Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

عزل الخلايا البطانية البشرية من القولون العادي وسرطان القولون والمستقيم-وضع بروتوكول تحسين

Published: April 4, 2018 doi: 10.3791/57400
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 4, 4, 2, *2, *1
1Division of Molecular and Experimental Surgery, Department of Surgery, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Surgery, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 3Division of Nephropathology, Department of Pathology, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 4Department of Pathology, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg
* These authors contributed equally

Summary

ورم خلايا بطانية هي محددات هامة لورم المكروية ومسار المرض. ويرد هنا، بروتوكولا لعزل خلايا بطانية نقية وقابلة للحياة من الإنسان من سرطان القولون والمستقيم والقولون العادي لاستخدامها في بحوث المخدرات اختبار والمرضية.

Abstract

الخلايا الأولية المعزولة من السرطانات البشرية أدوات قيمة لتحديد الآليات المسببة للأمراض التي تسهم في التنمية المرض والتقدم. على وجه الخصوص، خلايا بطانية (الجماعة الأوروبية) التي تشكل السطح الداخلي للسفن، مباشرة المشاركة في إيصال الأكسجين، والإمداد بالمواد الغذائية وإزالة النفايات، ومن الأورام، ومما شكل بارز يشارك في الدستور للورم المكروية (TME). ورم خلايا بطانية (تيكس) يمكن استخدامها كأجهزة استشعار العوامل البيولوجية الخلوية من المكروية intratumoral أنشأتها الاتصالات بين الورم والخلايا اللحمية. تيكس أيضا بمثابة أهداف للعلاج. تبعاً لذلك، تسمح هذه الخلايا في ثقافة الدراسات على آليات الاستجابة أو مقاومة للعلاج المضادة-الأوعية. في الآونة الأخيرة، وجد أن تيكس معزولة عن البشرية سرطان القولون (CRC) معرض الذاكرة مثل الآثار استناداً إلى TME محددة أنها مستمدة من. علاوة على ذلك، تيكس هذه المساهمة بنشاط في إنشاء TME محددة بإفراز عوامل مختلفة. على سبيل المثال، تيكس في مواتي إنذاريا Th1-TME تفرز البروتين عامل الورم القمعية يفرز الأوعية المضادة، الحمضية والغنية في 1 مثل السيستين (SPARCL1). ينظم التوازن السفينة SPARCL1 ويحول دون انتشار الخلايا السرطانية والهجرة. ومن ثم فثقافات تيكس نقية وقابلة للبقاء معزولة عن الأورام الصلبة البشرية أداة قيمة للدراسات الفنية بشأن دور نظام الأوعية الدموية في توموريجينيسيس. ويرد هنا، أحدث بروتوكول جديد لعزل المفوضية الأوروبية الأولية من القولون العادي، فضلا عن اتفاقية حقوق الطفل. الأسلوب الذي يستند إلى هضم الأنسجة الميكانيكية والانزيميه، إيمونولابيلينج، والأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)-فرز الخلايا إيجابية الثلاثي (CD31، هاء-كادهيرين، CD105). مع هذا البروتوكول، يمكن أن تكون التكنلوجيا قابلة للتطبيق أو الثقافات الخلية غشائي عادي (NEC) المعزولة من أنسجة القولون مع معدل نجاح 62.12 في المائة عند تعرضه للفرز من نظام مراقبة الأصول الميدانية (الثقافات الأوروبية البحتة 41 من عينات الأنسجة 66). وبناء على ذلك، يوفر هذا البروتوكول نهجاً قويا لعزل الثقافات الإنسانية من المفوضية الأوروبية من القولون العادي واتفاقية حقوق الطفل.

Introduction

وورم المكروية (TME) يعرف تفاعل وثيق بين الخلايا السرطانية مع ستروما الورم، التي تتألف من الخلايا مثل خلايا بطانية (EC) بيريسيتيس، والخلايا الليفية، وخلايا العضلات الملساء أو الخلايا المناعية. الاتصال بين هذه المكونات الخلوية يمكن أن تكون مدفوعة بعوامل paracrine (مثل عوامل النمو الأوعية، السيتوكينات)، المصفوفة خارج الخلية، أو الاتصال المباشر خلية خلية. حجرة stromal قد تعزز أو مواجهة بدء الورم أو التدرج، اعتماداً على TME محددة المنشأة.

قدرة الورم على الاتصال مع نظام السفينة مفتاح التقدم وورم خبيث من هذا المرض. ويتيح هذا النظام السفينة الورم في الغالب للوصول إلى إيصال الأوكسجين والمواد الغذائية، فضلا عن إزالة النفايات1،،من23. المفوضية الأوروبية تشكل السطح الداخلي للسفن، ولذلك المكونات الخلوية الهامة التي تشارك بنشاط في هذه العملية. فمن المعروف جيدا أن ورم خلايا بطانية (TEC) مختلفة للخلايا المناظرة لها عادي غشائي (NEC) بالعديد من الميزات مثل اضطراب التسلسل الهرمي شجرة الأوعية الدموية، يجتازها السفينة، أو تخفيض نضوج المتمثلة في تخفيض عدد خلايا بيريسيتيس/الجدارية المرفقة فقط فضفاضة ب الجماعة الأوروبية4.

ومن ثم تيكس أدوات الخلوية قيمة لدراسة التسرطن. واعتبرت تيكس أساسا لتعزيز نمو وتطور الورم3. وهكذا، يمكن استخدام تيكس كأجهزة استشعار العوامل البيولوجية التي تسمح برصد وتحديد العمليات المسببة للمرض التي بدء أو تشجيع أو مواجهة tumorigenesis. وعلاوة على ذلك، فهي الأهداف العلاجية في العيادة5. التالي، تيكس معزولة ونيكس المقابلة أيضا يمكن استعمالها كأدوات لفهم آليات الاستجابة أو مقاومة للعلاج المضادة-الأوعية.

في الماضي، وضعت بروتوكولا لعزل هذه الخلايا6،7 ، وحددت أن تيكس لا تختلف عن نيكس فقط، ولكن أيضا تختلف عن بعضها البعض حسب TME أنها مستمدة من8. من خلال هذا النهج، يتضح أن تيكس في بعض تميس يمكن التصدي بنشاط نمو الورم والتدرج من إفراز البروتينات المضادة-الأوعية الورم القمعية مثل SPARCL1. وأشار هذا إلى أن تيكس تسهم بنشاط في إنشاء TME إنذاريا مواتية في سرطان القولون والمستقيم البشرية (CRC)8.

الدراسات السابقة التي حاولت عزل تيكس البشرية من الأورام الصلبة. كان هدفا هاما لهذه الدراسات، مثلاً، تحديد هوية جديدة ورم الخلايا غشائي علامات (تيمس)9. وضع استراتيجية للاستخدام الفوري من تيكس بعد تم تطبيق ميكروديسيكشن الليزر لتجنب تغيير أو فقدان النمط الظاهري المجلس التنفيذي الانتقالي في الثقافة. ومع ذلك، حددت دراسات المتابعة سكان تلويث الخلايا الجدارية كعيب خطير من هذا النهج10. وكان لدينا مختبر الأول من وضع بروتوكول يسمح بعزل تيكس نقية وقابلة للبقاء من المرضى CRC البشرية6،7. واختير نهج مع الخلية المغناطيسي التحديد (ماك) جولات متعددة من تيكس تكفل درجة نقاء عالية للثقافات الأوروبية معزولة. بيد أن هذا النهج يتطلب فترة طويلة نسبيا زراعة (6 أسابيع في المتوسط)، مما زاد من خطر الآثار الناجمة عن الثقافة. ومن ثم، في الخطوة القادمة، يهدف إلى تقليل وقت زراعة بين الجراحة وحصاد الثقافة النقية الأولى. لتحقيق هذا الهدف، بروتوكولا تحسين توظيف تفكك نسيج الميكانيكية والانزيميه على أساس الجمع بين الورم الأولى، تليها fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)-الفرز من المفوضية الأوروبية المسماة ثلاثية، وقد وضعت. خفض هذا الوقت العزلة في المتوسط إلى ثلاثة أسابيع، أسفر عن الثقافات المجلس التنفيذي الانتقالي واللجنة الانتخابية الوطنية الصرفة مع إمكانية زيادة للدراسات الفنية. عزل نقية الثقافات المجلس التنفيذي الانتقالي واللجنة الانتخابية الوطنية قادرة على البقاء من الأنسجة البشرية مع معدلات نجاح عالية قد فتح آفاقاً جديدة لاختبار أثناء تطوير نظم العلاج الفردي العقاقير الخاصة بالمريض. نهج العزل بالتفصيل في الفقرات التالية.

Protocol

عملية عزل وافقت عليه لجنة الأخلاقيات المحلية التابعة "جامعة ارلنجن مركز طبي" (159_15 # ب، دراسة توميك). كانت معايير الاشتمال المريض كما يلي: اتفاقية حقوق الطفل، ويخمّن المرحلة-رابعا، لا تاريخ لمرض التهاب الأمعاء، وأي علاج نيوادجوفانت.

1-الجراحة وإعداد الأنسجة لعزل خلية مفردة

  1. الحصول على العينة عن طريق الجراحة من مريض CRC (سرطان الأنسجة > 0.5 ز، والورم غير نخرية المركزية؛ وأنسجة القولون طبيعية > 10 سم بعيداً عن موقع الورم).
  2. قطع الأنسجة التي تم الحصول عليها في معظمها < 1 ز لسرطان، لكن > ز 1 للقولون العادي. إذا كانت القطع > الحصول ز 1، تقسيمها إلى أجزاء 1 ز متعددة باستخدام مشرط جديدة للاستمرار في معالجة الأنسجة.
    ملاحظة: إذا كان قطعة نسيج الورم أقل من 0.5 غ من البداية، العزل عادة يفشل.
  3. يعكسها الطازجة جمع قطع الأنسجة باستخدام الملقط العقيمة في 40 مل جليد الباردة هانكس متوازنة الحل الملح (حبس) تستكمل مع البنسلين/ستربتوميسين/أمفوثيريسين ب (1% حبس-القلم/بكتيريا/أمفو) في أنابيب الطرد المركزي 50 مل ونقلها بسرعة مختبر.
    ملاحظة: أنسجة القولون كثيرا جداً ملوثة بالبكتيريا/الفطريات من البداية. أثناء الإجراء بأكمله من العزلة، يجب إضافة القلم/بكتيريا/أمفو إلى جميع الحلول من أجل القضاء على الكائنات الحية تلويث.
  4. تغسل كل قطعة النسيج 4 مرات على الأقل مع 40 مل الجليد الباردة حبس-القلم/بكتيريا/أمفو (راجع الخطوة 1.3) في أنابيب الطرد المركزي 50 مل بنقل قطع الأنسجة تسلسلياً من أنبوب أحد أجهزة الطرد المركزي للأنبوب القادم استخدام الملقط العقيمة.
    1. ملقط نظيف بعد كل خطوة مع الإيثانول 70%.
    2. استخدام الملقط منفصلة لسرطان وقطع أنسجة القولون العادي.
    3. وزن كل قطعة النسيج.
      ملاحظة: لا تضع قطع الأنسجة مباشرة على نطاق لوزنها. بعد الغسيل، تزن أنبوب الطرد المركزي الأخيرة التي تحتوي على الأنسجة قبل وبعد دخول قطع الأنسجة. حساب وزن قطع الأنسجة الفردية بالطرح.

2-جيل تعليق خلية مفردة

ملاحظة: من المستحسن إبقاء الأنسجة رطبة في جميع الأوقات.

  1. إذا كانت موجودة, إزالة الدهون المرفقة أو أنسجة أخرى غير توموروس أو أجزاء النسيج المتنخر يحتمل أن تكون من العينة جراحة بنقل قطع الأنسجة في طبق بتري ثقافة عقيمة خلية استخدام الملقط المعقم.
    1. إبقاء قطع الأنسجة رطبة في جميع الأوقات بإضافة 3-5 مل من حبس-القلم/بكتيريا/أمفو.
    2. تقليم قطع الأنسجة باستخدام مشرط معقم طازجة (الشكل 1). استشر أخصائي في حالة تحديد الأنسجة غير واضح.
  2. فرم الأنسجة المتبقية إلى قطع صغيرة (حوالي 2 × 2 × 2 مم3) استخدام مشرط جديد مع شفرة منحنية. نقل قطع الأنسجة مع الملقط العقيمة في أنابيب تفكك النسيج (على سبيل المثال، جينتليماكس ج أنابيب) قبل مليئة بحرارة مسبقاً (37 درجة مئوية) خلية الثقافة المتوسطة (Dulbecco´s تعديل النسر متوسطة [دميم] القاعدية المتوسطة) وفقا للشركة المصنعة تعليمات.
    ملاحظة: حاول استخدام المبضع مثل أداة هزاز. لا الضغط الخلايا تفاديا لتلف الأنسجة.
  3. خلاصة/ينأى الأنسجة القطع باستخدام ديسوسياتور أنسجة (مثل جينتليماكس ديسوسياتور Octo) في تركيبة مع عدة تفارق الورم للأنسجة البشرية باستخدام الإرشادات التي تظهر في برنامج "37C_h_TDK_1" بعد manufacturer´s.
  4. الطرد المركزي أنابيب الانفصال لمدة 1 دقيقة على 300 غرام x في درجة حرارة الغرفة (RT).
  5. أضف 10 مل من قبل حرارة (37 درجة مئوية) دميم وتستكمل مع 0.5% مصل بقرى الجنين (FBS) (دميم-منخفض) لكل أنبوبة ماصة مصلية استخدام وتصفية تعليق خلية باستخدام مصفاة خلية (حجم المسام 100 ميكرومتر) على رأس أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي التي بيبيتينج الخلية تعليق على رأس عامل التصفية.
  6. إضافة 10 مل منخفضة ودميم مرة أخرى إلى كل أجهزة ماكينتوش-الأنبوبة ماصة مصلية ونقل الخلايا المتبقية إلى مصفاة الخلية على رأس أنبوب 50 مل أجهزة الطرد المركزي.
  7. أغسل مصفاة الخلية مرة واحدة مع 10 مل إضافية من دميم-منخفض متوسط استخدام ماصة مصلية.
  8. الطرد المركزي من تعليق خلية لمدة دقيقة 7 في 300 غرام x في الرايت وتجاهل المادة طافية.
  9. ريسوسبيند الخلايا في 5 مل من قبل حرارة متوسطة القاعدية غشائي (EBM)-2-ميكروفاسكولار (MV) متوسطة (Lonza) وتستكمل مع القلم/بكتيريا/أمفو في أنبوب 50 مل الطرد المركزي نفسه.
  10. لوحة تعليق خلية في قارورة ثقافة خلية T-25 قبل المغلفة بين عشية وضحاها مع 1.5% فوسفات الجيلاتين مخزنة المالحة (PBS) عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
  11. احتضان خلايا عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5% CO2وغسل الخلايا مرتين بعناية مع حوالي 5 مل من برنامج تلفزيوني، وإضافة 5 مل متوسطة جديدة.
  12. زراعة الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 حتى كونفلوينسي 80-90 ٪ (عادة 5-7 أيام) مع فترات ح 48 من تجديد المتوسطة.

3-نظام مراقبة الأصول الميدانية-فرز الخلايا غشائي

ملاحظة: في محاولة لتجنب فقدان الخلايا في أي لحظة، مثلاً عن طريق الحد من الإجراء المصبوغة للحضانة للخلايا في أنبوب كاشف واحد.

  1. فصل الخلايا مع 1 مل أككوتاسي (حوالي 10 دقائق)، ثم إضافة 4 مل متوسطة EBM-2-MV المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية).
  2. تحديد عدد الخلايا باستخدام خلية الآلي عد الجهاز (مجموعة 10-25 ميكرومتر).
  3. الطرد المركزي من تعليق خلية لمدة 4 دقيقة مع 250 غرام x في الرايت وتجاهل المادة طافية.
  4. ريسوسبيند الخلايا في حرارة قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية-المخزن المؤقت (س 1 برنامج تلفزيوني، 2.5% البقري الزلال [جيش صرب البوسنة]، 5 ملم يدتا pH 8.0، 10 ميكرون Y-27632) وفقا لعدد الخلايا (5 × 106/mL).
  5. إضافة الأجسام المضادة تلطيخ نظام مراقبة الأصول الميدانية وفقا لحجم الخلية العد/نظام مراقبة الأصول الميدانية-المخزن المؤقت: CD31-فيتك (100 ميليلتر/مل = 1/10)، CD144/الأوعية الدموية غشائي (هاء)-كادهيرين-PE (100 ميليلتر/مل = 1/10)، CD105--آسيا والمحيط الهادئ (25 ميليلتر/مل = 1/40)، مزيج، واحتضان لمدة 7 دقائق في الرايت محمية من الضوء؛ بلطف ونفض الغبار احتضانها لآخر 8 دقيقة (لفترة احتضان الكامل لمدة 15 دقيقة).
  6. إضافة 2 مل من نظام مراقبة الأصول الميدانية-المخزن المؤقت إلى تعليق خلية مسماة استخدام ماصة مصلية.
  7. الطرد المركزي لمدة دقيقة 4 مع 250 غرام x في الرايت وتجاهل المادة طافية.
  8. تغسل مرتين بإضافة 2 مل من نظام مراقبة الأصول الميدانية-المخزن المؤقت، وإجراء الطرد المركزي لاحقة لدقيقة 4 في 250 g x في الرايت وتجاهل المادة طافية.
  9. ريسوسبيند الخلايا في 500 ميليلتر من قبل حرارة EBM-2-أم-القلم/بكتيريا/أمفو ونقل الخلايا إلى أداة الفرز نظام مراقبة الأصول الميدانية.
    1. خلايا بطانية سيموت بسرعة أثناء عملية الفرز إذا كان يتم تبريد نظام مراقبة الأصول الميدانية-الصك. ولذلك، القيام بفرز الخلايا البطانية في الرايت ونقل الخلايا المجمعة فورا إلى الحاضنة 37 درجة مئوية وبعد ذلك.
      ملاحظة: نظام مراقبة الأصول الميدانية-الصك عادة غير معقمة!
  10. فرز/جمع الثلاثي-إيجابية الخلايا مباشرة في خلية ثقافة طبق (مثلاً، لوحة 24-جيدا قبل المغلفة بين عشية وضحاها مع الجيلاتين 1.5%-برنامج تلفزيوني) مليئة 0.5 مل من قبل حرارة متوسطة جديدة (EBM-2-أم-القلم/بكتيريا/أمفو).
    ملاحظة: التحقق من تعليق خلية بعد الفرز باستخدام مجهر. إذا كانت الخلايا العنقودية معا، حاول الحصول على توزيع خلية حتى في الطبق ثقافة الخلية بخلطها ببطء أو إضافة المتوسطة.
  11. زراعة الخلايا حتى كونفلوينسي 90-100% مع فترات ح 48 من تجديد المتوسطة وتوسيع نطاق الخلايا إلى حجم صحن الثقافة المرجوة (← 12 لوحة 24-جيدا ← جيدا-طبق طبق 3.5 سم ← ← T-25 T-75).

4-الحصاد وتوصيف لخلايا بطانية نقية

  1. حصاد الخلايا في كونفلوينسي 90-100% وتوصيفها بطريقة مناسبة (مثل نظام مراقبة الأصول الميدانية، سيتوتشيميستري، الكمية البلمرة المتسلسل (qPCR)، أو الخلية البطانية الدالة فحوصات7،8).
  2. تحليل الخلايا المعزولة بيتم اختيار أسلوب توصيف أيهما.

Representative Results

يرد وصف لعزل اللجنة الوطنية للانتخابات والمجلس التنفيذي الانتقالي من CRC البشرية قبل تفكك أنسجة الميكانيكية/انزيماتيكال مجتمعة، تليها اللاحقة CD31/CD105/VE كادهيرين يحركها نظام مراقبة الأصول الميدانية-الفرز هنا (الشكل 1أ). يمثل هذا البروتوكول بروتوكولا محسنة مع إطار زمني مخفض حتى موسم الحصاد الأول لخلايا بطانية نقية وقابلة للحياة بالمقارنة مع بروتوكول المستندة إلى أجهزة ماكينتوش السابقة7.

اللجنة الوطنية للانتخابات والمجلس التنفيذي الانتقالي بمعزل عن حقوق الطفل البشري باستخدام الخطوات التالية: (1) جيل تعليق خلية مفردة بتفكك النسيج الميكانيكية والانزيميه مجتمعة ونمو هذه الخلايا إلى 80-90% كونفلوينسي (الشكل 1)، (2) ثلاثة إضعاف وضع العلامات للجماعة الأوروبية CD31/CD105/VE-كادهيرين فلوروتشرومي-إلى جانب الأجسام المضادة، والفرز (3) نظام مراقبة الأصول الميدانية للخلايا إيجابية ثلاثية كل منها (الشكل 2أ). من المذكرة، خطوة حاسمة لنجاح إجراءات العزل والجدوى من الخلايا أن سرعة إخضاع العينة جراحة إجراءات العزل (جيل تعليق خلية مفردة < 1 ساعة بعد بتر). باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية-الفرز، يعني 12,500 المجلس التنفيذي الانتقالي (n = 12) و 17,800 NEC (n = 12، الشكل 2بمن اليسار) تمثل في متوسط 3.6 و 5.6% من الخلية إجمالي السكان (الشكل 2ب، الحق) يمكن أن تكون معزولة. في وقت لاحق، تم توسيع نطاق الخلايا حتى T-75 (يطلق عليها مرور 1) وأما المقطوع أو معالجة أخرى للتحليل. علما، باستخدام بروتوكول المستندة إلى أجهزة ماكينتوش السابقة، تحقق نجاح متوسط عزلة من 49.6 في المائة (n = 58 تيكس نقية من n = 117 المرضى8) مع المفوضية الأوروبية نقية الثقافات المتاحة في المتوسط 6 أسابيع بعد الجراحة. استخدام البروتوكول الجديد القائم على نظام مراقبة الأصول الميدانية الموصوفة هنا، ثقافات EC الصرفة الأولى تم الحصول عليها في المتوسط 3 أسابيع بعد الجراحة مع معدل نجاح عزل 62.1% (n = 41 الثقافات الأوروبية نقية التي تم الحصول عليها من ن = 66 واحد خلايا المعلقات التي تخضع لنظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز). ولذلك، تم تحقيق زيادة معدل العزل بنسبة 12.5 في المائة بالتوازي مع انخفاض الوقت زراعة من 6 إلى 3 أسابيع. هذا الحد من الوقت زراعة أدى إلى بقاء الخلية المحسنة وإطالة مدى الحياة مصحوبا بتعرض أقل لاستحثاث المحتملة المصنوعات اليدوية تعتمد على ثقافة من الثقافات الراسخة.

أجرى توصيف نقاء المفوضية الأوروبية الأولى CD31-سيتوتشيميستري (الشكل 3أ). إذا كانت الثقافات تخلو من الخلايا CD31 سالب (الشكل 3أ، المجلس التنفيذي الانتقالي واللجنة الوطنية للانتخابات)، أنهم تعرضوا لخلية أكثر تفصيلاً كتابة بالنسخ العكسي الكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-قبكر) (الشكل 3ب). استخدمت الإشعال نوع الخلية المحددة للمفوضية الأوروبية (عامل فون ويليبراند، هاء-كادهيرين، CD31 و CD105 [فوف]) والكريات البيضاء (CD45)، والخلايا الظهارية (سيتوكيراتين [كورونا]-20)، وخلايا العضلات الملساء/الليفية (ديسمين) (الشكل 3ب). ويمكن استخدام هذه الخلية على أساس qPCR كتابة، تلوث محتملة للثقافات الأوروبية من الخلايا الأخرى في نطاق 0.1-2%، تبعاً لنوع الخلية، الكشف عن8.

جدير بالذكر أن أبلغنا سابقا خسارة تفضيلية vWF البروتين التعبير في المجلس التنفيذي الانتقالي الثقافات مقارنة بتلك الثقافات NEC المقابلة7. يمكن التأكد من هذه النتائج مع البروتوكول العزل المنشأة حديثا (الشكل 3جيم، يعني فقدان Ct NEC والتكنلوجيا = 0.687، ف = 0.173، إقران اختبار t). اختبار للإصابة بالميكوبلازما الثقافات بنجاح تمرير هذه ضوابط الجودة واستخدامها في وقت لاحق لإجراء المزيد من التجارب.

Figure 1
الشكل 1 : يمكن أن تكون خلايا بطانية نقية معزولة من القولون الطبيعية البشرية ولجنة حقوق الطفل بفرز نظام مراقبة الأصول الميدانية- (أ) الرسم البياني للخطوات الأساسية لعملية عزل المفوضية الأوروبية. (ب) الأنسجة الدهنية (أصفر)، أجزاء غير توموروس الأخرى، أو أجزاء النسيج المتنخر يحتمل أن (براون) أزيلت من العينة جراحة (لوحة الأيمن والأيسر) والورم قد تفككت إلى مكعبات من 2-3 مم طول الجانب قبل (تفكك النسيج اللوحة اليمنى). تعليق (ج) خلية مفردة استردادها بعد تفكك النسيج (اللوحة اليمنى) كان المحتضنة ح 24 في خلية ثقافة الأطباق. وفي وقت لاحق، تم إزالة الخلايا غير ملتصقة بواسطة الغسيل لطيف باستخدام برنامج تلفزيوني (الفريق الأوسط) والخلايا وقد نمت إلى 80-90% كونفلوينسي قبل الفرز نظام مراقبة الأصول الميدانية (اللوحة اليمنى). صور لوحة السفلي (ج) تم الحصول عليها من الطوري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : في متوسط 3.6-5.6% تعليق خلية مفردة معزولة عن البشرية CRC المرضى ومفروزة حسب نظام مراقبة الأصول الميدانية كانت إيجابية الثلاثي الجماعة الأوروبية. (أ) اللجنة الوطنية للانتخابات والمجلس التنفيذي الانتقالي تم فرزها نظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام العلامات ثلاثية الخلايا مع الأجسام المضادة-CD31-CD105 وهاء-كادهيرين. (ب) يعني من تيكس 12,500 (n = 12) ونيكس 17,800 (n = 12) يمكن أن تكون معزولة عن البشرية القولون العادي أو لجنة حقوق الطفل باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية-الفرز (CD31، CD105، وهاء-كادهيرين-إيجابية الخلايا، غادر الفريق)، الذي يمثل في المتوسط 3.6 و 5.6% (اللوحة اليمنى) في خلية الإجمالي السكان العاملين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : اللجنة الوطنية للانتخابات والمجلس التنفيذي الانتقالي من البشرية اتفاقية حقوق الطفل التعبير عن علامات خلية غشائي النموذجية- خلايا بطانية القولون العادي (NEC، n = 10) وورم خلايا بطانية (المجلس التنفيذي الانتقالي، n = 10) من البشرية اتفاقية حقوق الطفل هي CD31 (EC ماركر)-، CD105 (EC ماركر)-، VE-كادهيرين (EC ماركر)-، فوف (EC العلامة)-إيجابية و CK20 (علامة خلية CRC)-، ديسمين (علامة تنتجها الخلايا الليفية/SMC)-، CD45 ( العلامة الكريات البيض)-السلبية كما تحددها (A) CD31-إيمونوسيتوتشيميستري (الخلايا إيجابية = أحمر) و (ب) RT-قبكر (نقاط البيانات خط متقطع من العينات التي تم الكشف عن أن تكون سلبية). (ج) التعبير vWF حسبما يقرره RT-qPCR للمقابلة TEC/NEC عينات من المرضى نفسه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

أساسا، استخدمت ثلاث طرق مختلفة حتى الآن لعزل نيكس وتيكس نقية وقابلة للبقاء من الأنسجة الصلبة البشرية، إلا وهي تخصيب (1) إيمونوماجنيتيك، ميكروديسيكشن (2) ليزر، و (3) الفرز في نظام مراقبة الأصول الميدانية في كسر المفوضية الأوروبية. في معظم المنشورات، تم تخصيب إيمونوماجنيتيك الخلايا بعد جيل تعليق خلية مفردة بالتفكك الميكانيكية المستخدمة11،،من1213. على سبيل المثال، إيمونوماجنيتيك تنقية للبشرية عن طريق الجلد microvascular "المفوضية الأوروبية" (هدميك) بالأجسام المضادة سيليكتين ه بعد عامل نخر الورم (تنف)-سجلت المعاملة α فوريسكينس حديثي الولادة13 لعزل المفوضية الأوروبية البشرية من الدبقي بالانسجة هضم، بركل التدرج، والتحديد باستخدام مكافحة--CD31/CD105 وهاء-كادهيرين-أجسام12، أو بالأجسام المضادة CD105 من البشرية11من سرطان الثدي. البروتوكولات التي تستخدم الليزر ميكروديسيكشن أو الفرز من نظام مراقبة الأصول الميدانية أبلغ أقل تواترا. تم استخدام الليزر ميكروديسيكشن، على سبيل المثال، لتحديد الورم عموم المحتملة علامات خلية غشائي (تيمس) في المفوضية الأوروبية المستمدة من سرطان القولون والمستقيم البشرية مع تحليل للخلايا مباشرة بعد تشريح9. نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز استخدام مكافحة--CD31--الأجسام المضادة بنجاح تجلى لعزل الكسر الجماعة الأوروبية من جنينية غير متمايزة الإنسان الخلايا الجذعية14.

هذه النهج من مختلف المزايا والعيوب التي يتعين النظر فيها. مزايا للنهج القائم على إيمونوماجنيتيك هي أن مطلوب أي معدات متطورة، ويمكن إجراء التحديد أي وقت، وتخصيب خلية سريعة (حوالي 15 دقيقة) بالمقارنة مع نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز (حوالي 1 ح). الافتقار إلى مصفوفة لفترة أطول من الزمن قد حمل موت الخلية في الجماعة الأوروبية التي anoikis. ولذلك، كان يعمل إضافة مثبطات كيناز رو Y-27632 إلى المخزن المؤقت نظام مراقبة الأصول الميدانية لمنع الخلية anoikis15.

أن مساوئ تخصيب إيمونوماجنيتيك أن جولات متعددة التحديد مطلوبة من أجل تحقيق نقاء أعلى من 99%. وعلاوة على ذلك، مطلوب زراعة الخلية بين الإثراء لاسترداد الخلية، مما يزيد من عصر الثقافات دعم الآثار الناجمة عن الثقافة. الليزر ميكروديسيكشن قد الميزة التي يمكن أن تكون الخلايا المستخدمة مباشرة مما يقلل من الآثار الناجمة عن الثقافة بل يشمل خطر التلوث بخلايا من النسيج المجاور المناطق10. وعلاوة على ذلك، لا يتم تأسيس ميكروديسيكشن في كل مختبر. وتشمل مساوئ هذا النهج على أساس فرز نظام مراقبة الأصول الميدانية، مشابهة لليزر ميكروديسيكشن، أن هذه المعدات معقدة وباهظة التكلفة. وبناء على ذلك، هذه المعدات قد لا يكون موجوداً في أي وقت. في وضع سريرية، حيث لا يمكن الضبط المزمع توافر الأنسجة للفائدة، هذا إضافة عيب آخر.

ومع ذلك، هي المزايا الرئيسية لنظام مراقبة الأصول الميدانية-الفرز أن الكسر المفوضية الأوروبية يمكن أن يكون المسمى بأجسام مضادة متعددة في نفس الوقت. وهكذا، يمكن توظيف استراتيجية النابضة صارمة تضمن درجة نقاء عالية. استناداً إلى التجربة، لا إعادة الفرز في كسر الجماعة الأوروبية كان المطلوب، خلافا للبروتوكول المستندة إلى أجهزة ماكينتوش السابقة حيث كان جولات متعددة للاختيار توظيف. وادي ذلك إلى وقت زراعة انخفاضا كبيرا حتى النقاء من ستة أسابيع (نهج أجهزة ماكينتوش) لمدة ثلاثة أسابيع في نهج نظام مراقبة الأصول الميدانية، أسفر عن بقاء خلية محسنة تمكين إطار زمني طويلة لتحليل. أخيرا، باستخدام هذه الاستراتيجية على أساس فرز نظام مراقبة الأصول الميدانية، يمكن أن تحسن من معدل نجاح العزل يتحقق (زيادة قدرها 12.5 في المائة). وفي الختام، الفرز نظام مراقبة الأصول الميدانية على أساس استراتيجية توظيف أجسام 3 في نفس الوقت بعد هضم الأنسجة بهضم الأنسجة الميكانيكية والانزيميه مجتمعة قد المزايا العديدة التي أنشأت هذا البروتوكول كأسلوب الاختيار لعزل تيكس ونيكس من الإنسان من سرطان القولون والمستقيم والقولون.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ونشكر فليرل المسيحية، بيتر كاتيا، كريستينا Schnürer (كل شعبة من الجزيئية والجراحة التجريبية)، ابيلت آوى، مايكل Mroz (الفرز الأساسية وحدة نظام مراقبة الأصول الميدانية) وسيمون Völkl (الوحدة الأساسية نظام مراقبة الأصول الميدانية-إيمونومونيتورينج) للحصول على المساعدة التقنية الممتازة. هذا العمل كان يدعمها المنح إلى EN/MS من مركز إينتيرديسسيبليناري للبحوث السريرية (إيزكف) من "ارلنجن المركز الطبي في جامعة"، مؤسسة البحوث الألمانية (DFG: ل 2438، SP2) ولوتز شتيفتونغ، بمنحه من روبرت-بفلجر-ستيفتونغ إلى VSS فضلا عن المنح المقدمة لمرض التصلب العصبي المتعدد من "مؤسسة البحوث الألمانية" [DFG: KFO257 (المشروع الفرعي 4)، SFB 796 (المشروع الفرعي B9)].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS 1x Gibco by Life Technologies 14175-053
Penicillin-streptomycin Gibco by Life Technologies 15140-122
amphotericin B Gibco by Life Technologies 15290-026
Scalpels, disposable Feather No. 23
gentleMACS octo dissociator Miltenyi Biotec 130-095-937
gentleMACS C-tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
human tumor dissociation kit Miltenyi Biotec 130-095-929
DMEM Gibco by Life Technologies 21969-035
EGM-2-MV BulletKit Lonza CC-3202
Cell strainer, 100 µm Falcon 352360
StemPro Accutase  Gibco by Life Technologies A11105-01
Cell counter, automated Coulter Counter Z1
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503
CD31-FITC BD Pharmingen 555445
CD144/VE-cadherin-PE BD Pharmingen 560410
CD105-APC BD Pharmingen 562408
gelatin from bovine skin Sigma-Aldrich G9391
FACS-Sorting device Beckman Coulter MoFlo XDP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).
  2. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  3. Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
  4. McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat Med. 9 (6), 713-725 (2003).
  5. Hurwitz, H., et al. Bevacizumab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin for metastatic colorectal cancer. N Engl J Med. 350 (23), 2335-2342 (2004).
  6. Naschberger, E., Schellerer, V. S., Rau, T. T., Croner, R. S., Stürzl, M. Isolation of endothelial cells from human tumors. Methods Mol Biol. 731, 209-218 (2011).
  7. Schellerer, V. S., et al. Endothelial cells of human colorectal cancer and healthy colon reveal phenotypic differences in culture. Lab Invest. 87 (11), 1159-1170 (2007).
  8. Naschberger, E., et al. Matricellular protein SPARCL1 regulates tumor microenvironment-dependent endothelial cell heterogeneity in colorectal carcinoma. J Clin Invest. 126 (11), 4187-4204 (2016).
  9. St Croix, B., et al. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).
  10. Christian, S., et al. Endosialin (Tem1) is a marker of tumor-associated myofibroblasts and tumor vessel-associated mural cells. Am J Pathol. 172 (2), 486-494 (2008).
  11. Grange, C., et al. Isolation and characterization of human breast tumor-derived endothelial cells. Oncol Rep. 15 (2), 381-386 (2006).
  12. Miebach, S., et al. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades. J Neurooncol. 76 (1), 39-48 (2006).
  13. Richard, L., Velasco, P., Detmar, M. A simple immunomagnetic protocol for the selective isolation and long-term culture of human dermal microvascular endothelial cells. Exp Cell Res. 240 (1), 1-6 (1998).
  14. Nourse, M. B., et al. VEGF induces differentiation of functional endothelium from human embryonic stem cells: implications for tissue engineering. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (1), 80-89 (2010).
  15. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).

Tags

أبحاث السرطان، المسألة 134، خلايا بطانية، السفينة، سرطان القولون والمستقيم، والورم، والقولون العادي، CD31، هاء-كادهيرين، CD105، الفرز نظام مراقبة الأصول الميدانية، وتفكك النسيج، وورم المكروية، الليفية
عزل الخلايا البطانية البشرية من القولون العادي وسرطان القولون والمستقيم-وضع بروتوكول تحسين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Naschberger, E., Regensburger, D.,… More

Naschberger, E., Regensburger, D., Tenkerian, C., Langheinrich, M., Engel, F. B., Geppert, C., Hartmann, A., Grützmann, R., Schellerer, V. S., Stürzl, M. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol. J. Vis. Exp. (134), e57400, doi:10.3791/57400 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter