Summary

Geheel-mount confocale microscopie voor volwassen oor huid: een modelsysteem om te studeren, Neuro-vasculaire vertakkende genuitdrukking en immuun cel distributie

Published: March 29, 2018
doi:

Summary

Hier beschrijven we een hoge resolutie geheel-mount beeldvorming methode in de hele volwassen muis oor huid, waarmee we kunnen visualiseren vertakkende genuitdrukking en patronen van perifere zenuwen en bloedvaten, evenals immuun cel distributie.

Abstract

Hier presenteren we een protocol van de huid van een geheel-mount volwassen oor imaging techniek om te bestuderen van de uitgebreide driedimensionale neuro-vasculaire vertakkende genuitdrukking en patronen, evenals immuun cel distributie op een cellulair niveau. De analyse van perifere zenuwen en bloedvat anatomische structuren in volwassen weefsels biedt sommige inzicht in het begrip van functionele neuro-vasculaire bedrading en neuro-vasculaire degeneratie in pathologische omstandigheden zoals de wondgenezing. Als een zeer informatief modelsysteem, hebben we onze studies gericht op volwassen oor huid, dat gemakkelijk toegankelijk zijn voor dissectie is. Onze eenvoudige en reproduceerbare protocol biedt een nauwkeurige voorstelling van de cellulaire componenten in de gehele huid, zoals de perifere zenuwen (sensorische axonen, sympathieke axonen en cellen van Schwann), bloedvaten (endotheliale cellen en vasculaire zachte spiercellen ), en ontstekingscellen. Wij geloven dat dit protocol zal de weg effenen naar onderzoeken morfologische afwijkingen in het perifere zenuwen en bloedvaten en de ontsteking in de huid van de volwassen oor onder verschillende pathologische condities.

Introduction

Huid bestaat uit drie lagen: de epidermis, de dermis en de hypodermis. Het is gebruikt als een modelsysteem om te studeren stamcel onderhoud, differentiatie en voedselproductie in ontwikkeling evenals de regeneratie, tumorvorming en ontstekingen bij volwassenen. Huid is rijkelijk gevacuoliseerd en geïnnerveerd zodanig zijn dat de ontwikkeling van het perifere zenuwstelsel en vasculaire systeem goed gecoördineerd.

Wij hebben eerder aangetoond een geheel-mount embryonale huid beeldvormende techniek met meerdere labelen om te studeren intact perifere zenuwen en bloedvaten, met inbegrip van hun cellulaire componenten1,2,3, 4: sensorische axonen, sympathieke axonen Schwann cellen in zenuwen, endotheliale cellen, pericytes en vasculaire zachte spiercellen (VSMCs) in de bloedvaten. Tijdens de angiogenese, een primaire capillaire netwerk ondergaat intensieve vasculaire remodeling en ontwikkelt zich tot een hiërarchisch vasculaire vertakkende netwerk. In de ontwikkelingslanden dermis/hypodermis, slagaders vertakken naast perifere sensoriële zenuwen en aders dan vormen grenzend aan de slagaders. Nadat het hiërarchische vasculaire netwerk grondig met VSMCs bedekt is, sympathische zenuwen uitbreiden langs en innervate grote diameter bloedvaten1,5,6. Ondanks het belang in de nauwe samenwerking tussen de ontwikkelingslanden nerveus en vasculaire systemen, een grote vraag geweest om te pakken wat gebeurt er met de neuro-vasculaire netwerken in diverse pathologische situaties bij volwassenen. Een driedimensionale high-resolution imaging is noodzakelijk om te waarderen de pathogenese, samen met anatomisch herkenbaar vertakkende genuitdrukking en patronen.

Neuronale en vasculaire morfogenese in volwassen muis huid is vaak geanalyseerd door weefsel sectie kleuring. Andere studies hebben geheel-mount beeldvorming van de huid gebruikt voor het visualiseren van de perifere zenuwen en bloedvaten, naast de haarzakjes sebaceous klieren en de arrector pili spieren7,8,9. Echter, de dikte van volwassen huid heeft het moeilijk gemaakt voor het analyseren van de huid over de gehele diepte.

In de huidige studie ontwikkelden we een nieuwe hoge resolutie geheel-mount beeldvorming van volwassen oor huid om deze uitdagingen te overwinnen. Oor huid is gemakkelijk toegankelijk zijn voor dissectie en latere geheel-mount beeldvorming van de huid over de gehele diepte. Dus, het is een eenvoudig en zeer reproduceerbare methode die kan worden toegepast om te vergelijken van driedimensionale architectuur van perifere zenuw- en vasculaire systemen in de huid, met uitgebreide kwantificering metingen. We toonden aan dat de uitlijning van perifere zintuiglijke en sympathische zenuwen met grote diameter bloedvaten bewaard in de volwassen huid gebleven is. Het doel van dit protocol is te visualiseren vertakkende genuitdrukking en de patronen van perifere zenuwen en bloedvaten, evenals de immuun cel distributie op een cellulair niveau in volwassen Muismodellen in verschillende omstandigheden zoals ontsteking en regeneratie weer gecontroleerd.

Protocol

Alle experimenten in deze sectie werden uitgevoerd onder goedkeuring van de National Heart, Lung, Blood Institute (NHLBI) Animal Care en gebruik Comité. 1. de volwassen muis oor huid collectie Volwassen muizen door kooldioxide (CO2) blootstelling in een gesloten kamer euthanaseren en bevestig de euthanasie door cervicale dislocatie.Opmerking: Het experiment volgt de National Institutes of Health (NIH) richtsnoer voor de methode van de euthanasie. Ontleden va…

Representative Results

Volwassen muis posterieure oor huid (figuur 1A) en anterior oor huid (figuur 1B) waren immunostained met antilichamen tegen αSMA (rood), Tuj1 (groen), en PECAM-1 (blauw). De huid van de posterieure was immunostained om te studeren van neuro-immuun distributie met behulp van antilichamen tegen CD11b (rood) en MBP (groen), samen met Tuj1 (blauw) (figuur 2A). Distributie van CD11b+ ontstekin…

Discussion

Dit protocol beschrijft de geheel-mount immunonohistochemical beeldvorming van volwassen oor huid voor de analyse van de neuro-vasculaire structuren en immuun cel distributie. Wij geloven dat deze methode heeft tal van voordelen voor onderzoekers te bestuderen vertakkende genuitdrukking en de patronen van de perifere zenuwen en bloedvaten, alsmede driedimensionale distributie huid componenten zoals immuuncellen en haar experimentele follikels. De resultaten van de beeldvorming kunnen worden gekwantificeerd aan de hand va…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken K. Gill voor het Laboratoriumbeheer en technische ondersteuning, J. Hawkins en het personeel van National Institutes of Health (NIH) gebouw 50 dier faciliteit voor de hulp bij de zorg van de muis, en R. Reed en F. Baldrey voor administratieve bijstand. Ook dank aan S. Motegi en M. Udey voor het delen van hun oor huid dissectie protocol, N. Burns voor redactionele hulp, en de leden van het laboratorium van de cel van de stam en Neuro-vasculaire biologie voor technische hulp en nadenkende bespreking. T. Yamazaki werd gesteund door de Japan-maatschappij voor de promotie van wetenschap (JSPS) NIH-KAITOKU. Dit werk werd gesteund door de intramurale programma van het onderzoek van de National Heart, Lung en bloed Instituut (HL005702-11 tot en met Y.M.)

Materials

10 x Phosphate Buffered Saline KD Medical RGE-3210 PBS, without Ca2+/Mg2+
Hank’s Balanced Salt Solution Gibco 14025-092 HBSS, with Ca2+/Mg2+
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 PFA, fixative, diluted in PBS
Triton X-100 Sigma X100 Detergent
Normal goat serum Gibco 16210064 Component of blocking/washing buffer
Normal donkey serum Jackson Immuno research 017-000-121 Component of blocking/washing buffer
Curved fine tweezers Dumont RS-5047
Curved tweezers Integra Miltex Vantage V918-782, V918-784
Filter Unit 0.45 mm Thermo Scientific 157-0045 For filtration
1 mL syringe Coviden 8881501400 For filtration
Syringe filter Unit 0.22 mm Millex-GV SLGVR04NL For filtration
ProLong Gold Thermo Scientific P36934 Anti-fade mounting medium
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180 For sealing
Dissecting microscope Leica MZ95
Confocal microscope Leica TCS SP5
Photoshop CC 2017 Adobe Graphics editor software
Illustrator CC 2017 Adobe Graphics editor software
Image J NIH Image processing software
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody Millipore MAB1398Z Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody BD Pharmingen 553369 Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-aSMA antibody conjugated with cy-3 Sigma C6198 Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500
Anti-EphB1 antibody Santa Cruz sc-9319 Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100
Anti-neuron-specific Class III b-tubulin (Tuj1) Abcam AB18207 Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500
Anti-Tuj1 antibody Covance MMS-435P Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500
Anti-MBP antibody Abcam AB40390 Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200
Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody Chemicon AB152 Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500
Anti-Peripherin antibody Chemicon AB1530 Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000
Anti-CD11b antibody Bio-Rad MCA74G Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50
Anti-CD45 antibody Thermo Fisher Scientific 14-0451-85 Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500
Anti-CD3 antibody Bio-Rad MCA1477T Rat IgG1, immune cell marker, 1:100
Anti-CD45R (B220) antibody Thermo Fisher Scientific 14-0452 Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200
Anti-GFP antibody Thermo Fisher Scientific A11122 Rabbit polyclonal, 1:300
Anti-GFP antibody Abcam Ab13970 Chicken polyclonal, 1:500
Anti-b-gal antibody Cappel 55976 Rabbit polyclonal, 1:5000
Anti-RFP antibody Abcam Ab62341 Rabbit polyclonal, 1:300
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A11034 Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 Jackson Immuno research 127-605-160 Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 Jackson Immuno research 112-585-167 Rat polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 Thermo Fisher Scientific A21136 Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250

References

  1. Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
  2. Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis. Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).
  3. Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo. J Vis Exp. , (2011).
  4. Yamazaki, T., et al. Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature. Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).
  5. Mukouyama, Y. S. Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places. J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).
  6. Li, W., et al. Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin. Dev Cell. 24, 359-371 (2013).
  7. Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. , e51749 (2014).
  8. Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin. J Vis Exp. , (2017).
  9. Liakath-Ali, K., et al. Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen. Nat Commun. 5, 3540 (2014).
  10. Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).
  11. Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).
  12. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).
  13. Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. Psoriasis: what we have learned from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).
  14. Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity. Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).
  15. O’Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. Mouse models of diabetic neuropathy. ILAR J. 54, 259-272 (2014).
  16. Yamazaki, T., et al. Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models. Sci Rep. 8, (2018).

Play Video

Cite This Article
Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution. J. Vis. Exp. (133), e57406, doi:10.3791/57406 (2018).

View Video