Summary

Toda a montagem em microscopia Confocal para pele da orelha do adulto: um sistema de modelo para estudar a morfogênese Neuro-vasculares de ramificação e distribuição de células imunes

Published: March 29, 2018
doi:

Summary

Aqui, descrevemos um método de imagem de toda a montagem de alta resolução da pele de orelha inteira rato adulto, que nos permite visualizar ramificação morfogênese e padronização de nervos periféricos e os vasos sanguíneos, bem como a distribuição de células imunes.

Abstract

Aqui, apresentamos um protocolo de uma pele de orelha do adulto de toda a montagem de imagem técnica para estudo abrangente tridimensional neuro-vascular ramificação morfogênese e padronização, bem como a distribuição de células imunes a um nível celular. A análise das estruturas anatômicas nervos e dos vasos sanguíneos periféricas em tecidos adultos fornece alguns insights sobre a compreensão da fiação neuro-vascular funcional e degeneração neuro-vascular em condições patológicas como a cicatrização de feridas. Como um sistema modelo altamente informativa, focamos nossos estudos na pele da orelha do adulto, que é facilmente acessível para dissecação. Nosso protocolo simples e reprodutível fornece uma descrição exata dos componentes celulares da pele inteira, tais como os nervos periféricos (axônios sensoriais, simpáticos axônios e células de Schwann), vasos sanguíneos (células endoteliais e células de músculo liso vascular ) e células inflamatórias. Acreditamos que este protocolo irá pavimentar o caminho para investigar as anormalidades morfológicas nos nervos periféricos e os vasos sanguíneos, bem como a inflamação da pele da orelha do adulto sob diferentes condições patológicas.

Introduction

Pele é composta por três camadas: epiderme, derme e hipoderme. Ela tem sido usada como um sistema modelo para estudar a manutenção de células-tronco, diferenciação e morfogênese em desenvolvimento, bem como a regeneração tumorigênese e inflamação em adultos. Pele é ricamente vascularizada e inervada tal que o desenvolvimento do sistema vascular e sistema nervoso periférico é bem coordenado.

Nós demonstramos anteriormente uma técnica de imagem de montagem em toda a pele embrionária com múltiplos rotulagem para estudar os nervos periféricos intactos e os vasos sanguíneos, incluindo seus componentes celulares1,2,3, 4: axônios sensoriais, simpáticos axônios, células em nervos Schwann, células endoteliais, pericitos e células de músculo liso vascular (VSMCs) nos vasos sanguíneos. Durante a angiogênese, uma rede capilar primária sofre remodelação vascular intensivo e se desenvolve em uma rede hierárquica de ramificação vascular. Na derme/hipoderme em desenvolvimento, as artérias ramificam ao lado de veias e nervos sensoriais periféricos dão forma então adjacentes às artérias. Depois que a rede vascular hierárquica é completamente coberta com VSMCs, nervos simpáticos se estendem ao longo e inervam os vasos sanguíneos de grande diâmetro1,5,6. Apesar da importância da associação estreita entre os sistemas nervosos e vasculares em desenvolvimento, uma grande questão tem sido a abordar o que acontece com as redes neuro-vascular em diversas situações patológicas em adultos. Uma imagem tridimensional de alta resolução é necessária apreciar a patogênese, juntamente com a morfogênese ramificação anatomicamente reconhecível e padronização.

Morfogênese neuronal e vascular em pele de rato adulto é comumente analisada pela coloração de secção de tecido. Outros estudos utilizaram imagens de toda a montagem da pele para visualizar os nervos periféricos e dos vasos sanguíneos, além dos folículos pilosos, glândulas sebáceas e arrector pili músculos7,8,9. No entanto, a espessura da pele adulta tornou difícil analisar a pele ao longo de toda a sua profundidade.

No presente estudo, nós desenvolvemos uma romance de alta resolução de imagem toda a montagem da pele da orelha do adulto para superar estes desafios. Pele da orelha é prontamente acessível para dissecção e subsequente de imagem de toda a montagem da pele ao longo de toda a sua profundidade. Assim, é um método simples e altamente reprodutível que pode ser aplicado para comparar a arquitetura tridimensional dos sistemas nervoso e vasculares periféricas na pele, com medidas de quantificação abrangente. Demonstrámos que o alinhamento dos nervos periféricos sensoriais e simpáticos com os vasos sanguíneos de grande diâmetro é preservado na pele adulta. O objetivo do presente protocolo é Visualizar ramificação morfogênese e a padronização dos nervos periféricos e os vasos sanguíneos, bem como a distribuição de células imunes a um nível celular em modelos do rato adulto em várias condições, tais como inflamação e regeneração.

Protocol

Todos os experimentos nesta seção foram realizados sob aprovação do nacional do coração, pulmão e cuidado do Animal de sangue Institute (NHLBI) e Comité de uso. 1. coleção de pele de orelha de rato adulto Eutanásia em ratos adultos pela exposição de dióxido de carbono (CO2) em uma câmara fechada e em seguida, confirme a eutanásia por deslocamento cervical.Nota: O experimento segue a diretriz do National Institutes of Health (NIH) para o método de eutan…

Representative Results

Pele de rato adulto orelha posterior (figura 1A) e pele de orelha anterior (figura 1B) foram immunostained com anticorpos αSMA (vermelho), Tuj1 (verde) e PECAM-1 (azul). Pele posterior foi immunostained para estudar a distribuição de neuro-imune usando anticorpos anti-CD11b (vermelho) e MBP (verde), juntamente com Tuj1 (azul) (Figura 2A). Distribuição de CD11b+ células inflamatórias…

Discussion

Este protocolo descreve a imagem de toda a montagem immunonohistochemical de pele de orelha do adulto para a análise das estruturas neuro-vasculares e distribuição de células imunes. Acreditamos que este método tem várias vantagens experimentais aos pesquisadores estudar ramificação morfogênese e a padronização de nervos periféricos e os vasos sanguíneos, bem como a distribuição tridimensional dos componentes da pele, incluindo o cabelo e células do sistema imunológico folículos. Os resultados da imagem…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a K. Gill para a gestão do laboratório e suporte técnico, J. Hawkins e os funcionários dos institutos nacionais de saúde (NIH) facilidade do edifício 50 animais de assistência com cuidados de rato e R. Reed e F. Bernardo para assistência administrativa. Obrigado também a Motegi S. e M. Udey por compartilhar o seu protocolo de dissecação de pele orelha, s. Burns para ajuda editorial e membros do laboratório de células-tronco e biologia Neuro-Vascular para ajuda técnica e discussão pensativo. T. Yamazaki foi apoiado pela sociedade de Japão para a promoção da ciência (JSPS) NIH-KAITOKU. Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa Intramural de nacional do coração, pulmão e Instituto de sangue (HL005702-11 para Y.M.)

Materials

10 x Phosphate Buffered Saline KD Medical RGE-3210 PBS, without Ca2+/Mg2+
Hank’s Balanced Salt Solution Gibco 14025-092 HBSS, with Ca2+/Mg2+
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 PFA, fixative, diluted in PBS
Triton X-100 Sigma X100 Detergent
Normal goat serum Gibco 16210064 Component of blocking/washing buffer
Normal donkey serum Jackson Immuno research 017-000-121 Component of blocking/washing buffer
Curved fine tweezers Dumont RS-5047
Curved tweezers Integra Miltex Vantage V918-782, V918-784
Filter Unit 0.45 mm Thermo Scientific 157-0045 For filtration
1 mL syringe Coviden 8881501400 For filtration
Syringe filter Unit 0.22 mm Millex-GV SLGVR04NL For filtration
ProLong Gold Thermo Scientific P36934 Anti-fade mounting medium
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180 For sealing
Dissecting microscope Leica MZ95
Confocal microscope Leica TCS SP5
Photoshop CC 2017 Adobe Graphics editor software
Illustrator CC 2017 Adobe Graphics editor software
Image J NIH Image processing software
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody Millipore MAB1398Z Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody BD Pharmingen 553369 Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-aSMA antibody conjugated with cy-3 Sigma C6198 Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500
Anti-EphB1 antibody Santa Cruz sc-9319 Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100
Anti-neuron-specific Class III b-tubulin (Tuj1) Abcam AB18207 Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500
Anti-Tuj1 antibody Covance MMS-435P Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500
Anti-MBP antibody Abcam AB40390 Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200
Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody Chemicon AB152 Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500
Anti-Peripherin antibody Chemicon AB1530 Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000
Anti-CD11b antibody Bio-Rad MCA74G Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50
Anti-CD45 antibody Thermo Fisher Scientific 14-0451-85 Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500
Anti-CD3 antibody Bio-Rad MCA1477T Rat IgG1, immune cell marker, 1:100
Anti-CD45R (B220) antibody Thermo Fisher Scientific 14-0452 Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200
Anti-GFP antibody Thermo Fisher Scientific A11122 Rabbit polyclonal, 1:300
Anti-GFP antibody Abcam Ab13970 Chicken polyclonal, 1:500
Anti-b-gal antibody Cappel 55976 Rabbit polyclonal, 1:5000
Anti-RFP antibody Abcam Ab62341 Rabbit polyclonal, 1:300
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A11034 Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 Jackson Immuno research 127-605-160 Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 Jackson Immuno research 112-585-167 Rat polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 Thermo Fisher Scientific A21136 Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250

References

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Cite This Article
Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution. J. Vis. Exp. (133), e57406, doi:10.3791/57406 (2018).

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