पूरे माउंट-वयस्क कान त्वचा के लिए फोकल माइक्रोस्कोप: एक मॉडल प्रणाली न्यूरो संवहनी Morphogenesis और प्रतिरक्षा कोशिका वितरण शाखाओं का अध्ययन करने के लिए
Summary
यहां, हम पूरे वयस्क माउस कान त्वचा में एक उच्च संकल्प पूरे माउंट इमेजिंग विधि का वर्णन है, जो हमें morphogenesis शाखाओं में बंटी और परिधीय नसों और रक्त वाहिकाओं के नमूनों की कल्पना करने के लिए सक्षम बनाता है, साथ ही प्रतिरक्षा सेल वितरण ।
Abstract
यहां, हम एक पूरी माउंट वयस्क कान त्वचा इमेजिंग तकनीक का एक प्रोटोकॉल के लिए व्यापक तीन आयामी न्यूरो संवहनी शाखाओं morphogenesis और patterning, साथ ही साथ एक सेलुलर स्तर पर प्रतिरक्षा सेल वितरण का अध्ययन प्रस्तुत करते हैं । परिधीय तंत्रिका और रक्त वाहिका संरचनात्मक संरचनाओं के वयस्क ऊतकों में विश्लेषण कार्यात्मक तंत्रिका संवहनी तारों की समझ में कुछ अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और घाव भरने के रूप में रोग की स्थिति में तंत्रिका संवहनी अध… एक उच्च जानकारीपूर्ण मॉडल प्रणाली के रूप में, हम वयस्क कान त्वचा है, जो विच्छेदन के लिए आसानी से सुलभ है पर हमारे अध्ययन ध्यान केंद्रित किया है । हमारे सरल और reproducible प्रोटोकॉल पूरी त्वचा में सेलुलर घटकों का एक सटीक चित्रण प्रदान करता है, जैसे परिधीय नसों (संवेदी axons, सहानुभूति axons, और Schwann कोशिकाओं), रक्त वाहिकाओं (endothelial कोशिकाओं और संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं ), और भड़काऊ कोशिकाओं । हमारा मानना है कि इस प्रोटोकॉल के लिए परिधीय नसों और रक्त वाहिकाओं में रूपात्मक विषमताओं की जांच के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अलग रोग की स्थिति के तहत वयस्क कान त्वचा में सूजन का मार्ग प्रशस्त होगा ।
Introduction
त्वचा तीन परतों के शामिल है: एपिडर्मिस, dermis और hypodermis । यह एक मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया गया है स्टेम सेल रखरखाव, भेदभाव का अध्ययन, और विकास में morphogenesis के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पुनर्जनन, tumorigenesis, और वयस्क में सूजन । त्वचा बड़े पैमाने पर संवहनी और innervated है कि परिधीय तंत्रिका तंत्र और संवहनी प्रणाली के विकास को अच्छी तरह से समंवित है ।
हम पहले से कई को बरकरार परिधीय नसों और उनके सेलुलर घटकों सहित रक्त वाहिकाओं का अध्ययन करने के लिए लेबलिंग के साथ एक पूरे माउंट भ्रूण त्वचा इमेजिंग तकनीक का प्रदर्शन किया है1,2,3, 4: संवेदी axons, सहानुभूति axons, नसों में Schwann कोशिकाओं, endothelial कोशिकाओं, pericytes, और रक्त वाहिकाओं में संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (VSMCs). angiogenesis के दौरान, एक प्राथमिक केशिका नेटवर्क गहन संवहनी रिमॉडलिंग से गुजरती है और एक पदानुक्रमित संवहनी शाखाकरण नेटवर्क में विकसित करता है । विकासशील dermis/hypodermis, परिधीय संवेदी नसों और नसों के साथ धमनियों शाखा तो धमनियों के निकट फार्म । के बाद पदानुक्रमित संवहनी नेटवर्क अच्छी तरह से VSMCs के साथ कवर किया जाता है, सहानुभूति नसों के साथ विस्तार और अंदर आना बड़े व्यास रक्त वाहिकाओं 1, 5, 6. विकासशील तंत्रिका और संवहनी प्रणालियों के बीच निकट संघ में महत्व के बावजूद, एक प्रमुख सवाल का पता क्या वयस्कों में विभिंन रोग स्थितियों में तंत्रिका संवहनी नेटवर्क के लिए होता गया है । एक तीन आयामी उच्च संकल्प इमेजिंग रोगजनन की सराहना करने के लिए आवश्यक है, साथ anatomically पहचानने शाखाओं में बंटी morphogenesis और patterning ।
वयस्क माउस त्वचा में ंयूरॉंस और संवहनी morphogenesis सामांयतः ऊतक अनुभाग धुंधला द्वारा विश्लेषण किया जाता है । अंय अध्ययनों का इस्तेमाल किया है पूरे-माउंट इमेजिंग त्वचा की परिधीय नसों और रक्त वाहिकाओं कल्पना करने के लिए, बालों के रोम के अलावा, वसामय ग्रंथियों, और arrector पिली मांसपेशियों7,8,9। हालांकि, वयस्क त्वचा की मोटाई यह मुश्किल अपनी पूरी गहराई से अधिक त्वचा का विश्लेषण करने के लिए बनाया गया है ।
वर्तमान अध्ययन में, हम वयस्क कान त्वचा की एक उपंयास उच्च संकल्प पूरे माउंट इमेजिंग विकसित करने के लिए इन चुनौतियों से उबरने । कान त्वचा विच्छेदन के लिए आसानी से सुलभ है और उसके बाद पूरे-अपनी पूरी गहराई से अधिक त्वचा की इमेजिंग माउंट । इस प्रकार, यह एक सरल और उच्च reproducible विधि है कि त्वचा में परिधीय तंत्रिका और संवहनी प्रणालियों के तीन आयामी वास्तुकला, व्यापक ठहराव माप के साथ तुलना करने के लिए लागू किया जा सकता है । हम प्रदर्शन किया है कि बड़े व्यास रक्त वाहिकाओं के साथ परिधीय संवेदी और सहानुभूति नसों के संरेखण वयस्क त्वचा में संरक्षित है । इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य को शाखाओं में बंटी morphogenesis कल्पना है, और परिधीय नसों और रक्त वाहिकाओं के पैटर्न, और साथ ही विभिंन स्थितियों में वयस्क माउस मॉडलों में एक सेलुलर स्तर पर प्रतिरक्षा सेल वितरण जैसे सूजन और उत्थान.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल न्यूरो संवहनी संरचनाओं और प्रतिरक्षा सेल वितरण के विश्लेषण के लिए वयस्क कान त्वचा के पूरे माउंट immunonohistochemical इमेजिंग का वर्णन । हमारा मानना है कि इस पद्धति के शोधकर्ताओं के लिए कई प्रयोगात्म?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रयोगशाला प्रबंधन और तकनीकी सहायता, जे हॉकिंस और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (NIH) के कर्मचारियों के लिए एस गिल धंयवाद माउस की देखभाल के साथ सहायता के लिए 50 पशु सुविधा का निर्माण, और प्रशासनिक सहायता के लिए आर रीड और एफ Baldrey । उनके कान त्वचा विच्छेदन प्रोटोकॉल बांटने के लिए भी एस मोतेगी और एम Udey को धंयवाद, संपादकीय मदद के लिए N जलता है, और स्टेम सेल की प्रयोगशाला और तकनीकी मदद और विचारशील चर्चा के लिए तंत्रिका संवहनी जीवविज्ञान के सदस्यों । Yamazaki को जापान सोसायटी ऑफ साइंस (JSPS) NIH-KAITOKU के प्रोत्साहन से समर्थन मिला । यह काम नेशनल हार्ट, लंग, और ब्लड इंस्टिट्यूट (HL005702-11 to Y.M.) के अंदर रिसर्च प्रोग्राम द्वारा सपोर्ट किया गया
Materials
| 10 x Phosphate Buffered Saline | KD Medical | RGE-3210 | PBS, without Ca2+/Mg2+ |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | HBSS, with Ca2+/Mg2+ |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in PBS |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Detergent |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | Component of blocking/washing buffer |
| Normal donkey serum | Jackson Immuno research | 017-000-121 | Component of blocking/washing buffer |
| Curved fine tweezers | Dumont | RS-5047 | |
| Curved tweezers | Integra Miltex Vantage | V918-782, V918-784 | |
| Filter Unit 0.45 mm | Thermo Scientific | 157-0045 | For filtration |
| 1 mL syringe | Coviden | 8881501400 | For filtration |
| Syringe filter Unit 0.22 mm | Millex-GV | SLGVR04NL | For filtration |
| ProLong Gold | Thermo Scientific | P36934 | Anti-fade mounting medium |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | For sealing |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Photoshop CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Illustrator CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Image J | NIH | Image processing software | |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | Millipore | MAB1398Z | Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | BD Pharmingen | 553369 | Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-aSMA antibody conjugated with cy-3 | Sigma | C6198 | Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500 |
| Anti-EphB1 antibody | Santa Cruz | sc-9319 | Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100 |
| Anti-neuron-specific Class III b-tubulin (Tuj1) | Abcam | AB18207 | Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-Tuj1 antibody | Covance | MMS-435P | Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody | Chemicon | AB152 | Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500 |
| Anti-Peripherin antibody | Chemicon | AB1530 | Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000 |
| Anti-CD11b antibody | Bio-Rad | MCA74G | Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50 |
| Anti-CD45 antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0451-85 | Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500 |
| Anti-CD3 antibody | Bio-Rad | MCA1477T | Rat IgG1, immune cell marker, 1:100 |
| Anti-CD45R (B220) antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0452 | Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200 |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A11122 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab13970 | Chicken polyclonal, 1:500 |
| Anti-b-gal antibody | Cappel | 55976 | Rabbit polyclonal, 1:5000 |
| Anti-RFP antibody | Abcam | Ab62341 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 | Jackson Immuno research | 127-605-160 | Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 | Jackson Immuno research | 112-585-167 | Rat polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 | Thermo Fisher Scientific | A21136 | Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250 |
References
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