Intero-monta la microscopia confocale per la pelle dell'orecchio dell'adulto: un sistema modello per lo studio di morfogenesi di ramificazione Neuro-vascolare e la distribuzione delle cellule immuni

Sommario

Qui, descriviamo un metodo di imaging intero-monta ad alta risoluzione nella pelle dell'orecchio intero topo adulto, che consente di visualizzare la morfogenesi di ramificazione e patterning di nervi periferici e vasi sanguigni, come pure la distribuzione delle cellule immuni.

Abstract

Qui, presentiamo un protocollo di una pelle dell'orecchio dell'adulto intero-monta imaging tecnica per studiare la morfogenesi di ramificazione neuro-vascolare tridimensionale completa e patterning, come pure la distribuzione delle cellule immuni a livello cellulare. L'analisi della periferiche strutture anatomiche del nervo e dei vasi sanguigni nei tessuti adulti fornisce alcuni spunti per la comprensione della funzionale neuro-vascolare cablaggio e degenerazione neuro-vascolare in condizioni patologiche come la guarigione della ferita. Come sistema modello altamente informativo, abbiamo concentrato i nostri studi sulla pelle dell'orecchio dell'adulto, che è facilmente accessibile per la dissezione. Il nostro protocollo semplice e riproducibile fornisce una rappresentazione accurata dei componenti cellulari della pelle intera, come i nervi periferici (assoni sensoriali, simpatici assoni e le cellule di Schwann), vasi sanguigni (cellule endoteliali e cellule muscolari lisce vascolari ) e cellule infiammatorie. Crediamo che questo protocollo spianerà la strada per studiare le anomalie morfologiche in nervi periferici e dei vasi sanguigni così come l'infiammazione della pelle dell'orecchio dell'adulto sotto diverse condizioni patologiche.

Introduzione

Pelle è composto da tre strati: l'epidermide, derma e ipoderma. È stato utilizzato come sistema modello per studiare il mantenimento delle cellule staminali, la differenziazione e la morfogenesi in sviluppo come pure la rigenerazione, tumorigenesi e infiammazione in adulto. Pelle è riccamente vascolarizzata ed innervata tale che lo sviluppo del sistema nervoso periferico e sistema vascolare è ben coordinato.

Precedentemente abbiamo dimostrato una tecnica di imaging intero-monta embrionale della pelle con l'etichettatura più per studiare i nervi periferici intatti e vasi sanguigni, compresi i loro componenti cellulari¹

Protocollo

Tutti gli esperimenti in questa sezione sono stati eseguiti sotto approvazione dal National Heart, Lung e Blood Institute (NHLBI) Animal Care e Comitato di uso.

1. adulto Mouse orecchio pelle collezione

1. Eutanasia di topi adulti tramite l'esposizione di anidride carbonica (CO₂) in una camera chiusa e quindi confermare l'eutanasia di dislocazione cervicale.
   Nota: L'esperimento segue la Guida di riferimento di National Institutes of Health (NIH) per il metodo di eutanasia.
2. Sezionare l'orecchio dalla base e metterlo in un 35 x 10 mm² capsula di Petri contenente 2 mL di Hank bilanciato sale soluzione ....

Risultati

Pelle di topo adulto posteriore dell'orecchio (Figura 1A) e pelle anteriore dell'orecchio (Figura 1B) immunostained con anticorpi anti-αSMA (rosso), Tuj1 (verde) e PECAM-1 (blu). Pelle posteriore era immunostained per studiare neuro-immunitario distribuzione utilizzando anticorpi anti-CD11b (rosso) e MBP (verde), insieme a Tuj1 (blu) (Figura 2A). Distribuzione di CD11b⁺ cellule infiammator.......

Discussione

Questo protocollo descrive l'intero-monta immunonohistochemical imaging della pelle dell'orecchio dell'adulto per l'analisi delle strutture neuro-vascolari e la distribuzione delle cellule immuni. Crediamo che questo metodo presenta numerosi vantaggi sperimentali per i ricercatori a studiare la morfogenesi di ramificazione e la campitura di vasi sanguigni e nervi periferici, così come la distribuzione tridimensionale di componenti della pelle tra cui capelli e cellule del sistema immunitario follicoli. I risultati dell'i.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10 x soluzione salina tamponata con fosfato	KD Medical	RGE-3210	PBS, senza Ca2+/Mg2+
Hank' s Soluzione salina bilanciata	Gibco	14025-092	HBSS, con Ca2+/Mg2+
16% Paraformaldeide	Microscopia elettronica Sciences	15710	PFA, fissativo, diluito in PBS
Triton X-100	Sigma	X100	Detergente
Siero di capra normale	Gibco	16210064	Componente del tampone bloccante/lavaggio
Normale siero d'asino	Jackson Immuno research	017-000-121	Componente del tampone bloccante/lavaggio
Pinzetta fine curva	Dumont	RS-5047
Pinzetta curva	Integra Miltex Vantage	V918-782, V918-784
Unità filtro 0,45 mm	Thermo Scientific	157-0045	Per filtrazione
Siringa da 1 mL	Coviden	8881501400	Per filtrazione
Siringa filtro Unità 0,22 mm	Millex-GV	SLGVR04NL	Per filtrazione
ProLong Gold	Thermo Scientific	P36934	Mezzo di montaggio anti-sbiadimento
Smalto per unghie	Microscopia elettronica Scienze	72180	Per
sigillatura Microscopio da dissezione	Leica	MZ95
Microscopio confocale	Leica	TCS SP5
Photoshop CC 2017	Software di editor	Adobe
Illustrator CC 2017	Software di editor	Adobe
Image J	NIH		Software di elaborazione delle immagini
Anticorpo anti-PECAM-1 (CD31) Anticorpo	Millipore	MAB1398Z	Criceto IgG, marcatore di cellule endoteliali vascolari, anticorpo 1:300
Anti-PECAM-1 (CD31)	BD Pharmingen	553369	IgG2a kappa di ratto, marcatore di cellule endoteliali vascolari, anticorpo 1:300
Anti-αSMA coniugato con cy-3	Sigma	C6198	IgG2a di topo, marcatore di cellule muscolari lisce vascolari, anticorpo 1:500
Anti-EphB1	Santa Cruz	sc-9319	Policlonale di capra, marcatore di cellule endoteliali venose, 1:100
Anti-neuron-specific Classe III β-tubulina (Tuj1)	Abcam	AB18207	Tuj1, IgG policlonali di coniglio, marcatore panassonale,
anticorpo anti-Tuj1	Covance	MMS-435P	IgG2a di topo, marcatore panassonale, anticorpo anti-MBP 1:500
	Abcam	AB40390	IgG policlonali di coniglio, marcatore di mielinizzazione, 1:200
Anticorpo anti-tirosina idrossilasi	Chemicon	AB152	Policlonale di coniglio, marcatore di neuroni simpatici, 1:500
Anticorpo anti-periferina	Chemicon	AB1530	Policlonale di coniglio, marcatore di neuroni periferici, 1:1000
Anticorpo anti-CD11b	Bio-Rad	MCA74G	Rat IgG2b, marcatore cellulare infiammatorio (macrofagi), 1:50
Anticorpo Anti-CD45	Thermo Fisher Scientific	14-0451-85	Rat IgG2b kappa, marcatore di cellule pan-ematopoietiche, 1:500
Anticorpo Anti-CD3	Bio-Rad	MCA1477T	IgG1 di ratto, marcatore di cellule immunitarie, anticorpo 1:100
Anti-CD45R (B220)	Thermo Fisher Scientific	14-0452	IgG2a kappa di ratto, marcatore di cellule infiammatorie, anticorpo anti-GFP 1:200
	Thermo Fisher Scientific	A11122	Policlonale di coniglio, 1:300
Anticorpo anti-GFP	Abcam	Ab13970	Policlonale di pollo, 1:500
Anti-946;-gal anticorpo	Cappel	55976	Policlonale di coniglio, 1:5000
Anticorpo anti-RFP	Abcam	Ab62341	Policlonale di coniglio, 1:300
IgG (H+L) anti-coniglio di capra Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A11034	Anticorpo secondario policlonale di coniglio, 1:250
IgG (H+L) anti-criceto di capra Alexa 647	Jackson Immuno research	127-605-160	Anticorpo secondario policlonale di criceto, 1:250
Capra anti-ratto IgG (H+L) Alexa 594	Jackson Immuno research	112-585-167	Anticorpo secondario policlonale di ratto, 1:250
Capra anti-topo IgG2a Alexa 633	Thermo Fisher Scientific	A21136	IgG2a di topo, 1:250

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