Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Isolering av menneskelig endotelceller fra Normal kolon og Colorectal Carcinoma - en forbedret protokoll

Published: April 4, 2018 doi: 10.3791/57400
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 4, 4, 2, *2, *1
1Division of Molecular and Experimental Surgery, Department of Surgery, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Surgery, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 3Division of Nephropathology, Department of Pathology, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 4Department of Pathology, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg
* These authors contributed equally

Summary

Svulst endotelceller er viktig determinanter av svulst microenvironment og løpet av sykdommen. Her, er en protokoll for isolering av ren og levedyktig endotelceller fra menneskelige colorectal karsinom og normal kolon i narkotika testing og patogenesen forskning beskrevet.

Abstract

Primær celler isolert fra menneskelige kreftsvulster er verdifulle verktøy for å identifisere patogene mekanismer bidrar til utvikling av sykdom og progresjon. Spesielt endotelceller (EC) utgjør overflatebehandling av fartøy, direkte delta i oksygen levering, Nærings levering og fjerning av avfallsprodukter til og fra svulster, og er dermed fremtredende involvert i Grunnloven av svulsten microenvironment (TME). Svulst endotelceller (TECs) kan brukes som mobilnettet biosensors av intratumoral microenvironment etablert av kommunikasjon mellom svulst og stromal celler. TECs også tjene som mål terapi. Følgelig i kultur tillate disse cellene studier på mekanismer for svar eller anti-angiogenic resistens. Nylig ble det funnet at TECs isolert fra menneskelige colorectal karsinom (CRC) utstilling minne effekter basert på den spesifikke TME de er avledet fra. Videre bidra disse TECs aktivt til etableringen av en bestemt TME av utskillelsen av ulike faktorer. For eksempel skiller TECs i en prognostically gunstig Th1-TME anti-angiogenic svulst-undertrykkende faktor utskilles protein, surt og rik på cystein som 1 (SPARCL1). SPARCL1 regulerer fartøyet homeostase og hemmer tumor celle spredning og overføring. Derfor er kulturer av ren, levedyktig TECs isolert fra menneskelige solide svulster et verdifullt verktøy for funksjonell studier rollen vaskulære system i tumorigenesis. Her, er en ny oppdatert protokoll for isolering av primære EC fra normal kolon samt CRC beskrevet. Teknikken er basert på mekanisk og enzymatiske vev fordøyelsen, immunolabeling og fluorescens aktivert celle sortering (FACS)-sortering av trippel-positive celler (CD31, VE-cadherin, CD105). Med denne protokollen, levedyktig TEC eller normal endothelial celle (NEC) kulturer kan være isolert fra kolon vev med en suksessrate på 62.12% når de utsettes for sortering av FACS (41 rene EC kulturer fra 66 vevsprøver). Derfor gir denne protokollen en robust tilnærming for å isolere menneskelige EC kulturer fra normal kolon og CRC.

Introduction

Svulst microenvironment (TME) er definert som et nært samspill av kreftceller med svulst stroma, som består av celler som endotelceller (EC), pericytes, fibroblaster, glatte muskelcellene eller immunceller. Kommunikasjonen mellom mobilnettet seksjonene kan være drevet av paracrine faktorer (f.eks angiogenic vekstfaktorer, cytokiner) av ekstracellulær matrix eller direkte celle-celle kontakt. Stromal rommet kan fremme eller motvirke svulst initiering eller progresjon, avhengig av den bestemte TME etablert.

Muligheten for en svulst å koble med fartøyet systemet er nøkkelen til progresjon og metastasering av sykdommen. Fartøyet systemet lar svulst hovedsakelig å få tilgang til levering av oksygen og næringsstoffer samt fjerning av avfallsprodukter1,2,3. EC utgjør overflatebehandling av fartøy, og er derfor viktig cellulære komponenter som deltar aktivt i denne prosessen. Det er velkjent at svulsten endotelceller (TEC) er annerledes enn deres tilsvarende normal endotelceller (NEC) av mange funksjoner som forstyrret hierarki av vaskulær treet, fartøy leakiness, eller redusert modning som eksemplifisert ved et redusert antall pericytes/veggmaleri celler som er bare løst knyttet til EF4.

Derfor er TECs verdifulle mobilnettet verktøy å studere kreft. TECs ble først og fremst ansett å fremme tumor vekst og progresjon3. Dermed kan TECs brukes som biosensors at overvåking og identifisering av patogene prosesser som starte, fremme eller motvirke tumorigenesis. Videre er de terapeutiske mål i klinikken5. Følgelig kan isolerte TECs og tilsvarende NECs også brukes som verktøy for å forstå mekanismene for svar eller resistens anti-angiogenic.

Tidligere vi utviklet en protokoll for å isolere disse cellene6,7 og identifisert at TECs er ikke bare forskjellige fra NECs, men også skiller seg fra hverandre avhengig av TME de er avledet fra8. Gjennom denne tilnærmingen, ble det vist at TECs i bestemte TMEs aktivt kan motvirke tumor vekst og progresjon av utskillelsen av anti-angiogenic svulst-undertrykkende proteiner som SPARCL1. Dette indikerte at TECs bidrar til etableringen av en prognostically gunstig TME i menneskelig colorectal karsinom (CRC)8.

Tidligere studier forsøkte å isolere menneskelige TECs fra solide svulster. Et viktig mål for disse studiene var f.eks identifikasjon av ny svulst endothelial celle markører (TEMs)9. En strategi for bruk av TECs laser microdissection ble tatt i bruk for å unngå endring eller tap av TEC fenotypen i kultur. Imidlertid identifisert oppfølgingsstudier forurensende innbyggere veggmaleri celler som en alvorlig ulempe av denne tilnærmingen10. Våre lab var først til å utvikle en protokoll som tillater isolering av ren, levedyktig TECs menneskelige CRC pasienter6,7. En tilnærming med flere magnetiske celle utvalg (Mac) runder av TECs som sikrer høy renhet av isolerte EC kulturer ble valgt. Denne tilnærmingen kreves imidlertid en periode med relativt lang dyrking (6 uker i gjennomsnitt), som økte risikoen for kultur-indusert gjenstander. Derfor, i neste trinn målet var å redusere dyrking tiden mellom kirurgi og av første ren kulturen. For å oppnå dette målet, en forbedret protokollen ansette en kombinert mekanisk og enzymatiske-baserte vev dissosiasjon av opprinnelige svulsten, etterfulgt av fluorescens aktivert celle sortering (FACS)-sortering av trippel-merket Egenkapitalbevis, ble utviklet. Dette reduserte isolasjon tid gjennomsnittlig 3 uker, noe som resulterer i ren TEC og NEC kulturer med økt levedyktighet for funksjonell studier. Isolering av ren levedyktig TEC og NEC kulturer fra menneskelig vev med høy suksessrate kan åpne nye muligheter for pasient-spesifikke-narkotikatesting under utviklingen av individuell terapi regimer. Isolasjon tilnærming er beskrevet i avsnittene nedenfor.

Protocol

Isolasjon prosessen er godkjent av den lokale etikk av University Medical Center Erlangen (#159_15 B TuMiC-studie). Pasienten inklusjonskriterier var som følger: CRC, UICC stadium I-IV, ingen historie inflammatorisk tarmsykdom, og ingen neoadjuvant behandling.

1. kirurgi og utarbeidelse av vev enkeltcelle isolering

  1. Få prøven av kirurgi fra en CRC pasient (karsinom vev > 0,5 g, sentrale ikke-nekrotisk svulst, normalt kolon vev > 10 cm fjernt fra svulst området).
  2. Innhentet vev brikkene er for det meste < 1 g for karsinom, men > 1 g for normal kolon. Hvis brikker > 1 g hentes, dele dem i 1 g stykker med en frisk skalpell for ytterligere vev behandling.
    Merk: Hvis tumor vev stykket er under 0,5 g fra starten, isolasjon vanligvis mislykkes.
  3. Samle frisk unfixed vev stykker med sterilt tang i 40 mL av is kaldt Hanks balansert salt løsning (HBSS) med penicillin/streptomycin/amphothericin B (1% HBSS-penn/strep/ampho) i 50-mL sentrifuge rør og overføre dem raskt på den laboratoriet.
    Merk: Kolon vev er ofte svært forurenset med bakterier/sopp fra starten. Under hele prosedyren isolasjon, må penn/strep/ampho legges til alle løsninger for å eliminere skadelige organismer.
  4. Vask brikkene vev minst 4 ganger med 40 mL is kaldt HBSS-penn/strep/ampho (se trinn 1.3) i 50-mL sentrifuge rør ved å overføre vev bitene sekvensielt fra en sentrifuge rør til neste røret ved hjelp av sterile pinsett.
    1. Ren tang etter hvert trinn med 70% etanol.
    2. Bruke separate tang for karsinom og normal kolon vev stykker.
    3. Veie alle vev stykker.
      Merk: Ikke plasser vev stykker på en skala for veiing. Etter vasking, veie siste sentrifuge røret som inneholder vevet før og etter inn vev bitene. Beregne vekten av personlige vev ved subtraksjon.

2. generasjon enkeltcelle suspensjon

Merk: Det anbefales å holde vevet fuktig hele tiden.

  1. Hvis den finnes, fjerne tilknyttede fat, andre ikke-tumorous vev eller potensielt nekrotisk vev deler fra kirurgi prøven ved å overføre vev bitene i et sterilt celle kultur Petriskål bruker sterilt tang.
    1. Holde vev brikkene fuktig på alle tider ved å legge til 3-5 mL av HBSS-penn/strep/ampho.
    2. Trim vev bitene bruke fersk sterilt skalpell (figur 1). Konsultere en patologen i tilfelle vev identifikasjon er uklart.
  2. Hakke gjenværende vev i små biter (ca 2 × 2 × 2 mm3) bruke fersk skalpell med buet blad. Overføre vev stykker med sterilt tang i vev dissosiasjon rør (for eksempel gentleMACS C rør) forhåndsutfylt med forvarmes (37 ° C) celle kultur medium (Dulbecco´s endret eagle middels [DMEM] basale medium) i henhold til produsentens instruksjoner.
    Merk: Prøv å bruke skalpell som et rock-verktøy. Ikke klem cellene for å unngå skade på vev.
  3. Digest/distansere vev bitene bruke en vev dissociator (som gentleMACS Octo Dissociator) i kombinasjon med svulst dissosiasjon kit for menneskelig vev ved programmet "37C_h_TDK_1" etter manufacturer´s.
  4. Sentrifuge dissosiasjon rør for 1 min på 300 x g ved romtemperatur (RT).
  5. Legge til 10 mL forvarmes (37 ° C) DMEM med 0,5% fosterets bovin serum (FBS) (DMEM-lav) til hver tube med en serologisk pipette og filtrere celle suspensjon benytter en celle sil (100 µm porestørrelse) på en 50-mL sentrifuge tube av pipettering cellen suspensjon på filteret.
  6. Legge 10 mL av DMEM-lav igjen til hver Mac-tube ved en serologisk pipette og overføre gjenværende celler til celle silen over 50 mL sentrifuge røret.
  7. Vask celle silen én gang med en ekstra 10 mL av DMEM-lav middels bruker en serologisk pipette.
  8. Sentrifuge celle suspensjon i 7 min på 300 x g ved RT og kast nedbryting.
  9. Resuspend celler i 5 mL av forvarmes endothelial basale medium (EBM) -2-mikrovaskulær (MV) medium (Lonza) med penn/strep/ampho i samme 50-mL sentrifuge røret.
  10. Plate celle suspensjon i en T-25 celle kultur kolbe pre-belagt over natten med 1,5% gelatin-fosfat bufret saltvann (PBS) på 37 ° C med 5% CO2.
  11. Inkuber celler for 24 h på 37 ° C og 5% CO2, vask cellene to ganger med ca 5 mL av PBS og legge 5 mL av fersk medium.
  12. Dyrke cellene på 37 ° C og 5% CO2 til 80-90% confluency (vanligvis 5-7 dager) med 48t intervaller på middels fornyelse.

3. FACS-sortering av endotelceller

Merk: Prøv å unngå å miste celler når som helst, f.eks ved å begrense flekker prosedyren til inkubasjon cellene i en enkelt reagens rør.

  1. Koble celler med 1 mL av accutase (ca 10 min), og Legg 4 mL forvarmes (37 ° C) EBM-2-FV medium.
  2. Bestemme celletall bruker en automatisert celle teller enhet (området 10-25 µm).
  3. Sentrifuge celle suspensjon for 4 min med 250 x g ved RT og kast nedbryting.
  4. Resuspend celler i forvarmes FACS-buffer (1 x PBS, 2,5% bovin serum albumin [BSA], 5 mM EDTA pH 8.0, 10 µM Y-27632) ifølge celletall (5 x 106/mL).
  5. Legge til FACS flekker antistoffer ifølge celle teller/FACS-buffer volum: CD31-FITC (100 µL/mL = 1/10), CD144/vaskulær endotelial (VE) - cadherin - PE (100 µL/mL = 1/10), CD105-APC (25 µL/mL = 1/40), bland og ruge i 7 min på RT beskyttet mot lys; forsiktig sveip og ruge for en annen 8 min (for en totalt inkubering periode på 15 min).
  6. Legge til 2 mL FACS-buffer merket celle suspensjon bruker en serologisk pipette.
  7. Sentrifuge for 4 min med 250 x g ved RT og kast nedbryting.
  8. Vask to ganger ved å legge til 2 mL FACS-buffer, og gjennomføre en påfølgende sentrifugering for 4 min 250 x g på RT og forkaste nedbryting.
  9. Resuspend cellene i 500 µL av forvarmes EBM-2-MV-penn/strep/ampho og overføring på sortering av FACS apparatet.
    1. Endotelceller dør raskt under sortering prosessen hvis FACS-maskinen er avkjølt. Derfor utføre sorteringen av endotelceller på RT og øyeblikkelig overføre det avhentet celler til 37 ° C inkubator etterpå.
      NOTE Det FACS-instrumentet er vanligvis unsterile!
  10. Sorter/samle trippel-positive celler direkte i en celle kultur parabol (f.eks 24-vel plate pre-belagt over natten med 1,5% gelatin-PBS) fylt med 0,5 mL av forvarmes frisk medium (EBM-2-MV-penn/strep/ampho).
    Merk: Se celle suspensjon etter sortering ved hjelp av et mikroskop. Hvis cellene klynge sammen, prøve å få en jevn celle fordeling i celle kultur parabol ved blande dem sakte eller medium.
  11. Dyrke celler inntil 90-100% confluency med 48t intervaller på middels fornyelse og utvide cellene til ønsket kultur parabol størrelsen (24-vel plate → 12 vel-plate → 3,5 cm parabolen → T-25 → T-75).

4. harvest og karakterisering av ren endotelceller

  1. Høste celler ved 90-100% confluency og karakteriserer dem med en passende metode (f.eks FACS, cytochemistry, kvantitativ polymerasekjedereaksjons (qPCR) eller endothelial celle funksjon analyser7,8).
  2. Analysere isolert celler med hvilken karakterisering-metoden er valgt.

Representative Results

Isolasjon av NEC og TEC fra menneskelige CRC av en kombinert mekanisk/enzymatical vev dissosiasjon, etterfulgt av påfølgende CD31/CD105/VE-cadherin-drevet FACS-sortering er beskrevet her (figur 1A). Denne protokollen representerer en forbedret protokoll med en redusert tidsvinduet før den første innhøstingen av ren, levedyktig endotelceller i forhold til tidligere Mac-basert protokoll7.

NEC og TEC ble isolert fra menneskelige CRC på følgende måte: (1) generasjon en enkeltcelle suspensjon av kombinerte mekanisk og enzymatiske vev dissosiasjon og vekst av disse cellene til 80-90% confluency (figur 1), (2) trippel merking av EU CD31/CD105/VE-cadherin fluorochrome-kombinert antistoffer, og (3) FACS-sortering av respektive trippel-positive cellene (figur 2A). Av notatet, et viktig skritt for suksessen til isolasjon prosedyren og levedyktigheten til cellene er å raskt emne kirurgi prøven i isolasjon prosedyren (generasjon enkeltcelle suspensjon < 1 time etter eksisjon). Bruke FACS-sortering, et gjennomsnitt på 12 500 TEC (n = 12) og 17,800 NEC (n = 12, figur 2B, venstre) som representerer et gjennomsnitt på 3.6 og 5,6% av total-celle befolkningen (figur 2B, høyre) kunne isoleres. Cellene ble deretter utvidet til T-75 (kalt passering 1) og høstet eller ytterligere behandlet for analyse. Av notatet, ved hjelp av tidligere Mac-basert, en gjennomsnittlig isolasjon suksess på 49.6% ble oppnådd (n = 58 rene TECs fra n = 117 pasienter8) med ren EC kulturer tilgjengelig i gjennomsnitt seks uker etter operasjonen. Med den nye FACS-basert protokollen beskrevet her, de første rene EC kulturene ble innhentet gjennomsnittlig 3 uker etter kirurgi med en isolasjon suksessrate på 62.1% (n = 41 rene EC kulturer fra n = 66 enkelt celler suspensjoner utsatt for sortering av FACS). Derfor ble en økning av isolasjon rate av 12,5% oppnådd i parallell med en reduksjon av dyrking tiden fra 6 til 3 uker. Denne reduksjonen av dyrking tiden førte til forbedret celle levedyktighet og forlenget levetid med mindre eksponering for induksjon av potensielle kultur-avhengige gjenstander av etablerte kulturer.

Karakteristikk av EC renhet ble utført først av CD31-cytochemistry (Figur 3A). Hvis kulturer uten CD31-negativ celler (Figur 3A, TEC og NEC), ble de utsatt for en mer detaljert celle innskriving ved omvendt transkripsjon kvantitative polymerasekjedereaksjons (RT-qPCR) (Figur 3B). Celle-type bestemt primere for EC (CD31, CD105, VE-cadherin og von Willebrand faktor [vWF]), leukocytter (CD45), epitelceller (cytokeratin [CK] -20) og glatt muskel celler/fibroblaster (desmin) ble brukt (Figur 3B). Bruke qPCR-baserte cellen skriver, en potensiell forurensning av EC kulturer av andre celler i området 0,1 - 2%, avhengig av hvilken celle, kan være oppdaget8.

Spesielt rapportert vi tidligere fortrinnsrett tap av vWF protein uttrykk i TEC kulturer sammenlignet med deres tilsvarende NEC kulturer7. Disse funnene kan bekreftes med nyetablerte isolasjon protokollen (Figur 3C, mener Ct tap NEC-TEC = 0.687, p = 0.173, sammenkoblet t-test). Kulturer bestått disse kvalitetskontroll ble testet for mycoplasma infeksjon og brukt i videre studier.

Figure 1
Figur 1 : Ren endotelceller kan være isolert fra menneskelige normal kolon og CRC av FACS-sortering. (A) flytdiagram for grunnleggende trinnene av EC isolasjon. (B) fettvev (gul), andre ikke-tumorous deler eller potensielt nekrotisk vev deler (brun) ble fjernet fra kirurgi prøven (venstre og den midterste panel) og svulst ble oppløst i terninger med 2-3 mm sidelengde før vev dissosiasjon ( høyre panel). (C) enkeltcelle suspensjon hentet etter vev dissosiasjon (venstre panel) ble inkubert 24 h i celle kultur retter. Deretter ikke-tilhenger celler ble fjernet ved mild vask med PBS (midten panel) og cellene var vokst til 80-90% confluency før FACS-sortering (høyre panel). Bilder av nedre panel (C) ble kjøpt av fase kontrast mikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Gjennomsnittlig 3,6 5.6% av enkeltcelle suspensjon isolert fra menneskelige CRC pasienter og sortert etter FACS var trippel-positive EC. (A) NEC og TEC var FACS-sortert med en trippel merking av cellene med anti-CD31, - CD105 og -VE-cadherin antistoffer. (B) en betyr av 12 500 TECs (n = 12) og 17,800 NECs (n = 12) kan isoleres fra menneskelige normal kolon eller CRC bruker FACS-sortering (CD31, CD105 og VE-cadherin-positiv celler, venstre panel), som representerer gjennomsnittlig 3,6 og 5,6% (høyre panel) i totalt-cellen befolkningen ansatt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : NEC og TEC fra menneskelige CRC express typisk endothelial celle markører. Normal kolon endotelceller (NEC, n = 10) og svulst endotelceller (TEC, n = 10) fra menneskelig CRC er CD31 (EC markør)-, CD105 (EC markør)-, VE-cadherin (EC markør), vWF (EC markør) - positive og CK20 (CRC celle markør)-, desmin (fibroblast/SMC markør)-, CD45 ( leukocytter markør)-negativ som (A) CD31-immunocytochemistry (positiv celler = rød) og (B) RT-qPCR (datapunkt under den stiplede linjen er prøver oppdaget for å være negativ). (C) vWF uttrykk som fastsatt av RT-qPCR for tilsvarende TEC/NEC fra samme pasienter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Hovedsakelig har tre forskjellige metoder vært så langt å isolere ren og levedyktig NECs og TECs fra menneskelige solid vev, nemlig (1) immunomagnetic berikelse, (2) laser microdissection og (3) FACS-sortering i EC brøken ansatt. I de fleste publikasjoner var immunomagnetic anriking av cellene etter generasjon av en enkelt celle suspensjon av mekanisk oppløsningen brukte11,12,13. For eksempel immunomagnetic rensing av menneskelig dermal mikrovaskulær EC (HDMEC) av E-selectin antistoffer etter tumor nekrose faktor (TNF)-α behandling fra neonatal forhuder13 har rapportert for isolering av menneskelig EC fra glioma vev fordøye, percoll gradering og utvalg med anti-CD31/CD105 og VE-cadherin-antistoffer12, eller av anti-CD105 antistoffer fra menneskelig bryst karsinom11. Som ansatt laser microdissection eller FACS-sortering er sjeldnere rapportert. Laser microdissection ble brukt, for eksempel for å identifisere potensielle pan-svulst endothelial celle markører (TEMs) i EC avledet fra menneskelige colorectal karsinom med analyse av cellene umiddelbart etter disseksjon9. Sortering av FACS bruker anti-CD31-antistoffer ble vist for isolering av EC brøken fra udifferensierte menneskelige embryonale stamceller14.

Disse metodene har forskjellige fordeler og ulemper som må vurderes. Fordelene for immunomagnetic-basert tilnærming er at ingen omfattende utstyr er nødvendig, utvalget kan utføres når, og cellen anriking er rask (ca 15 min) i forhold til sortering av FACS (ca 1 h). Mangel på matrise for en lengre periode kan indusere celledød av EC av anoikis. Derfor var tillegg av den rho kinase inhibitor Y-27632 til FACS bufferen ansatt å hindre celle anoikis15.

Ulempene ved immunomagnetic berikelse er at flere runder med utvalg er nødvendig for å oppnå renhet over 99%. Videre kreves celle dyrking mellom enrichments for celle utvinning, som øker år kulturer støtte kultur-indusert gjenstander. Laser microdissection har fordelen at cellene kan brukes umiddelbart som reduserer kultur-indusert gjenstander men inkluderer risikoen for forurensing av celler fra nærliggende vev områder10. Videre er microdissection ikke etablert i hvert laboratorium. Omfatter ulempene av FACS-sortering-basert tilnærming ligner laser microdissection, at utstyret er omfattende og kostnadskrevende. Følgelig vil utstyret ikke være tilgjengelig når som helst. I en klinisk setting, der tilgjengeligheten av vevet rundt ikke nøyaktig planlagt, kan dette legge ytterligere ulempe.

De store fordelene av FACS-sortering er imidlertid at EU brøken kan merkes med flere antistoffer parallelt. Dermed kan en strenge gating strategi anvendes som vil sikre en høy renhetsgrad. Basert på erfaring, var ingen re sortering av EC brøken nødvendig, i motsetning til den forrige Mac-basert protokollen der flere runder med utvalg måtte være ansatt. Dette førte til en betydelig redusert dyrking tid til renhet fra seks uker (Mac tilnærming) til tre uker i FACS tilnærming, som resulterer i en forbedret celle levedyktighet muliggjør en langvarig vinduet analyse. Til slutt, bruker den FACS-sortering-basert strategien, en forbedring av total isolasjon suksessraten kunne oppnådd (økning på 12,5%). Avslutningsvis basert FACS-sortering strategi ansette 3 antistoffer parallelt etter vev Sammendrag av kombinerte mekanisk og enzymatiske vev fordøyelse hadde mange fordeler som etablerte denne protokollen som metoden for valg for isolering av TECs og NECs fra menneskelige colorectal karsinom og kolon.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker Christian Flierl, Katja Petter, Christina Schnürer (alle divisjon av molekylære og eksperimentelle kirurgi), Uwe Appelt, Michael Mroz (kjernen enhet FACS-sortering) og Simon Völkl (kjernen enhet FACS-Immunomonitoring) for utmerket kundestøtte. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd til no/MS for tverrfaglig senter for klinisk forskning (IZKF) av University Medical Center Erlangen, tysk Research Foundation (DFG: FOR 2438, SP2) og Lutz-Stiftung, av en bevilgning av Robert-filtermedia-Stiftung VSS tillegg tilskudd tildeles MS fra tysk Research Foundation [DFG: KFO257 (sub prosjekt 4), SFB 796 (delprosjektet B9)].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS 1x Gibco by Life Technologies 14175-053
Penicillin-streptomycin Gibco by Life Technologies 15140-122
amphotericin B Gibco by Life Technologies 15290-026
Scalpels, disposable Feather No. 23
gentleMACS octo dissociator Miltenyi Biotec 130-095-937
gentleMACS C-tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
human tumor dissociation kit Miltenyi Biotec 130-095-929
DMEM Gibco by Life Technologies 21969-035
EGM-2-MV BulletKit Lonza CC-3202
Cell strainer, 100 µm Falcon 352360
StemPro Accutase  Gibco by Life Technologies A11105-01
Cell counter, automated Coulter Counter Z1
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503
CD31-FITC BD Pharmingen 555445
CD144/VE-cadherin-PE BD Pharmingen 560410
CD105-APC BD Pharmingen 562408
gelatin from bovine skin Sigma-Aldrich G9391
FACS-Sorting device Beckman Coulter MoFlo XDP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).
  2. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  3. Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
  4. McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat Med. 9 (6), 713-725 (2003).
  5. Hurwitz, H., et al. Bevacizumab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin for metastatic colorectal cancer. N Engl J Med. 350 (23), 2335-2342 (2004).
  6. Naschberger, E., Schellerer, V. S., Rau, T. T., Croner, R. S., Stürzl, M. Isolation of endothelial cells from human tumors. Methods Mol Biol. 731, 209-218 (2011).
  7. Schellerer, V. S., et al. Endothelial cells of human colorectal cancer and healthy colon reveal phenotypic differences in culture. Lab Invest. 87 (11), 1159-1170 (2007).
  8. Naschberger, E., et al. Matricellular protein SPARCL1 regulates tumor microenvironment-dependent endothelial cell heterogeneity in colorectal carcinoma. J Clin Invest. 126 (11), 4187-4204 (2016).
  9. St Croix, B., et al. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).
  10. Christian, S., et al. Endosialin (Tem1) is a marker of tumor-associated myofibroblasts and tumor vessel-associated mural cells. Am J Pathol. 172 (2), 486-494 (2008).
  11. Grange, C., et al. Isolation and characterization of human breast tumor-derived endothelial cells. Oncol Rep. 15 (2), 381-386 (2006).
  12. Miebach, S., et al. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades. J Neurooncol. 76 (1), 39-48 (2006).
  13. Richard, L., Velasco, P., Detmar, M. A simple immunomagnetic protocol for the selective isolation and long-term culture of human dermal microvascular endothelial cells. Exp Cell Res. 240 (1), 1-6 (1998).
  14. Nourse, M. B., et al. VEGF induces differentiation of functional endothelium from human embryonic stem cells: implications for tissue engineering. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (1), 80-89 (2010).
  15. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).

Tags

Kreftforskning problemet 134 endotelceller fartøy Colorectal Carcinoma Tumor Normal kolon CD31 VE-cadherin CD105 FACS-sortering vev dissosiasjon Tumor Microenvironment fibroblaster
Isolering av menneskelig endotelceller fra Normal kolon og Colorectal Carcinoma - en forbedret protokoll
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Naschberger, E., Regensburger, D.,… More

Naschberger, E., Regensburger, D., Tenkerian, C., Langheinrich, M., Engel, F. B., Geppert, C., Hartmann, A., Grützmann, R., Schellerer, V. S., Stürzl, M. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol. J. Vis. Exp. (134), e57400, doi:10.3791/57400 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter