Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Isolering av mänskliga Endothelial celler från Normal kolon och kolorektal carcinom - ett förbättrat protokoll

Published: April 4, 2018 doi: 10.3791/57400
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 4, 4, 2, *2, *1
1Division of Molecular and Experimental Surgery, Department of Surgery, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Surgery, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 3Division of Nephropathology, Department of Pathology, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 4Department of Pathology, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg
* These authors contributed equally

Summary

Tumör endotelceller är viktiga bestämningsfaktorer för den tumör närmiljön och den sjukdomens förlopp. Här beskrivs ett protokoll för isolering av ren och livskraftig endothelial celler från mänskliga kolorektal carcinom och normal kolon användas i läkemedelsforskning testning och patogenes.

Abstract

Primära celler som isolerats från mänskliga carcinom är värdefulla verktyg att identifiera patogena mekanismer bidrar till sjukdomsutveckling och progression. I synnerhet endotelceller (EG) som utgör den inre ytan av fartyg, direkt delta i syre leverans, näringstillförsel och avlägsnande av slaggprodukter till och från tumörer, och är därmed tydligt inblandade i konstitutionen av tumören närmiljön (TME). Tumör endotelceller (TECs) kan användas som cellulära biosensorer för den intratumoral mikromiljö fastställts av kommunikation mellan tumör och stromaceller. TECs också fungera som mål för terapi. Följaktligen i kultur tillåta dessa celler studier om mekanismer för svar eller resistens mot anti-angiogena behandling. Nyligen konstaterades att TECs isolerade från mänskliga kolorektal cancer (CRC) utställning minne-liknande effekter utifrån de specifika TME de härrör från. Dessutom bidra dessa TECs aktivt till inrättandet av en specifik TME genom utsöndring av olika faktorer. Till exempel utsöndrar TECs i ett prognostiskt gynnsamma Th1-TME proteinet antiangiogena-tumör-suppressiv factor utsöndras, sura och rik på cystein-liknande 1 (SPARCL1). SPARCL1 reglerar kärl homeostas och hämmar proliferation av tumör och migration. Kulturer av ren, livskraftiga TECs som isolerats från mänskliga solida tumörer är därför ett värdefullt verktyg för funktionella studier om det vaskulära systemet i tumourigenesis roll. Här beskrivs ett nytt uppdaterat protokoll för isolering av primära EG från normal kolon samt CRC. Tekniken bygger på mekaniska och enzymatisk vävnad matsmältningen, immunolabeling och fluorescens aktiverad cell sortering (FACS)-sortering av triple-positiva celler (CD31, VE-cadherin, CD105). Med detta protokoll, livskraftig TEC eller normala endotelceller (NEC) kulturer kunde isoleras från kolon vävnader med en framgång på 62.12% när de utsätts för FACS-sortering (41 EG renkulturer från 66 vävnadsprover). Således ger detta protokoll en robust metod för att isolera mänskliga EG kulturer från normal kolon och CRC.

Introduction

Den tumör närmiljön (TME) definieras som ett nära samspel av tumörceller med tumör stroma, som består av celler som endotelceller (EG), pericyter, fibroblaster, glatta muskelceller eller immunceller. Kommunikationen mellan dessa cellulära avdelningar kan drivas av parakrin faktorer (t.ex. tillväxt angiogena, cytokiner) av extracellulär matrix eller direkt cell-cell kontakt. Stromaceller facket kan främja eller motverka tumören inledandet eller progression, beroende på den specifika TME etablerat.

En tumör förmåga att samverka med fartyget systemet är nyckeln till progression och metastas av sjukdomen. Fartyg systemet tillåter tumören huvudsakligen att få tillgång till leveransen av syre och näringsämnen samt avlägsnande av slaggprodukter1,2,3. EG utgör den inre ytan av fartyg, och är därför viktiga cellulära komponenter som aktivt deltar i denna process. Det är väl känt att tumören endotelceller (TEC) skiljer sig från deras motsvarande normala endothelial celler (NEC) av många funktioner såsom störd hierarki av vaskulär träd, fartyget leakiness, eller reduceras mognad som exemplifieras av ett minskat antal pericyter/väggmålning celler som är bara löst kopplade till EG4.

Därför är TECs värdefulla cellulära verktyg att studera carcinogenes. TECs ansågs primärt främja tumör tillväxt och progression3. TECs kan således användas som biosensorer som tillåter övervakning och identifiering av patogena processer som initierar, främja eller motverka uppkomst. Dessutom är de terapeutiska mål i klinik5. Följaktligen, isolerade TECs och motsvarande nationella Europass-centrum kan också användas som verktyg för att förstå mekanismer svar eller resistens mot anti-angiogena behandling.

Tidigare har vi utvecklat ett protokoll för att isolera dessa celler6,7 och identifierade att TECs är inte bara skiljer sig från nationella Europass-centrum, men också skiljer sig från varandra beroende på den TME de härleddes från8. Genom detta tillvägagångssätt visades det att TECs i vissa TMEs aktivt kan motverka tumörtillväxt och progression av utsöndring av anti-angiogena tumör-suppressiv proteiner såsom SPARCL1. Detta anges att TECs aktivt bidrar till inrättandet av ett prognostiskt gynnsamma TME i mänskliga kolorektal cancer (CRC)8.

Tidigare studier försökte isolera mänskliga TECs från solida tumörer. Ett viktigt mål av dessa studier var, t.ex. identifiering av nya tumör endotelceller markörer (TEMs)9. En strategi för omedelbar användning av TECs laser lokalt hade installerats för att undvika förändring eller förlust av TEC fenotypen i kultur. Uppföljande studier har dock identifierat en kontaminerande befolkning på väggmålning celler som en allvarlig nackdel med denna metod10. Vårt labb var de första att utveckla ett protokoll som tillåtna isoleringen av ren, livskraftiga TECs från mänskliga CRC patienter6,7. En strategi med flera magnetiska cell (Mac) urvalsomgångarna av de TECs som garanteras hög renhet av isolerade EG kulturerna valdes. Detta tillvägagångssätt krävs dock en relativt lång odlingsperiod (6 veckor i genomsnitt), vilket ökade risken för kultur-inducerad artefakter. Därav, i nästa steg, Syftet var att minska den odling tid mellan kirurgi och skörden av den första rena kulturen. För att uppnå detta mål, ett förbättrat protokoll som sysselsätter en kombinerad mekanisk och enzymatisk-baserade vävnad dissociation av ursprungliga tumören, följt av fluorescens aktiverad cell sortering (FACS)-sortering av triple-märkt EG, utvecklades. Detta minskar isolering tid i genomsnitt till tre veckor, vilket resulterar i EG-fördraget och NEC renkulturer med ökad lönsamhet för funktionella studier. Isolering av rena livskraftig TEC och NEC kulturer från mänskliga vävnader med hög träffsäkerhet kan öppna nya vägar för patientspecifika drogtester under utvecklingen av individualiserad terapi-regimer. Metoden med isolering är detaljerad i följande punkter.

Protocol

Isolering processen har godkänts av den lokala etiska kommittén av universitetet medicinska Center Erlangen (#159_15 B, TuMiC-studien). Patienten inklusionskriterier var följande: CRC, UICC stage I-IV, ingen historia av inflammatorisk tarmsjukdom och ingen neoadjuvant behandling.

1. kirurgi och förberedelse av vävnad för enstaka Cell isolering

  1. Skaffa exemplar av kirurgi från CRC patient (carcinoma vävnad > 0,5 g, centrala icke-nekrotisk tumör; normal kolon vävnad > 10 cm avlägset från tumören webbplats).
  2. De erhållna vävnad bitarna är mestadels < 1 g för carcinom, men > 1 g för normal kolon. Om bitar > 1 g erhålls, dela upp dem i flera 1 g bitar med en färsk skalpell för ytterligare vävnad behandling.
    Obs: Om tumören vävnad lappa understiger 0,5 g från debuten, isoleringen oftast misslyckas.
  3. Samla färsk orättade vävnad bitar med steril pincett i 40 mL is kallt Hanks balanserad saltlösning (HBSS) kompletteras med penicillin/streptomycin/amphothericin B (1% HBSS-penna/strep/ampho) i 50 mL centrifugrör och överföra dem snabbt till den laboratorium.
    Obs: Kolon vävnad är ofta starkt förorenade med bakterier/svampar från början. Under hela förfarandet för isolering, måste penna/strep/ampho läggas till alla lösningar för att undanröja kontaminerande organismer.
  4. Tvätta varje vävnad bit minst 4 gånger med 40 mL is kallt HBSS-penna/strep/ampho (se steg 1.3) i 50 mL centrifugrör genom att överföra vävnad bitar sekventiellt från ett centrifugrör till nästa röret med steril pincett.
    1. Ren pincett efter varje steg med 70% etanol.
    2. Använda separata pincett för carcinom och normal kolon vävnad bitar.
    3. Väg alla vävnad bitar.
      Obs: Inte sätta vävnad bitar direkt på en skala för vägning. Efter tvätt, väga sista centrifugröret innehållande vävnaden före och efter inresan vävnad bitar. Räkna ut vikten av enskilda vävnad bitar genom subtraktion.

2. generering av enda cellsuspension

Obs: Det rekommenderas att hålla vävnaden återfuktad hela tiden.

  1. Om den finns, ta bort bifogade fat, andra icke-maligna vävnader eller potentiellt nekrotisk vävnad delar från kirurgi preparatet genom att överföra vävnad bitarna i en steril cell kultur petriskål med steril pincett.
    1. Hålla vävnad bitar återfuktad på alla tider genom att lägga till 3-5 mL HBSS-penna/strep/ampho.
    2. Trimma vävnad bitarna med en ny steril skalpell (figur 1). Konsultera en patolog vävnad identifiering är oklart.
  2. Finhacka resterande vävnad i små bitar (ca 2 × 2 × 2 mm3) med en färsk skalpell med ett böjt blad. Överföra vävnad bitar med steril pincett in vävnad dissociation rören (till exempel gentleMACS C rör) förfylld med pre värmde (37 ° C) cellodlingsmedium (Dulbecco´s modifierad eagle medel [DMEM] basala medel) enligt tillverkarens instruktioner.
    Obs: Försöka använda en skalpell som ett gungande verktyg. Inte pressa cellerna för att undvika vävnadsskada.
  3. Digest/dissociera vävnad bitar med en vävnad dissociator (som gentleMACS Octo Dissociator) i kombination med tumör dissociation kit för mänsklig vävnad med hjälp av programmet ”37C_h_TDK_1” efter tillverkarens instruktioner.
  4. Centrifugera dissociation rör för 1 min vid 300 x g vid rumstemperatur (RT).
  5. Tillsätt 10 mL av pre värmde (37 ° C) DMEM kompletteras med 0,5% fetalt bovint serum (FBS) (DMEM-låg) till varje rör med serologiska pipett och filtrera cellsuspension med en cell sil (100 µm porstorlek) ovanpå ett 50 mL centrifugrör genom pipettering cellen upphängning på toppen av filtret.
  6. Tillsätt 10 mL av DMEM-låg igen till varje Mac-rör av serologiska pipett och överföra resterande celler till cell silen ovanpå det 50 mL centrifugröret.
  7. Tvätta cell silen en gång med ytterligare 10 mL av DMEM-låg medium med serologiska pipett.
  8. Centrifugera cellsuspensionen för 7 min på 300 x g på RT och Kassera supernatanten.
  9. Återsuspendera cellerna i 5 mL före värmde endothelial basala medium (EBM) -2-mikrovaskulära (MV) medium (Lonza) kompletteras med penna/strep/ampho i det samma 50 mL centrifugröret.
  10. Plattan cellsuspension i en T-25 cell kultur kolv pre belagda över natten med 1,5% gelatin-fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 37 ° C med 5% CO2.
  11. Inkubera cellerna under 24 timmar vid 37 ° C och 5% CO2, tvätta cellerna två gånger försiktigt med cirka 5 mL PBS och tillsätt 5 mL av färskt medium.
  12. Odla cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 fram till 80-90% konfluens (vanligen 5-7 dagar) med 48 h intervall av mediumförnyelse.

3. FACS-sortering av endotelceller

Obs: Försök att undvika att förlora celler när som helst, t.ex. genom att begränsa färgningsproceduren till inkubation av cellerna i en enda reagensröret.

  1. Loss celler med 1 mL av accutase (ca 10 min) och lägga till 4 mL före värmde (37 ° C) EBM-2-MV medium.
  2. Avgöra celltalet med en automatisk cell räknar enheten (mellan 10-25 µm).
  3. Centrifugera cellsuspension för 4 min med 250 x g på RT och Kassera supernatanten.
  4. Återsuspendera cellerna i förväg värmde FACS-buffert (1 x PBS, 2,5% bovint serumalbumin [BSA], 5 mM EDTA pH 8,0, 10 µM Y-27632) enligt celltal (5 x 106/ml).
  5. Lägg till FACS-färgning antikroppar enligt greve/FACS-buffert cellvolym: CD31-FITC (100 µL/mL = 1/10), CD144/vaskulär endotel (VE) - cadherin - PE (100 µL/mL = 1/10), CD105-APC (25 µL/mL = 1/40), blanda och inkubera i 7 min på RT skyddas från ljus; varsamt svep och inkubera i en annan 8 min (under en total inkubationstiden på 15 min).
  6. Tillsätt 2 mL av FACS-buffert till märkt cellsuspension med serologiska pipett.
  7. Centrifugera i 4 min med 250 x g på RT och Kassera supernatanten.
  8. Tvätta två gånger genom att tillsätta 2 mL FACS-buffert, och genomföra en efterföljande centrifugering i 4 min på 250 x g på RT och Kassera supernatanten.
  9. Blandas i 500 µL före värmde EBM-2-MV-penna/strep/ampho och överföring celler till FACS-sortering instrumentet.
    1. Endotelceller kommer snabbt dö under processen sortering om FACS-instrumentet kyls. Därför utföra sortering av endotelceller på RT och omedelbart överföra insamlade cellerna till 37 ° C inkubatorn efteråt.
      Obs: FACS-instrumentet är vanligtvis osterila!
  10. Sortera/samla triple-positiva celler direkt in i en cell kultur maträtt (t.ex. 24-well platta pre belagda över natten med 1,5% gelatin-PBS) fylld med 0,5 mL av pre värmde färskt medium (EBM-2-MV-penna/strep/ampho).
    Obs: Kontrollera cellsuspension efter sortering med Mikroskop. Om cellerna kluster tillsammans, försöka få en cell fördelas jämnt i cell kultur skålen genom blanda dem långsamt eller lägga till medium.
  11. Odla cellerna fram till 90-100% konfluens med 48 h intervall av mediumförnyelse och expandera cellerna till önskad kultur skålen storlek (24-väl plattan → 12 brunn-plattan → 3,5 cm skålen → T-25 → T-75).

4. skörden och karakterisering av ren endotelceller

  1. Skörda celler på 90-100% konfluens och karakterisera dem genom en lämplig metod (t.ex., FACS, cytochemistry, kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR) eller endotelcell funktion analyser7,8).
  2. Analysera isolerade celler med den karakterisering metoden väljs.

Representative Results

Isolering av NEC och TEC från mänskliga CRC av en kombinerad mekanisk/enzymatical vävnad dissociation, följt av efterföljande CD31/CD105/VE-cadherin-driven FACS-sortering beskrivs här (figur 1A). Detta protokoll representerar ett förbättrat protokoll med en reducerad tidsramen fram till den första skörden av ren, livskraftiga endotelceller jämfört med tidigare Mac-baserade protokoll7.

NEC och TEC var isolerade från mänskliga CRC med följande steg: (1) generering av en enda cellsuspension av kombinerad mekanisk och enzymatisk vävnad dissociation och tillväxten av dessa celler att 80-90% konfluens (figur 1), (2) trippel märkning av EG CD31/CD105/VE-cadherin fluorokrom-kopplade antikroppar, och (3) FACS-sortering av de respektiva triple-positiva cellerna (figur 2A). Notera, ett kritiskt steg för den isolering ingreppets framgång och lönsamhet av cellerna är att snabbt omfattas kirurgi exemplaret av isolering förfarandet (generation av enda cellsuspension < 1 timme efter resektion). Använda FACS-sortering, ett medelvärde på 12.500 TEC (n = 12) och 17,800 NEC (n = 12, figur 2B, vänster) som representerar ett genomsnitt av 3,6 och 5,6% av befolkningens totala cellen (figur 2B, höger) kunde isoleras. Därefter utvidgades cellerna upp till T-75 (kallas passage 1) och antingen skördade eller ytterligare bearbetas för analys. Notera, med tidigare Mac-baserade protokollet, en genomsnittlig isolering framgång 49,6% uppnåddes (n = 58 ren TECs från n = 117 patienter8) med ren EG kulturer finns i genomsnitt 6 veckor efter operationen. Med den nya FACS-baserat protokoll som beskrivs här, de första rena EG kulturerna erhölls i genomsnitt 3 veckor efter operationen med en isolering framgång på 62,1% (n = renkulturer av EG 41 erhållits från n = 66 enstaka celler suspensioner utsätts FACS-sortering). Därför uppnåddes en ökning av andelen isolering med 12,5% parallellt med en minskning av den odling tid från 6 till 3 veckor. Denna minskning av odling tiden ledde till förbättrad cellernas viabilitet och förlängd livslängd tillsammans med mindre exponering för induktion av potentiella kultur-beroende artefakter av etablerade kulturerna.

Karakterisering av EG renhet genomfördes först av CD31-cytochemistry (figur 3A). Om kulturerna var saknar CD31-negativa celler (figur 3A, TEC och NEC), utsattes de för en mer detaljerad cell att skriva genom omvänd Transkription kvantitativa polymeraskedjereaktion (RT-qPCR) (figur 3B). Celltyp specifika primrar för EG (CD31, CD105, VE-cadherin och von Willebrands faktor [vWF]), leukocyter (CD45), epitelceller (cytokeratin [CK] -20) och smidig muskel celler/fibroblaster (desmin) användes (figur 3B). Använt denna qPCR-baserade cell maskinskrivning, en potentiell förorening av EG kulturerna av andra celler i intervallet 0,1 - 2%, beroende på celltyp av, kan vara upptäckta8.

Bland annat har vi tidigare rapporterat en förmånliga förlust av vWF proteinuttryck i TEC kulturer jämfört med deras motsvarande NEC kulturer7. Dessa fynd kunde bekräftas med protokollet nyinrättade isolering (figur 3C, menar Ct förlust NEC-TEC = 0.687, p = 0,173, parat t-test). Kulturer som framgångsrikt passerar dessa kvalitetskontroller testades för mycoplasma infektion och senare används för ytterligare experiment.

Figure 1
Figur 1 : Ren endotelceller kan isoleras från mänskliga normal kolon och CRC FACS-sortera. (A) flödesschema av de viktiga stegen i processen EG isolering. (B) fettvävnad (gul), andra icke-maligna delar, eller potentiellt nekrotisk vävnad delar (brun) togs bort från kirurgi preparatet (vänstra och mittersta panel) och tumören var desintegrerade in i kuber av 2-3 mm side längden före vävnad dissociation ( högra panelen). (C), den enda cellen suspension Hämtad efter vävnad dissociation (till vänster) var inkuberas i 24 h i cell kultur rätter. Senare, icke-anhängare celler togs bort genom skonsam tvättning med PBS (mellersta panelen) och cellerna odlades till 80-90% konfluens före FACS-sortering (höger panel). Bilder av den nedre panelen (C) förvärvades av fas kontrast mikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Genomsnitt 3,6-5.6% av enda cellsuspensionen isolerade från mänskliga patienter med CRC och sorterade FACS var triple-positiv EC. (A) NEC och TEC var FACS-sorteras med hjälp av en trippel märkning av cellerna med anti-CD31, - CD105 och -VE-cadherin antikroppar. (B) en medelvärdet av 12.500 TECs (n = 12) och 17,800 nationella Europass-centrum (n = 12) kan isoleras från mänskliga normal kolon eller CRC använder FACS-sortering (CD31, CD105 och VE-cadherin-positiva celler, vänster panel), som utgör i genomsnitt 3,6 och 5,6% (höger panel) av cellen Summa befolkningen sysselsatt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : NEC och TEC från mänskliga CRC express typiska endotelceller markörer. Normal kolon endotelceller (NEC, n = 10) och tumör endotelceller (TEC, n = 10) från mänskliga CRC är CD31 (EG markör)-, CD105 (EG markör)-, VE-cadherin (EG markör)-, vWF (EG markör) - positiva och CK20 (CRC cell markör)-, desmin (fibroblast/SMC markör)-, CD45 () leukocyt markör)-negativa som bestäms av (A) CD31-immuncytokemi (positiva celler = röd) och (B) RT-qPCR (datapunkter under den streckade linjen är prover upptäckt vara negativt). (C) vWF uttryck som bestäms av RT-qPCR för motsvarande TEC/NEC prover från samma patienter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Främst, har tre olika metoder använts hittills att isolera ren och livskraftiga nationella Europass-centrum och TECs från fasta vävnader, nämligen (1) immunmagnetisk berikning, (2) laser lokalt och (3) FACS-sortering i bråket som EG. I de flesta publikationer var immunmagnetisk anrikning av cellerna efter generation av en enda cellsuspension av mekanisk sönderdelning används11,12,13. Exempelvis immunmagnetisk rening av mänskliga dermal mikrovaskulära EG (HDMEC) av E-selektin antikroppar efter tumörnekrosfaktor (TNF)-α behandling från neonatal förhudarna13 har rapporterats för isolering av mänskliga EG från gliom av vävnad smälta, percoll lutning och markering med anti-CD31/CD105 och VE-cadherin-antikroppar12, eller av anti-CD105 antikroppar från mänskliga bröstcancer carcinom11. Protokoll som anställd laser lokalt eller FACS-sortering har rapporterats mindre ofta. Laser lokalt användes, till exempel för att identifiera potentiella pan-tumör endotelceller markörer (TEMs) i EG härrör från mänskliga kolorektal carcinom med analys av cellerna omedelbart efter dissektion9. FACS-sortering med anti-CD31-antikroppar var framgångsrikt demonstrerad för isolering av den EG-fraktionen från odifferentierad mänskliga embryonala stamceller14.

Dessa metoder har olika fördelar och nackdelar som måste beaktas. Fördelarna för den immunmagnetisk synsätt är att ingen utstuderad utrustning krävs, valet kan genomföras när som helst och cell berikning är snabb (ca 15 min) jämfört med FACS-sortering (ca 1 h). Bristen på matris för en längre tidsperiod kan inducera celldöd av EG genom anoikis. Därför var tillägg av den rho tyrosinkinashämmare Y-27632 till FACS bufferten anställd för att förhindra cell anoikis15.

Nackdelarna med immunmagnetisk anrikning är att flera rundor av urval som krävs för att uppnå renhet över 99%. Dessutom krävs cell odling mellan rikedomar för cell återhämtning, vilket ökar åldern av kulturerna stödja kultur-inducerad artefakter. Laser lokalt har fördelen att celler kan användas omedelbart som minskar kultur-inducerad artefakter men omfattar risken för kontaminering av celler från intilliggande vävnad områden10. Dessutom är lokalt inte etablerad i varje laboratorium. Nackdelarna med metoden FACS-sortering-baserade omfatta liknar laser lokalt, att utrustningen är genomarbetade och kostnadsintensiv. Följaktligen kanske denna utrustning inte är tillgänglig när som helst. I en klinisk miljö, där tillgången på vävnaden i intresse inte planeras exakt, kan här lägga till ett mer ytterligare missgynnar.

De stora fördelarna med FACS-sortering är dock att andelen EG kan märkas av flera antikroppar parallellt. Således kan en stränga Usenets strategi vara anställd som kommer att garantera en hög renhet. Baserat på erfarenhet, var ingen att sortera i bråket som EG skyldig, i motsats till den tidigare Mac-baserat protokoll där flera rundor av urval hade att vara anställd. Detta ledde till en kraftigt minskad odling tid tills renhet från sex veckor (MACS strategi) till tre veckor i FACS strategi, vilket resulterar i en förbättrad cellviabilitet som möjliggör en långvarig tidsfönstret för analys. Slutligen, användning av FACS-sortering-baserade strategi, kan vara en förbättring av den totala isolering framgången uppnåtts (ökning med 12,5%). Sammanfattningsvis, baserat FACS-sortering strategi anställa 3 antikroppar parallellt efter vävnad sammanfattad av kombinerad mekanisk och enzymatisk vävnad matsmältning hade många fördelar som etablerat detta protokoll som metoden för val av isolering av TECs och nationella Europass-centrum från mänskliga kolorektal carcinom och kolon.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Vi tackar Christian Flierl, Katja Petter, Christina Schnürer (alla avdelningen för molekylär och experimentell kirurgi), Uwe Appelt, Michael Mroz (Core enhet FACS-sortering) och Simon Völkl (Core enhet FACS-Immunomonitoring) för utmärkt teknisk assistans. Detta arbete stöds av bidrag till sv/MS av tvärvetenskaplig centrum för klinisk forskning (IZKF) av universitetet medicinska Center Erlangen, den tyska forskningsfondens (DFG: för 2438, SP2) och den Lutz-Stiftung, av ett bidrag på Robert-Pfleger-Stiftung till VSS samt av bidrag till MS från den tyska forskningsfondens [DFG: KFO257 (delprojekt 4) SFB 796 (delprojekt B9)].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS 1x Gibco by Life Technologies 14175-053
Penicillin-streptomycin Gibco by Life Technologies 15140-122
amphotericin B Gibco by Life Technologies 15290-026
Scalpels, disposable Feather No. 23
gentleMACS octo dissociator Miltenyi Biotec 130-095-937
gentleMACS C-tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
human tumor dissociation kit Miltenyi Biotec 130-095-929
DMEM Gibco by Life Technologies 21969-035
EGM-2-MV BulletKit Lonza CC-3202
Cell strainer, 100 µm Falcon 352360
StemPro Accutase  Gibco by Life Technologies A11105-01
Cell counter, automated Coulter Counter Z1
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503
CD31-FITC BD Pharmingen 555445
CD144/VE-cadherin-PE BD Pharmingen 560410
CD105-APC BD Pharmingen 562408
gelatin from bovine skin Sigma-Aldrich G9391
FACS-Sorting device Beckman Coulter MoFlo XDP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).
  2. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  3. Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
  4. McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat Med. 9 (6), 713-725 (2003).
  5. Hurwitz, H., et al. Bevacizumab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin for metastatic colorectal cancer. N Engl J Med. 350 (23), 2335-2342 (2004).
  6. Naschberger, E., Schellerer, V. S., Rau, T. T., Croner, R. S., Stürzl, M. Isolation of endothelial cells from human tumors. Methods Mol Biol. 731, 209-218 (2011).
  7. Schellerer, V. S., et al. Endothelial cells of human colorectal cancer and healthy colon reveal phenotypic differences in culture. Lab Invest. 87 (11), 1159-1170 (2007).
  8. Naschberger, E., et al. Matricellular protein SPARCL1 regulates tumor microenvironment-dependent endothelial cell heterogeneity in colorectal carcinoma. J Clin Invest. 126 (11), 4187-4204 (2016).
  9. St Croix, B., et al. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).
  10. Christian, S., et al. Endosialin (Tem1) is a marker of tumor-associated myofibroblasts and tumor vessel-associated mural cells. Am J Pathol. 172 (2), 486-494 (2008).
  11. Grange, C., et al. Isolation and characterization of human breast tumor-derived endothelial cells. Oncol Rep. 15 (2), 381-386 (2006).
  12. Miebach, S., et al. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades. J Neurooncol. 76 (1), 39-48 (2006).
  13. Richard, L., Velasco, P., Detmar, M. A simple immunomagnetic protocol for the selective isolation and long-term culture of human dermal microvascular endothelial cells. Exp Cell Res. 240 (1), 1-6 (1998).
  14. Nourse, M. B., et al. VEGF induces differentiation of functional endothelium from human embryonic stem cells: implications for tissue engineering. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (1), 80-89 (2010).
  15. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).

Tags

Cancerforskning fråga 134 endotelceller fartyg kolorektal cancer tumör Normal kolon CD31 VE-cadherin CD105 FACS-sortering vävnad Dissociation tumör mikromiljö fibroblaster
Isolering av mänskliga Endothelial celler från Normal kolon och kolorektal carcinom - ett förbättrat protokoll
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Naschberger, E., Regensburger, D.,… More

Naschberger, E., Regensburger, D., Tenkerian, C., Langheinrich, M., Engel, F. B., Geppert, C., Hartmann, A., Grützmann, R., Schellerer, V. S., Stürzl, M. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol. J. Vis. Exp. (134), e57400, doi:10.3791/57400 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter