Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Geheel-mount confocale microscopie voor volwassen oor huid: een modelsysteem om te studeren, Neuro-vasculaire vertakkende genuitdrukking en immuun cel distributie

doi: 10.3791/57406 Published: March 29, 2018

Summary

Hier beschrijven we een hoge resolutie geheel-mount beeldvorming methode in de hele volwassen muis oor huid, waarmee we kunnen visualiseren vertakkende genuitdrukking en patronen van perifere zenuwen en bloedvaten, evenals immuun cel distributie.

Abstract

Hier presenteren we een protocol van de huid van een geheel-mount volwassen oor imaging techniek om te bestuderen van de uitgebreide driedimensionale neuro-vasculaire vertakkende genuitdrukking en patronen, evenals immuun cel distributie op een cellulair niveau. De analyse van perifere zenuwen en bloedvat anatomische structuren in volwassen weefsels biedt sommige inzicht in het begrip van functionele neuro-vasculaire bedrading en neuro-vasculaire degeneratie in pathologische omstandigheden zoals de wondgenezing. Als een zeer informatief modelsysteem, hebben we onze studies gericht op volwassen oor huid, dat gemakkelijk toegankelijk zijn voor dissectie is. Onze eenvoudige en reproduceerbare protocol biedt een nauwkeurige voorstelling van de cellulaire componenten in de gehele huid, zoals de perifere zenuwen (sensorische axonen, sympathieke axonen en cellen van Schwann), bloedvaten (endotheliale cellen en vasculaire zachte spiercellen ), en ontstekingscellen. Wij geloven dat dit protocol zal de weg effenen naar onderzoeken morfologische afwijkingen in het perifere zenuwen en bloedvaten en de ontsteking in de huid van de volwassen oor onder verschillende pathologische condities.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Huid bestaat uit drie lagen: de epidermis, de dermis en de hypodermis. Het is gebruikt als een modelsysteem om te studeren stamcel onderhoud, differentiatie en voedselproductie in ontwikkeling evenals de regeneratie, tumorvorming en ontstekingen bij volwassenen. Huid is rijkelijk gevacuoliseerd en geïnnerveerd zodanig zijn dat de ontwikkeling van het perifere zenuwstelsel en vasculaire systeem goed gecoördineerd.

Wij hebben eerder aangetoond een geheel-mount embryonale huid beeldvormende techniek met meerdere labelen om te studeren intact perifere zenuwen en bloedvaten, met inbegrip van hun cellulaire componenten1,2,3, 4: sensorische axonen, sympathieke axonen Schwann cellen in zenuwen, endotheliale cellen, pericytes en vasculaire zachte spiercellen (VSMCs) in de bloedvaten. Tijdens de angiogenese, een primaire capillaire netwerk ondergaat intensieve vasculaire remodeling en ontwikkelt zich tot een hiërarchisch vasculaire vertakkende netwerk. In de ontwikkelingslanden dermis/hypodermis, slagaders vertakken naast perifere sensoriële zenuwen en aders dan vormen grenzend aan de slagaders. Nadat het hiërarchische vasculaire netwerk grondig met VSMCs bedekt is, sympathische zenuwen uitbreiden langs en innervate grote diameter bloedvaten1,5,6. Ondanks het belang in de nauwe samenwerking tussen de ontwikkelingslanden nerveus en vasculaire systemen, een grote vraag geweest om te pakken wat gebeurt er met de neuro-vasculaire netwerken in diverse pathologische situaties bij volwassenen. Een driedimensionale high-resolution imaging is noodzakelijk om te waarderen de pathogenese, samen met anatomisch herkenbaar vertakkende genuitdrukking en patronen.

Neuronale en vasculaire morfogenese in volwassen muis huid is vaak geanalyseerd door weefsel sectie kleuring. Andere studies hebben geheel-mount beeldvorming van de huid gebruikt voor het visualiseren van de perifere zenuwen en bloedvaten, naast de haarzakjes sebaceous klieren en de arrector pili spieren7,8,9. Echter, de dikte van volwassen huid heeft het moeilijk gemaakt voor het analyseren van de huid over de gehele diepte.

In de huidige studie ontwikkelden we een nieuwe hoge resolutie geheel-mount beeldvorming van volwassen oor huid om deze uitdagingen te overwinnen. Oor huid is gemakkelijk toegankelijk zijn voor dissectie en latere geheel-mount beeldvorming van de huid over de gehele diepte. Dus, het is een eenvoudig en zeer reproduceerbare methode die kan worden toegepast om te vergelijken van driedimensionale architectuur van perifere zenuw- en vasculaire systemen in de huid, met uitgebreide kwantificering metingen. We toonden aan dat de uitlijning van perifere zintuiglijke en sympathische zenuwen met grote diameter bloedvaten bewaard in de volwassen huid gebleven is. Het doel van dit protocol is te visualiseren vertakkende genuitdrukking en de patronen van perifere zenuwen en bloedvaten, evenals de immuun cel distributie op een cellulair niveau in volwassen Muismodellen in verschillende omstandigheden zoals ontsteking en regeneratie weer gecontroleerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle experimenten in deze sectie werden uitgevoerd onder goedkeuring van de National Heart, Lung, Blood Institute (NHLBI) Animal Care en gebruik Comité.

1. de volwassen muis oor huid collectie

  1. Volwassen muizen door kooldioxide (CO2) blootstelling in een gesloten kamer euthanaseren en bevestig de euthanasie door cervicale dislocatie.
    Opmerking: Het experiment volgt de National Institutes of Health (NIH) richtsnoer voor de methode van de euthanasie.
  2. Ontleden van het oor van de base en plaats deze in een 35 x 10 mm2 petrischaal met 2 mL van Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS). Kort knippen haren met een schaar.
  3. Schil de posterieure huid en anterior huid weg zorgvuldig van de tussenliggende kraakbeen.
    Opmerking: Kraakbeen hecht aan de voorste huid.
  4. Breng de posterior en anterior huid afzonderlijk tot en met een goed 24 plaat met 1 mL van de ijskoude verse 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) per putje. Afvlakken van de posterieure en anterieure huid in de 4% PFA.
  5. Fix het posterieure en anterieure huid met kraakbeen bij 4 ° C gedurende 1 uur.
  6. Wassen van de huid van het posterieure en anterieure 3 keer gedurende 5 minuten in 1 mL PBS met zacht mengen op een mixer bij kamertemperatuur.
  7. De posterieure en anterieure huid met kraakbeen aan de onderkant van een 35 x 10 mm2 petrischaal overdragen. Afgesneden de basis regio, die is gevouwen en heeft adipeus en bindweefsel. Het kraakbeen van anterior huid met behulp van fijn gebogen pincet afschilferen.
  8. Verwijder voorzichtig de haren, vetweefsel en bindweefsel vanaf de binnenkant van de posterieure huid met behulp van fijn gebogen pincet. Houd de huid nat met PBS.

2. geheel-mount immunohistochemische kleuring van muis oor huid

Opmerking: Alle experimenten in de volgende gedeelten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de veiligheid van het laboratorium van NIH.

  1. De buffer met blokkerend voor te bereiden. Filter 10% warmte geïnactiveerd geit serum (HIGS) verdund in PBS met 0,2% triton blokkeerbuffer X-100 (TX-100) of 10% ezel serum (DS) verdund in PBS met 0,2% TX-100 blokkeerbuffer, met behulp van een 0,45 µm filter eenheid.
  2. Breng de posterior en anterior huid tot een 24 goed plaat met 1 mL 10% HIGS blokkeerbuffer of 10% DS blokkeerbuffer per putje. Incubeer de huid voor 30 min met zacht mengen op een mixer bij kamertemperatuur.
  3. Bereid de primair antilichaam-oplossing door het verdunnen van de primaire antilichamen (Tabel van materialen) in blokkeerbuffer (ofwel 10% HIGS of 10% DS).
    Opmerking: Geheel-mout immunohistochemische analyse van volwassen oor huid met antilichamen tegen pan-neuronale marker neuron-specifieke klasse III β-tubuline (Tuj1, konijn polyklonale IgG of muis monocloncal IgG2a, 1:500 verdunning op de uiteindelijke concentratie van 2 µg/mL), pan-endothelial cel marker bloedplaatjes endothelial cel adhesie molecuul 1 (PECAM-1, hamster monoclonal IgG, 1:300 verdunning op de uiteindelijke concentratie van 3.3 µg/mL), myelineschede marker myeline fundamentele eiwit (MBP, konijn polyklonale IgG, 1:200 verdunning in de eindconcentratie van 5 µg/mL) en inflammatoire myeloïde cel marker CD11b (Rat monoclonal IgG2b, 1:50 verdunning op de uiteindelijke concentratie van 20 µg/mL) was te zien in Figuur 1 en Figuur 2. De huid was geïncubeerd met Cy3-geconjugeerde antilichaam voor vasculaire glad spierweefsel cel marker α glad spierweefsel actine (αSMA) samen met secundaire antilichamen (2.6). De primaire antilichamen getest door onszelf werden vermeld in de Tabel van materialen. Meerdere primaire antilichamen afgeleid van verschillende species kunnen gelijktijdig worden gemengd.
  4. De posterieure en anterieure huid overdragen aan nieuwe putje met 150 µL van de primaire antilichamen oplossing. Incubeer de huid met zacht mengen op een mixer bij 4 ° C's nachts.
  5. De volgende dag, het posterieure en anterieure huid overbrengen naar nieuwe putten in de 24 goed plaat of gecombineerd de buffer met blokkerend met primaire antilichamen. Voeg 1 mL ofwel 2% HIGS verdund in PBS met 0,2% TX-100 wassen buffer of 2% DS verdund in PBS met 0,2% TX-100 wassen buffer. Wassen van de huid met 3 veranderingen van de buffer wassen elke 15 min met zacht mengen op een mixer bij kamertemperatuur.
  6. Bereid de oplossing van secundair antilichaam (Tabel van materialen). Verdun secundaire antilichamen in de blokkeerbuffer (ofwel 10% HIGS of 10% DS) en filter de buffer met blokkerend met secundaire antilichamen door een 0,22 µm Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride spuit membraanfilter met een spuit van 1 mL verbonden.
    Opmerking: Alexa 488 of anti-konijn geit 633-geconjugeerde IgG (H + L) of IgG2a voor Tuj1, Alexa 647-geconjugeerde geit anti-hamster IgG (H + L) voor PECAM-1, Alexa 488-geconjugeerde geit anti-konijn IgG (H + L) voor MBP, muis en rat Alexa 594-geconjugeerde IgG (H + L) voor CD11b werden gebruikt met de verdunning van het 1:250 op de uiteindelijke concentratie van 8 µg/mL. De huid was geïncubeerd met αSMA Cy3-geconjugeerde antilichaam (1:500 verdunning op de uiteindelijke concentratie van 2-3 µg/mL) in combinatie met deze secundaire antilichamen.
  7. De oplossing bij 13.000 x g gedurende 10 minuten geaggregeerde om deeltjes te verwijderen van de secundaire antilichamen van de buffer met blokkerend centrifugeren.
    Opmerking: Verschillende TL geconjugeerd secundaire antilichamen afgeleid van verschillende species kunnen gelijktijdig worden gemengd.
  8. Overbrengen in de huid van posterieure en anterieure putje met 150 µL van de secundaire antilichamen oplossing. De 24 goed plaat wikkel in aluminiumfolie te voorkomen licht en de huid voor 1 h met zacht mengen op een mixer bij kamertemperatuur incuberen.
  9. Overdracht van de posterieure en anterieure huid aan nieuwe putjes in de 24 goed plaat of gecombineerd de secundair antilichaam oplossing door Pipetteer volledig. Voeg 1 mL 2% HIGS wassen buffer of 2% DS wassen buffer.
  10. De 24 goed plaat wikkel in aluminiumfolie en wassen met 3 wijzigingen van de buffer wassen elke 15 min met zacht mengen op een mixer bij kamertemperatuur.

3. montage van de oor-huid op dia

  1. Plaats de huid aan de onderkant van een 35 x 10 mm2 petrischaal. Verwijder voorzichtig de haren, vetweefsel, bindweefsels, stof en vezels uit de binnenkant van de huid met behulp van fijn gebogen pincet onder de stereomicroscoop met lage verlichting om te minimaliseren uitgebreide foto bleken. Houd de huid nat met PBS.
  2. De huid overbrengen in een zelfklevende microscoopglaasje met pincet. Plaats van de achterste en voorste huid met de binnenkant naar boven op de dia. Het afvlakken van de huid met behulp van de verlostang.
  3. Monteer de huid in een vloeibare anti-fade montage medium te voorkomen photobleaching en fluorescerende signalen behouden. Zorg ervoor dat geen luchtbellen op of rond de huid.
  4. Bedek met dekglaasje aan op de huid monsters zorgvuldig en opslaan van de gemonteerde huid voorbeelddia's in het donker 's nachts bij kamertemperatuur zodat de montage media krijgen vast. Zegel van het dekglaasje aan naar de dia met nagellak en het bewaren bij 4 ° C voor langdurige opslag.

4. confocale microscopie

  1. Passende lasers voor fluorophores instellen. Een confocal microscoop met drie laser bronnen (Argon 488 nm, DPSS 561 nm en HeNe 633 nm) wordt gebruikt in dit experiment.
  2. Gebruik de sequentiële scan-hulpprogramma, waarmee gelijktijdig triple gebeitste monsters prikkelt, overlappingen te vermijden.
    Opmerking: Afbeeldingen zullen worden genomen in een sequentiële wijze met behulp van de sequentiële scan-modus.
  3. Afbeelding onder een 10 X doelstelling. De tegel scan tool gebruiken om vast te leggen van de hele oor huid. Z-stack instellen en ervoor te zorgen dat de z-positie heeft betrekking op de gehele dikte van de huid van het oor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Volwassen muis posterieure oor huid (figuur 1A) en anterior oor huid (figuur 1B) waren immunostained met antilichamen tegen αSMA (rood), Tuj1 (groen), en PECAM-1 (blauw). De huid van de posterieure was immunostained om te studeren van neuro-immuun distributie met behulp van antilichamen tegen CD11b (rood) en MBP (groen), samen met Tuj1 (blauw) (figuur 2A). Distributie van CD11b+ ontstekingscellen, met inbegrip van macrofagen werd ontdekt op een enkele cellulaire resolutie (figuur 2B).

Figure 1
Figuur 1: uitlijning ofperipheral zenuwen en bloedvaten in de huid van de volwassen oor. Geheel-mount triple immunofluorescentie confocale microscopie van posterieure en anterieure oor huid met antilichamen tegen αSMA (rood), Tuj1 (groen), en PECAM-1 (blauw) wordt weergegeven. (A) VSMC bedekte grote-diameter bloedvaten uitlijnen met perifere zenuwen in de huid van het achterste oor. (B) kleinere diameter van bloedvaten, bedekt met VSMCs uitlijnen met kleinere diameter van perifere zenuwen bundels in de voorste oor huid. Schaal bar = 1 mm Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Myelinisering van de perifere zenuwen en CD11b+ myeloïde cel distributie in volwassen oor huid. Geheel-mount triple immunofluorescentie confocale microscopie van posterieure oor huid met antilichamen tegen CD11b (rood) en MBP (groen), samen met Tuj1 (blauw), wordt weergegeven. (A) Medium tot grote diameter perifere zenuwen zijn myelinated. (B) Close-up beeld in (A). CD11b+ ontstekingscellen gelijkmatig verdelen in de huid van het achterste oor. Schaal bar = 1 mm (B), 100 µm (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dit protocol beschrijft de geheel-mount immunonohistochemical beeldvorming van volwassen oor huid voor de analyse van de neuro-vasculaire structuren en immuun cel distributie. Wij geloven dat deze methode heeft tal van voordelen voor onderzoekers te bestuderen vertakkende genuitdrukking en de patronen van de perifere zenuwen en bloedvaten, alsmede driedimensionale distributie huid componenten zoals immuuncellen en haar experimentele follikels. De resultaten van de beeldvorming kunnen worden gekwantificeerd aan de hand van imaging software voor verdere kwantitatieve analyse.

Een goede voorbereiding van de huid van het oor is van cruciaal belang voor het welslagen van dit protocol. Ten eerste moet de oor huid zorgvuldig worden ontleed kort na het euthanizing van de muis. Het achterste gedeelte van het oor huid moet worden gepeld uit de buurt van het kraakbeen. Vervolgens moet het kraakbeen worden gepeld uit van anterior huid vóór de kleuring. Ten tweede, bindweefsels, vetweefsel en haren moeten worden verwijderd voorzichtig en grondig vóór montage. Als gevolg van het bestaan van perifere zenuwen op het oppervlak van de huid, is zorgvuldige verwijdering nodig om te voorkomen beschadiging van de zenuwen. Ten derde moet het oor-huid ongevouwen met de verwijdering van sommige dikke weefsels uit de huid van het oor. Tot slot moet het oor huid gemonteerde flat zonder luchtbellen.

Een beperking van dit protocol is dat de oor-gelabeld oor huid niet geschikt voor de analyse is als oormerk een gat of een litteken veroorzaakt. Daarom, is identificatie van muizen op verschillende manieren dan oormerk zoals etiketten op de staart is noodzakelijk, in het geval er meerdere muizen te analyseren.

De hele oor huid kan worden gescand door confocale microscopie met een tegel scan tool, hoewel een eerdere verslagen blijkt dat een gebied van belang met een hoge resolutie10image kan worden gemaakt. Interessant is dat de gehele-mount beeldvorming van de hele oor huid onthult verschillende vertakkende genuitdrukking en patronen van perifere zenuwen en bloedvaten tussen de achterste en voorste huid (Figuur 1): de posterieure huid heeft grote diameter zenuwen bundels (20 – 50 µm) afgestemd op verbouwd grote diameter van bloedvaten, bedekt met αSMA+ VSMCs (20 – 60 µm), terwijl de voorste huid heeft kleinere-diameter zenuw bundels (< 20 µm) afgestemd op kleinere-diameter maar gerenoveerd bloedvaten bedekt met αSMA+ VSMCs (< 20 µm).

Er zijn een opmerkelijk aantal muis modellen11 tot verheldering van het mechanisme van menselijke dermatologische aandoeningen zoals atopische dermatitis12, psoriasis13, wond genezing14, en diabetische neuropathie15. We hebben dit protocol toegepast op de huid van de oor van dieet-geïnduceerde obesitas muizen en typ 2 diabetesmuizen te studeren van diabetische neuropathie16. Dit protocol kan worden toegepast vanaf jonge volwassen muis huid in verscheidene pathologische condities.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken K. Gill voor het Laboratoriumbeheer en technische ondersteuning, J. Hawkins en het personeel van National Institutes of Health (NIH) gebouw 50 dier faciliteit voor de hulp bij de zorg van de muis, en R. Reed en F. Baldrey voor administratieve bijstand. Ook dank aan S. Motegi en M. Udey voor het delen van hun oor huid dissectie protocol, N. Burns voor redactionele hulp, en de leden van het laboratorium van de cel van de stam en Neuro-vasculaire biologie voor technische hulp en nadenkende bespreking. T. Yamazaki werd gesteund door de Japan-maatschappij voor de promotie van wetenschap (JSPS) NIH-KAITOKU. Dit werk werd gesteund door de intramurale programma van het onderzoek van de National Heart, Lung en bloed Instituut (HL005702-11 tot en met Y.M.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 x Phosphate Buffered Saline KD Medical RGE-3210 PBS, without Ca2+/Mg2+
Hank’s Balanced Salt Solution Gibco 14025-092 HBSS, with Ca2+/Mg2+
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 PFA, fixative, diluted in PBS
Triton X-100 Sigma X100 Detergent
Normal goat serum Gibco 16210064 Component of blocking/washing buffer
Normal donkey serum Jackson Immuno research 017-000-121 Component of blocking/washing buffer
Curved fine tweezers Dumont RS-5047
Curved tweezers Integra Miltex Vantage V918-782, V918-784
Filter Unit 0.45 mm Thermo Scientific 157-0045 For filtration
1 mL syringe Coviden 8881501400 For filtration
Syringe filter Unit 0.22 mm Millex-GV SLGVR04NL For filtration
ProLong Gold Thermo Scientific P36934 Anti-fade mounting medium
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180 For sealing
Dissecting microscope Leica MZ95
Confocal microscope Leica TCS SP5
Photoshop CC 2017 Adobe Graphics editor software
Illustrator CC 2017 Adobe Graphics editor software
Image J NIH Image processing software
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody Millipore MAB1398Z Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody BD Pharmingen 553369 Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-αSMA antibody conjugated with cy-3 Sigma C6198 Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500
Anti-EphB1 antibody Santa Cruz sc-9319 Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100
Anti-neuron-specific Class III β-tubulin (Tuj1) Abcam AB18207 Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500
Anti-Tuj1 antibody Covance MMS-435P Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500
Anti-MBP antibody Abcam AB40390 Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200
Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody Chemicon AB152 Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500
Anti-Peripherin antibody Chemicon AB1530 Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000
Anti-CD11b antibody Bio-Rad MCA74G Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50
Anti-CD45 antibody Thermo Fisher Scientific 14-0451-85 Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500
Anti-CD3 antibody Bio-Rad MCA1477T Rat IgG1, immune cell marker, 1:100
Anti-CD45R (B220) antibody Thermo Fisher Scientific 14-0452 Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200
Anti-GFP antibody Thermo Fisher Scientific A11122 Rabbit polyclonal, 1:300
Anti-GFP antibody Abcam Ab13970 Chicken polyclonal, 1:500
Anti-β-gal antibody Cappel 55976 Rabbit polyclonal, 1:5000
Anti-RFP antibody Abcam Ab62341 Rabbit polyclonal, 1:300
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A11034 Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 Jackson Immuno research 127-605-160 Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 Jackson Immuno research 112-585-167 Rat polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 Thermo Fisher Scientific A21136 Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
  2. Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis. Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).
  3. Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo. J Vis Exp. (2011).
  4. Yamazaki, T., et al. Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature. Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).
  5. Mukouyama, Y. S. Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places. J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).
  6. Li, W., et al. Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin. Dev Cell. 24, 359-371 (2013).
  7. Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. e51749 (2014).
  8. Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin. J Vis Exp. (2017).
  9. Liakath-Ali, K., et al. Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen. Nat Commun. 5, 3540 (2014).
  10. Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).
  11. Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).
  12. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).
  13. Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. Psoriasis: what we have learned from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).
  14. Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity. Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).
  15. O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. Mouse models of diabetic neuropathy. ILAR J. 54, 259-272 (2014).
  16. Yamazaki, T., et al. Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models. Sci Rep. 8, (2018).
Geheel-mount confocale microscopie voor volwassen oor huid: een modelsysteem om te studeren, Neuro-vasculaire vertakkende genuitdrukking en immuun cel distributie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution. J. Vis. Exp. (133), e57406, doi:10.3791/57406 (2018).More

Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution. J. Vis. Exp. (133), e57406, doi:10.3791/57406 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter