉल
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Naschberger, E., Regensburger, D.,… More

Naschberger, E., Regensburger, D., Tenkerian, C., Langheinrich, M., Engel, F. B., Geppert, C., Hartmann, A., Grützmann, R., Schellerer, V. S., Stürzl, M. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol. J. Vis. Exp. (134), e57400, doi:10.3791/57400 (2018).

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