Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Isolering af menneskelige endotelceller fra normale kolon og Colorectal karcinom - en forbedret protokol

Published: April 4, 2018 doi: 10.3791/57400
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 4, 4, 2, *2, *1
1Division of Molecular and Experimental Surgery, Department of Surgery, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Surgery, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 3Division of Nephropathology, Department of Pathology, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 4Department of Pathology, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg
* These authors contributed equally

Summary

Tumor endotelceller er vigtige determinanter af tumor mikromiljø og forløbet af sygdommen. Her, er en protokol til isolering af ren og levedygtige endotelceller fra menneskelige colorectal karcinom og normal kolon skal anvendes i drug test og patogenese forskning beskrevet.

Abstract

Primærelementer isoleret fra menneskelige karcinomer er værdifulde værktøjer til at identificere patogene mekanismer bidrager til udvikling af sygdom og progression. Især endotelceller (EF) som udgør den indvendige overflade af fartøjer, direkte deltage i ilttilførsel, næringsstofforsyning og fjernelse af affaldsprodukter til og fra tumorer, og dermed en fremtrædende deltager i forfatningen af tumor mikromiljø (TME). Tumor endotelceller (TECs) kan bruges som cellulære biosensorer af intratumoral mikromiljø etableret af kommunikation mellem tumor og stromale celler. TECs også fungere som mål for terapi. I overensstemmelse hermed, tillade disse celler i kultur studier på mekanismer af svar eller modstand mod anti-angiogene behandling. For nylig, blev det konstateret at TECs isoleret fra menneskelige colorectal karcinom (CRC) udstille hukommelse-lignende effekter baseret på den specifikke TME de blev afledt. Desuden, disse TECs bidrage aktivt til oprettelsen af en specifik TME af udskillelsen af forskellige faktorer. For eksempel udskiller TECs i en prognostically gunstige Th1-TME den anti-angiogene tumor-undertrykkende faktor udskilles protein, sure og rigt på cystein-lignende 1 (SPARCL1). SPARCL1 regulerer fartøj homøostase og hæmmer tumor celleproliferation og migration. Dermed er kulturer af ren, levedygtig TECs isoleret fra menneskelige solide tumorer et værdifuldt redskab for funktionelle studier på det vaskulære system i tumordannelse rolle. Her, er en ny up-to-date protokol til isolering af primære EF fra den normale kolon samt CRC beskrevet. Teknikken er baseret på mekaniske og enzymatiske væv fordøjelsen, immunolabeling og fluorescens aktiveret celle sortering (FACS)-sortering af triple-positive celler (CD31, VE-cadherin, CD105). Med denne protokol, levedygtig TEC eller normal endotel celle (NEC) kulturer kunne være isoleret fra tyktarmen væv med en succesrate på 62.12% når de udsættes for FACS-sortering (41 ren EF kulturer fra 66 vævsprøver). Derfor giver denne protokol en robust tilgang for at isolere menneskelige EF kulturer fra normale kolon og CRC.

Introduction

Tumor mikromiljø (TME) defineres som en tæt samspil mellem tumorceller og tumor stroma, der består af celler som endotelceller (EF), pericytes, fibroblaster, glatte muskelceller eller immunceller. Kommunikationen mellem disse cellulære rum kan være drevet af paracrine faktorer (fx angiogene vækstfaktorer, cytokiner), af den ekstracellulære matrix, eller direkte celle-celle kontakt. Stromale rummet kan fremme eller modvirke tumor initiering eller progression, afhængigt af den specifikke TME etableret.

En tumor evne til at forbinde med fartøjet system er nøglen til progression og metastaser af sygdommen. Fartøj systemet tillader tumor overvejende til at få adgang til levering af ilt og næringsstoffer samt fjernelse af affaldsprodukter1,2,3. EF udgør den indvendige overflade af fartøjer, og er derfor vigtige cellulære komponenter, der deltager aktivt i denne proces. Det er velkendt, at tumor endotelceller (TEC) er anderledes end deres tilsvarende normale endotelceller (NEC) af mange funktioner såsom forstyrret hierarki af vaskulær træ, skibet leakiness, eller reduceret modning, som eksemplificeret af et reduceret antal pericytes/vægmaleri celler, der er kun løst tilknyttet EF4.

Dermed er TECs værdifulde cellulære værktøjer at studere carcinogenese. TECs ansås primært at fremme tumor vækst og progression3. TECs kan således bruges som biosensorer, der giver mulighed for overvågning og identifikation af patogene processer, der indlede, fremme eller modvirke tumordannelse. Derudover er de terapeutiske mål i klinik5. Derfor kan isoleret TECs og tilsvarende NECs også bruges som værktøjer til at forstå mekanismerne i svar eller modstand mod anti-angiogene behandling.

I fortiden, vi udviklede en protokol til at isolere disse celler6,7 og identificeret at TECs er ikke kun adskiller sig fra NECs, men også adskiller sig fra hinanden alt efter TME de blev afledt fra8. Gennem denne tilgang blev det vist, at TECs i visse TMEs aktivt modvirke tumorvækst og progression af sekretion af anti-angiogene tumor-undertrykkende proteiner som SPARCL1. Det angives, at TECs bidrager aktivt til oprettelse af en prognostically gunstige TME i menneskelige colorectal karcinom (CRC)8.

Tidligere undersøgelser har forsøgt at isolere menneskelige TECs fra solide tumorer. Et vigtigt mål for disse undersøgelser var, fx identifikation af nye tumor endotel celle markører (tering)9. En strategi for umiddelbar brug af TECs efter laser microdissection blev anvendt for at undgå ændring eller tab af TEC fænotype i kultur. Men opfølgende undersøgelser identificeret vægmaleri celler kontaminerende indbyggere som en alvorlig ulempe ved denne tilgang10. Vores laboratorium var først til at udvikle en protokol, der tillod isolering af ren, levedygtig TECs fra menneskelige CRC patienter6,7. Blev valgt en tilgang med flere magnetiske celle udvalg (MLA) runder af TECs, som sikrede høj renhed af de isolerede EF kulturer. Men denne fremgangsmåde kræves en relativt lang dyrkning periode (6 uger i gennemsnit), som øger risikoen for kultur-induceret artefakter. Derfor, i det næste trin, målet var at reducere dyrkning tid mellem kirurgi og høst af den første ren kultur. For at nå dette mål, en forbedret protokol beskæftiger en kombineret mekaniske og enzymatiske-baserede væv dissociation af den oprindelige tumor, efterfulgt af fluorescens aktiveret celle sortering (FACS)-sortering af triple-mærket EF, blev udviklet. Dette reduceret isolation tid i gennemsnit til tre uger, hvilket resulterer i TEF og NEC renkulturer med øget rentabilitet for funktionelle studier. Isolering af ren levedygtige TEC og NEC kulturer fra humane væv med høj succesrate kan åbne nye muligheder for patienten-specifikke drug test under udviklingen af individualiseret behandling regimer. Isoleret tilgang er detaljeret beskrevet i de følgende afsnit.

Protocol

Isoleret proces er blevet godkendt af de lokale etiske udvalg af University Medical Center Erlangen (#159_15 B, TuMiC-undersøgelsen). Patient inklusionskriterierne var som følger: CRC, UICC fase I-IV, ingen historie af inflammatorisk tarmsygdom, og ingen neoadjuverende behandling.

1. kirurgi og forberedelse af væv til enkelt celle Isolation

  1. Få prøvemateriale ved kirurgi fra en CRC patient (carcinoma væv > 0,5 g, centrale ikke-nekrotisk tumor; normale tyktarmen væv > 10 cm afstand fra tumor site).
  2. De opnåede væv stykker er for det meste < 1 g for karcinom, men > 1 g for den normale kolon. Hvis stykker > 1 g er fremstillet, opdele dem i flere 1 g stykker med en frisk skalpel til videreforarbejdning væv.
    Bemærk: Hvis tumor væv stykke ligger under 0,5 g fra starten, isolation normalt mislykkes.
  3. Indsamle frisk unfixed væv stykker ved hjælp af steril pincet i 40 mL af is kold Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS) suppleret med penicillin/streptomycin/amphothericin B (1% HBSS-pen/strep/ampho) i 50 mL centrifugeglas og overføre dem hurtigt til den laboratorium.
    Bemærk: Tyktarmen væv er ofte stærkt forurenet med bakterier/svampe fra starten. Under hele proceduren for isolation, skal strep-pen-ampho føjes til alle løsninger for at fjerne forurenende organismer.
  4. Vask hver væv stykke mindst 4 gange med 40 mL is kold HBSS-pen/strep/ampho (Se trin 1.3) i 50 mL centrifugeglas ved at overføre væv stykker sekventielt fra et centrifugeglas til næste røret ved hjælp af steril pincet.
    1. Ren pincet efter hvert trin med 70% ethanol.
    2. Bruge separate pincet til carcinom og normal tyktarmen væv stykker.
    3. Veje alle væv stykker.
      Bemærk: Læg ikke væv stykker direkte på en skala, vejning. Efter vask, veje den sidste centrifugeglasset indeholdende væv, før og efter indtastning væv stykker. Beregn vægten af individuelle væv stykker ved subtraktion.

2. generation af enkelt cellesuspension

Bemærk: Det anbefales at holde væv fugtet på alle tidspunkter.

  1. Hvis den eksisterer, fjerne vedhæftede fedt, andre ikke-tumorous væv eller potentielt nekrotisk væv dele fra kirurgi prøvemateriale ved at overføre væv stykker i en steril celle kultur petriskål ved hjælp af steril pincet.
    1. Holde væv stykker fugtet på alle tidspunkter ved at tilføje 3-5 mL af HBSS-pen/strep/ampho.
    2. Trim væv stykker med en frisk steril skalpel (figur 1). Konsultere en patolog, i tilfælde af væv identifikation er uklart.
  2. Hakkekød resterende væv i små stykker (ca. 2 × 2 × 2 mm3) ved hjælp af en frisk skalpel med en buet klinge. Overføre væv stykker med steril pincet i væv dissociation rør (for eksempel gentleMACS C rør) fyldt med pre varmede (37 ° C) cellekulturmedium (Dulbecco´s modificeret eagle medium [DMEM] basal medium) ifølge producentens instruktioner.
    Bemærk: Prøv at bruge skalpel som en vuggende værktøj. Klem ikke cellerne for at undgå vævsskader.
  3. Digest/adskille væv stykker ved hjælp af en væv dissociator (ligesom gentleMACS Octo Dissociator) i kombination med tumor dissociation kit for humant væv ved hjælp af programmet "37C_h_TDK_1" efter manufacturer´s instruks.
  4. Der centrifugeres dissociation rør til 1 min på 300 x g ved stuetemperatur (RT).
  5. Der tilsættes 10 mL af pre varmede (37 ° C) DMEM suppleret med 0,5% føtal bovint serum (FBS) (DMEM-lav) til hvert rør ved hjælp af en serologisk pipette og filtrere cellesuspension ved hjælp af en celle si (100 µm porestørrelse) på toppen af en 50 mL centrifugeglas af pipettering cellen suspension på toppen af filteret.
  6. Tilsættes 10 mL af DMEM-lav igen til hver MACS-tube med serologisk pipette og overføre resterende celler til celle si oven på 50 mL-centrifugerør.
  7. Vask celle si engang med en yderligere 10 mL af DMEM-lav medium ved hjælp af en serologisk pipette.
  8. Centrifugeres cellesuspension i 7 min. ved 300 x g på RT og kassér supernatanten.
  9. Resuspend celler i 5 mL af pre varmede endotel basal medium (EBM) -2-mikrovaskulære (MV) medium (Lonza) suppleret med pen/strep/ampho i den samme 50 mL-centrifugerør.
  10. Plade cellesuspension i en T-25 celle kultur kolbe overfladebelagt natten med 1,5% gelatine-fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved 37 ° C med 5% CO2.
  11. Inkuber celler i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2, vaske cellerne to gange omhyggeligt med ca. 5 mL PBS, og der tilsættes 5 mL frisk medium.
  12. Dyrke celler ved 37 ° C og 5% CO2 indtil 80-90% confluency (normalt 5-7 dage) med 48 h intervaller af medium fornyelse.

3. FACS-sortering i Endothelial Cells

Bemærk: Prøv at undgå at miste celler på ethvert tidspunkt, fx ved at begrænse den farvning procedure til inkubation af celler i et enkelt reagens rør.

  1. Frigør celler med 1 mL af accutase (ca. 10 min.), og der tilsættes 4 mL af pre varmede (37 ° C) EBM-2-MV medium.
  2. Bestemme celletal ved hjælp af en automatiseret celle tælle enhed (range 10-25 µm).
  3. Centrifugeres cellesuspension i 4 min. med 250 x g på RT og kassér supernatanten.
  4. Resuspend celler i pre varmede FACS-buffer (1 x PBS, 2,5% bovint serumalbumin [BSA], 5 mM EDTA pH 8,0, 10 µM Y-27632) Ifølge celletal (5 x 106/mL).
  5. Tilføje FACS-farvning antistoffer efter cellevolumen count/FACS-buffer: CD31-FITC (100 µL/mL = 1/10), CD144/vaskulære endotel (VE) - cadherin - PE (100 µL/mL = 1/10), CD105-APC (25 µL/mL = 1/40), blandes og inkuberes i 7 min. ved RT beskyttet mod lys; forsigtigt svip og inkuberes i en anden 8 min (for en total inkubationstiden 15 min).
  6. Tilsættes 2 mL af FACS-buffer til mærket cellesuspension ved hjælp af en serologisk pipette.
  7. Der centrifugeres i 4 min. med 250 x g på RT og kassér supernatanten.
  8. Vaskes to gange ved tilsætning af 2 mL af FACS-buffer, og foretage en efterfølgende centrifugering i 4 min ved 250 x g på RT og kassér supernatanten.
  9. Resuspend celler i 500 µL af pre varmede EBM-2-MV-pen/strep/ampho og overførsel celler til FACS-sortering instrument.
    1. Endotelceller vil hurtigt dør under sorterings processen hvis FACS-instrument er afkølet. Derfor foretager sortering i endothelial celler på RT og straks overføre de indsamlede celler til 37 ° C inkubator bagefter.
      Bemærk: FACS-instrumentet er normalt usterile!
  10. Sortering/indsamle triple-positive celler direkte i en celle kultur parabol (f.eks. 24-godt plade overfladebelagt natten med 1,5% gelatine-PBS) fyldt med 0,5 mL af pre varmede frisk medium (EBM-2-MV-pen/strep/ampho).
    Bemærk: Kontroller cellesuspension efter sortering ved hjælp af et mikroskop. Hvis cellerne klynge sammen, prøve at få en selv celle distribution i celle kultur fad ved at blande dem langsomt eller tilføje medium.
  11. Dyrke celler indtil 90-100% confluency med 48 h intervaller af medium fornyelse og udvide cellerne til den ønskede kultur parabol størrelse (24-godt plade → 12 nå-plade → 3,5 cm parabol → T-25 → T-75).

4. høst og karakterisering af ren Endothelial Cells

  1. Høste celler på 90-100% confluency og karakteriserer dem ved en passende metode (f.eks. FACS, cytochemistry, kvantitativ Polymerasekædereaktionen (qPCR) eller endotel celle funktion assays7,8).
  2. Analysere isolerede celler med uanset hvilken karakterisering metode er valgt.

Representative Results

Isolering af NEC og TEC fra menneskelige CRC ved en kombineret mekanisk/enzymatical væv dissociation, efterfulgt af efterfølgende CD31/CD105/VE-cadherin-drevet FACS-sortering er beskrevet her (fig. 1A). Denne protokol udgør en forbedret protokol med en reduceret tidsvindue indtil den første høst af ren, levedygtig endotelceller i forhold til den tidligere Mac-baseret protokol7.

NEC og TEC blev isoleret fra menneskelige CRC ved hjælp af følgende trin: (1) generation af en enkelt cellesuspension af kombinerede mekaniske og enzymatiske væv dissociation og væksten af disse celler til 80-90% confluency (figur 1), (2) triple mærkning af EF af CD31/CD105/VE-cadherin fluorokrom-kombineret antistoffer, og (3) FACS-sortering af de respektive triple-positive celler (fig. 2A). Af note, et afgørende skridt til succes af proceduren isolation og levedygtighed af cellerne er at hurtigt forbehold kirurgi modellen isolation procedure (generation af enkelt cellesuspension < 1 time efter resektion). Ved hjælp af FACS-sortering, en middelværdi på 12.500 TEC (n = 12) og 17,800 NEC (n = 12, figur 2B, venstre) repræsenterer et gennemsnit på 3,6 og 5,6% af befolkningens samlede celle (figur 2B, højre) kunne isoleres. Efterfølgende blev cellerne udvidet op til T-75 (betegnes passage 1) og enten fanget eller yderligere forarbejdet til analyse. Af note, ved hjælp af den tidligere Mac-baseret protokol, en gennemsnitlig isolering succes på 49,6% blev opnået (n = 58 ren TECs fra n = 117 patienter8) med ren EF kulturer tilgængelige i gennemsnit 6 uger efter operationen. Ved hjælp af den nye FACS-baseret protokol beskrevet her, var de første rene EF kulturer fremstillet i gennemsnit 3 uger efter operationen med en isolation succesrate på 62.1% (n = 41 ren EF kulturer fra n = 66 enkelt celler suspensioner underkastes FACS-sortering). Derfor, en stigning på isolation sats med 12,5% blev opnået parallelt med et fald i dyrkningen tid fra 6 til 3 uger. Denne reduktion af dyrkning tid ført til forbedrede cellernes levedygtighed og forlænget levetid ledsaget af mindre eksponering til induktion af potentielle kultur-afhængige artefakter af de etablerede kulturer.

Karakterisering af EF renhed blev foretaget først af CD31-cytochemistry (fig. 3A). Hvis kulturerne var blottet for CD31-negative celler (fig. 3A, TEC og NEC), blev de udsat for en mere detaljeret celle at skrive ved reverse transkription kvantitative polymerase kæde reaktion (RT-qPCR) (fig. 3B). Celletype specifikke primere for EF (CD31, CD105, VE-cadherin og von Willebrands faktor [vWF]), leukocytter (CD45), epitelceller (cytokeratin [CK] -20) og glat muskel celler/fibroblaster (desmin) blev brugt (fig. 3B). Ved hjælp af denne qPCR-baserede celle maskinskrivning, en potentiel forurening af EF kulturer af andre celler i rækken af 0,1 - 2%, afhængigt af hvilken celle kan blive opdaget8.

Især, rapporteret vi tidligere en præferentiel tab af vWF protein udtryk i TEF kulturer i forhold til deres tilsvarende NEC kulturer7. Disse resultater kunne bekræftes med den nyetablerede isolation protokol (figur 3C, mener Ct tab NEC-TEC = 0.687, p = 0.173, parret t-test). Kulturer med held passerer disse kvalitetskontroller blev testet for mycoplasma infektion og efterfølgende anvendes til yderligere forsøg.

Figure 1
Figur 1 : Pure endothelial celler kan isoleres fra menneskers normale kolon og CRC af FACS-sortering. (A) flowdiagram af de afgørende trin i EF isoleret proces. (B) fedtvæv (gul), andre ikke-tumorous, eller potentielt nekrotisk væv dele (brun) blev fjernet fra kirurgi prøvemateriale (venstre og midterste panel) og tumor blev opløst i tern 2-3 mm side længde før væv dissociation ( højre panel). (C) den enkelte celle suspension hentet efter væv dissociation (venstre panel) var inkuberes i 24 timer i celle kultur retter. Efterfølgende, ikke-tilhænger celler blev fjernet ved skånsom vask ved hjælp af PBS (midterste panel) og cellerne blev dyrket til 80-90% confluency før FACS-sortering (højre panel). Billeder af den nederste panel (C) blev overtaget af fase kontrast mikroskopi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Gennemsnitligt 3,6-5,6% af enkelt cellesuspension isoleret fra menneskelige CRC patienter og sorteret efter FACS var triple-positive EC. (A) NEC og TEC var FACS-sorteret ved hjælp af en tredobbelt mærkning af celler med anti-CD31, - CD105 og -VE-cadherin antistoffer. (B) en middelværdi på 12.500 TECs (n = 12) og 17,800 NECs (n = 12) kan isoleres fra menneskers normale colon eller CRC ved hjælp af FACS-sortering (CD31, CD105 og VE-cadherin-positive celler, venstre panel), som udgør i gennemsnit 3,6 og 5,6% (højre panel) af cellen total befolkning ansat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : NEC og TEC fra menneskelige CRC express typisk endotel celle markører. Normal kolon endotelceller (NEC, n = 10) og tumor endotelceller (TEF, n = 10) fra menneskelige CRC er CD31 (EF markør)-, CD105 (EF markør)-, VE-cadherin (EF markør)-, vWF (EF markør) - positive og CK20 (CRC celle markør)-, desmin (fibroblast/SMC markør)-, CD45 ( leukocyt markør)-negative som fastsat af (A) CD31-immuncytokemi (positive celler = rød) og (B) RT-qPCR (datapunkter under den stiplede linje er prøver opdaget for at være negativ). (C) vWF udtryk som fastsat af RT-qPCR for tilsvarende TEC/NEC prøver fra de samme patienter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Hovedsagelig, har tre forskellige metoder været ansat med hidtil at isolere ren og levedygtige NECs og TECs fra humane solid væv, nemlig (1) immunomagnetic berigelse, (2) laser microdissection, og (3) FACS-sortering af EF brøkdel. I de fleste publikationer var immunomagnetic berigelse af celler efter generation af en enkelt cellesuspension af mekanisk disintegration brugte11,12,13. For eksempel, immunomagnetic rensning af human dermal mikrovaskulære EF (HDMEC) af E-selectin antistoffer efter tumornekrosefaktor (TNF)-α behandling fra neonatal foreskins13 er blevet rapporteret til isolering af menneskelige EF fra gliom af væv fordøje, percoll forløb, og markeringen ved hjælp af anti-CD31/CD105 og VE-cadherin-antistoffer12, eller af anti-CD105 antistoffer fra humane bryst karcinom11. Protokoller, der beskæftigede laser microdissection eller FACS-sortering er mindre hyppigt rapporteret. Laser microdissection blev brugt, for eksempel, for at identificere potentielle pan-tumor endotel celle markører (tering) i EF stammer fra menneskelige colorectal karcinom med analyse af cellerne umiddelbart efter dissektion9. FACS-sortering ved hjælp af anti-CD31-antistoffer blev med succes demonstreret til isolering af EF brøkdel fra udifferentierede menneskelige embryonale stamceller-celler14.

Disse metoder har forskellige fordele og ulemper, der skal overvejes. Fordele for den immunomagnetic-baseret tilgang er at ingen omfattende udstyr er påkrævet, udvælgelse kan foretages nogen tid, og celle berigelse er hurtig (ca. 15 min.) i forhold til FACS-sortering (ca. 1 h). Manglen på matrix i en længere periode kan fremkalde celledød i EF af anoikis. Derfor, tilsætning af rho kinase inhibitor Y-27632 til FACS buffer var ansat til at forhindre cell anoikis15.

Ulemperne ved immunomagnetic berigelse er, at flere runder af udvælgelse er nødvendig for at opnå renhed over 99%. Desuden, celle dyrkning mellem enrichments er nødvendige for celle opsving, hvilket øger alder kulturer støtte kultur-induceret artefakter. Laser microdissection har den fordel, at celler kan blive anvendt straks, som reducerer kultur-induceret artefakter men indeholder risikoen for kontaminering af celler fra tilstødende væv områder10. Desuden microdissection ikke er etableret i hvert laboratorium. Ulemperne ved metoden FACS-sortering-baserede omfatter, ligner laser microdissection, at udstyr er omfattende og omkostningskrævende. I overensstemmelse hermed, må dette udstyr ikke være tilgængelige når som helst. I en klinisk indstilling, hvor tilgængeligheden af væv af interesse ikke kan være præcis planlagt, kan det tilføje en yderligere ulempe.

De store fordele ved FACS-sortering er dog at EF brøkdel kan mærkes af flere antistoffer parallelt. Således, en strengere gating strategi kan være ansat som vil sikre en høj renhed. Baseret på erfaring, var ingen re sortering af EF brøkdel påkrævet, i modsætning til den foregående Mac-baseret protokol, hvor flere runder af udvalg skulle være ansat. Dette førte til et betydeligt reduceret dyrkningen tid indtil renhed fra seks uger (MACS tilgang) til tre uger i FACS tilgang, hvilket resulterer i en forbedret cellernes levedygtighed muliggør en langvarig tidsvindue for analyse. Endelig bruger den FACS-sortering-baseret strategi, en forbedring af den samlede isolation succesrate kunne være opnået (stigning på 12,5%). Afslutningsvis baseret FACS-sortering strategi beskæftiger 3 antistoffer parallelt efter væv digest af kombinerede mekaniske og enzymatiske væv fordøjelsen havde mange fordele, der etableret denne protokol som den foretrukne metode til isolering af TECs og NECs fra menneskelige colorectal karcinom og kolon.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker Christian Flierl, Katja Petter, Christina Schnürer (alle Division af molekylære og eksperimentel kirurgi), Uwe Appelt, Michael Mroz (Core enhed FACS-sortering) og Simon Völkl (Core enhed FACS-Immunomonitoring) for fremragende teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af tilskud til EN/MS af interdisciplinære Center for klinisk forskning (IZKF) af University Medical Center Erlangen, tysk Research Foundation (DFG: FOR 2438, SP2) og Lutz-Stiftung, af et tilskud af Robert-Pfleger-Stiftung VSS samt tilskud til MS fra tyske Research Foundation [DFG: KFO257 (delprojekt 4), SFB 796 (delprojekt B9)].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS 1x Gibco by Life Technologies 14175-053
Penicillin-streptomycin Gibco by Life Technologies 15140-122
amphotericin B Gibco by Life Technologies 15290-026
Scalpels, disposable Feather No. 23
gentleMACS octo dissociator Miltenyi Biotec 130-095-937
gentleMACS C-tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
human tumor dissociation kit Miltenyi Biotec 130-095-929
DMEM Gibco by Life Technologies 21969-035
EGM-2-MV BulletKit Lonza CC-3202
Cell strainer, 100 µm Falcon 352360
StemPro Accutase  Gibco by Life Technologies A11105-01
Cell counter, automated Coulter Counter Z1
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503
CD31-FITC BD Pharmingen 555445
CD144/VE-cadherin-PE BD Pharmingen 560410
CD105-APC BD Pharmingen 562408
gelatin from bovine skin Sigma-Aldrich G9391
FACS-Sorting device Beckman Coulter MoFlo XDP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).
  2. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  3. Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
  4. McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat Med. 9 (6), 713-725 (2003).
  5. Hurwitz, H., et al. Bevacizumab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin for metastatic colorectal cancer. N Engl J Med. 350 (23), 2335-2342 (2004).
  6. Naschberger, E., Schellerer, V. S., Rau, T. T., Croner, R. S., Stürzl, M. Isolation of endothelial cells from human tumors. Methods Mol Biol. 731, 209-218 (2011).
  7. Schellerer, V. S., et al. Endothelial cells of human colorectal cancer and healthy colon reveal phenotypic differences in culture. Lab Invest. 87 (11), 1159-1170 (2007).
  8. Naschberger, E., et al. Matricellular protein SPARCL1 regulates tumor microenvironment-dependent endothelial cell heterogeneity in colorectal carcinoma. J Clin Invest. 126 (11), 4187-4204 (2016).
  9. St Croix, B., et al. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).
  10. Christian, S., et al. Endosialin (Tem1) is a marker of tumor-associated myofibroblasts and tumor vessel-associated mural cells. Am J Pathol. 172 (2), 486-494 (2008).
  11. Grange, C., et al. Isolation and characterization of human breast tumor-derived endothelial cells. Oncol Rep. 15 (2), 381-386 (2006).
  12. Miebach, S., et al. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades. J Neurooncol. 76 (1), 39-48 (2006).
  13. Richard, L., Velasco, P., Detmar, M. A simple immunomagnetic protocol for the selective isolation and long-term culture of human dermal microvascular endothelial cells. Exp Cell Res. 240 (1), 1-6 (1998).
  14. Nourse, M. B., et al. VEGF induces differentiation of functional endothelium from human embryonic stem cells: implications for tissue engineering. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (1), 80-89 (2010).
  15. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).

Tags

Kræftforskning spørgsmål 134 endotelceller fartøj Colorectal karcinom Tumor Normal kolon CD31 VE-cadherin CD105 FACS-sortering væv Dissociation Tumor mikromiljø fibroblaster
Isolering af menneskelige endotelceller fra normale kolon og Colorectal karcinom - en forbedret protokol
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Naschberger, E., Regensburger, D.,… More

Naschberger, E., Regensburger, D., Tenkerian, C., Langheinrich, M., Engel, F. B., Geppert, C., Hartmann, A., Grützmann, R., Schellerer, V. S., Stürzl, M. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol. J. Vis. Exp. (134), e57400, doi:10.3791/57400 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter