Summary

Vollständig-hängen konfokalen Mikroskopie für Erwachsene Ohr Haut: ein Modellsystem, Neuro-vaskuläre Verzweigung Morphogenese und Immunzelle Verteilung zu studieren

Published: March 29, 2018
doi:

Summary

Hier beschreiben wir ein hohe Auflösung vollständig-hängen bildgebende Verfahren in der gesamten erwachsenen Maus Ohr Haut, die was uns ermöglicht, verzweigte Morphogenese und Strukturierung der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie Immunzelle Verteilung zu visualisieren.

Abstract

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll einer ganzen-Mount Erwachsene Ohr Haut imaging Technik um umfassende dreidimensionale Neuro-vaskuläre Verzweigung Morphogenese und Strukturierung sowie Immunzelle Verteilung auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Die Analyse der peripheren Nerven und Blutgefäße anatomischen Strukturen in adulten Geweben bietet einige Einblicke in das Verständnis der funktionellen Neuro-vaskuläre Verkabelung und Neuro-vaskuläre Degeneration unter pathologischen Bedingungen wie z. B. die Wundheilung. Als sehr informativ Modellsystem haben wir unsere Studien auf Erwachsene Ohr Haut, konzentriert, die bei Dissektion gut zugänglich ist. Unsere einfache und reproduzierbare Protokoll sieht eine genaue Darstellung der zellulären Komponenten in der gesamten Haut, z. B. periphere Nerven (sensorische Axone, sympathischen Axone und Schwann-Zellen), Blutgefäße (Endothelzellen und vaskulären glatten Muskelzellen ), und Entzündungszellen. Wir glauben, dass dieses Protokoll die Möglichkeit, morphologischen Anomalien in der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie die Entzündung in der Haut von Erwachsenen Ohr unter verschiedenen pathologischen Bedingungen untersuchen ebnen wird.

Introduction

Haut besteht aus drei Schichten: der Epidermis, Dermis und Hypodermis. Es wurde als Modellsystem verwendet, um Stammzellen Wartung, Differenzierung und Morphogenese in Entwicklung als auch die Regeneration, Tumorgenese und Entzündung in der Erwachsenenbildung zu studieren. Haut ist reich durchblutet und innerviert, so dass die Entwicklung des peripheren Nervensystems und Gefäßsystem gut aufeinander abgestimmt ist.

Eine ganze-Mount embryonalen Haut bildgebendes Verfahren mit mehreren Kennzeichnung auf intakten peripheren Nerven und Blutgefäße einschließlich ihrer zellulären Komponenten1,2,3, zu studieren haben wir bereits gezeigt. 4: sensorische Axone, sympathischen Axone, Schwann-Zellen in den Nerven, Endothelzellen, Perizyten und vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) in den Blutgefäßen. Während die Angiogenese eine primäre Kapillarnetzes erfährt intensive vaskuläre remodeling und entwickelt sich zu einem hierarchischen vaskulären verzweigten Netzwerk. In den Entwicklungsländern Lederhaut/Unterhaut Arterien neben peripheren sensorischen Nerven und Adern verzweigen dann neben den Arterien bilden. Nachdem die hierarchische vaskuläre Netzwerk gründlich mit VSMCs bedeckt ist, sympathische Nerven erstrecken sich entlang und innervieren Großrohre Blutgefäße1,5,6. Trotz der Bedeutung in die enge Beziehung zwischen der Nerven- und Gefäßsystem Systeme entwickeln wurde eine wichtige Frage zu befassen, was passiert mit der Neuro-vaskuläre Netzwerke in verschiedenen pathologischen Situationen bei Erwachsenen. Eine dreidimensionale hochauflösende Bildgebung ist erforderlich, die Pathogenese, zusammen mit anatomisch erkennbaren Verzweigung Morphogenese und Musterung zu schätzen wissen.

Neuronale und vaskuläre Morphogenese in erwachsenen Maus Haut wird häufig durch Gewebe Abschnitt Färbung analysiert. Andere Studien haben ganze-Mount Bildgebung der Haut verwendet, um die peripheren Nerven und Blutgefäße, neben Arrector Pili Muskeln7,8,9, Haarfollikel und Talgdrüsen zu visualisieren. Allerdings hat die Dicke der Erwachsenen Haut, die Haut über seine gesamte Tiefe zu analysieren erschwert.

In der vorliegenden Studie entwickelten wir eine neuartige hochauflösende ganze-Mount Imaging Erwachsene Ohr Haut, diese Herausforderungen zu meistern. Ohr Haut ist über seine gesamte Tiefe für die Dissektion und anschließende ganze-Mount-Bildgebung der Haut leicht zugänglich. So ist es eine einfache und hoch reproduzierbare Methode, die angewendet werden kann, um dreidimensionale Architektur der peripheren Nerven- und Gefäßsystem Systeme in der Haut, mit umfassender Quantifizierung Messungen zu vergleichen. Wir zeigten, dass die Ausrichtung der peripheren sensorischen und sympathischen Nerven mit großem Durchmesser Blutgefäße in der Erwachsenen Haut erhalten bleibt. Das Ziel dieses Protokolls ist, verzweigte Morphogenese und die Strukturierung der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie die Immunzelle Verteilung auf zellulärer Ebene in erwachsenen Maus-Modellen in verschiedenen Erkrankungen wie Entzündungen zu visualisieren und Regeneration.

Protocol

Alle Versuche in diesem Abschnitt wurden unter Zustimmung vom National Heart, Lung, Blood Institute (NHLBI) Animal Care und Use Committee durchgeführt. 1. erwachsener Mäuse Ohr Haut Kollektion Einschläfern Sie erwachsener Mäuse durch Kohlendioxid (CO2) Exposition in einer geschlossenen Kammer und bestätigen Sie die Euthanasie durch zervikale Dislokation.Hinweis: Das Experiment folgt der National Institutes of Health (NIH)-Leitfaden für die Euthanasie-Methode.</li…

Representative Results

Erwachsenen Maus posterior Ohr (Abbildung 1A) und vorderen Ohr Haut (Abbildung 1 b) wurden Immunostained mit Antikörpern gegen αSMA (rot), Tuj1 (grün), und PECAM-1 (blau). Hinteren Haut war Immunostained, Neuro-immun-Verteilung über Antikörper gegen CD11b (rot) und MBP (grün), zusammen mit Tuj1 (blau) (Abbildung 2A) zu studieren. Vertrieb von CD11b+ Entzündungszellen, einschließlic…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die gesamte-Mount Immunonohistochemical Bildgebung Erwachsene Ohr Haut für die Analyse von Neuro-vaskuläre Strukturen und Immunzelle Verteilung. Wir glauben, dass diese Methode hat zahlreiche experimentelle Vorteile für Forscher, verzweigte Morphogenese und die Musterung der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie dreidimensionale Verteilung der Haut-Komponenten einschließlich Immunzellen und Haare zu studieren Follikel. Die Ergebnisse der Bildgebung können mit imaging Software für weit…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken K. Gill für die Labor-Management und technische Unterstützung, J. Hawkins und das Personal des National Institute of Health (NIH) 50 Tierhaus für die Unterstützung bei der Maus Pflege und R. Reed und F. Baldrey für die Amtshilfe. Vielen Dank auch an S. Motegi und M. Udey für ihr Ohr Haut Dissektion Protokoll, N. Burns für redaktionelle Hilfe und Mitglieder von Labor Stem Cell und Neuro-vaskuläre Biologie für technische Hilfe und nachdenkliche Diskussion. T. Yamazaki wurde von der Japan Society für die Promotion of Science (JSPS) NIH-KAITOKU unterstützt. Diese Arbeit wurde von den intramuralen Forschungsprogramm von der National Heart, Lung and Blood Institute (HL005702-11, Y.M) unterstützt.

Materials

10 x Phosphate Buffered Saline KD Medical RGE-3210 PBS, without Ca2+/Mg2+
Hank’s Balanced Salt Solution Gibco 14025-092 HBSS, with Ca2+/Mg2+
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 PFA, fixative, diluted in PBS
Triton X-100 Sigma X100 Detergent
Normal goat serum Gibco 16210064 Component of blocking/washing buffer
Normal donkey serum Jackson Immuno research 017-000-121 Component of blocking/washing buffer
Curved fine tweezers Dumont RS-5047
Curved tweezers Integra Miltex Vantage V918-782, V918-784
Filter Unit 0.45 mm Thermo Scientific 157-0045 For filtration
1 mL syringe Coviden 8881501400 For filtration
Syringe filter Unit 0.22 mm Millex-GV SLGVR04NL For filtration
ProLong Gold Thermo Scientific P36934 Anti-fade mounting medium
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180 For sealing
Dissecting microscope Leica MZ95
Confocal microscope Leica TCS SP5
Photoshop CC 2017 Adobe Graphics editor software
Illustrator CC 2017 Adobe Graphics editor software
Image J NIH Image processing software
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody Millipore MAB1398Z Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody BD Pharmingen 553369 Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-aSMA antibody conjugated with cy-3 Sigma C6198 Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500
Anti-EphB1 antibody Santa Cruz sc-9319 Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100
Anti-neuron-specific Class III b-tubulin (Tuj1) Abcam AB18207 Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500
Anti-Tuj1 antibody Covance MMS-435P Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500
Anti-MBP antibody Abcam AB40390 Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200
Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody Chemicon AB152 Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500
Anti-Peripherin antibody Chemicon AB1530 Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000
Anti-CD11b antibody Bio-Rad MCA74G Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50
Anti-CD45 antibody Thermo Fisher Scientific 14-0451-85 Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500
Anti-CD3 antibody Bio-Rad MCA1477T Rat IgG1, immune cell marker, 1:100
Anti-CD45R (B220) antibody Thermo Fisher Scientific 14-0452 Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200
Anti-GFP antibody Thermo Fisher Scientific A11122 Rabbit polyclonal, 1:300
Anti-GFP antibody Abcam Ab13970 Chicken polyclonal, 1:500
Anti-b-gal antibody Cappel 55976 Rabbit polyclonal, 1:5000
Anti-RFP antibody Abcam Ab62341 Rabbit polyclonal, 1:300
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A11034 Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 Jackson Immuno research 127-605-160 Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 Jackson Immuno research 112-585-167 Rat polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 Thermo Fisher Scientific A21136 Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250

References

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Cite This Article
Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution. J. Vis. Exp. (133), e57406, doi:10.3791/57406 (2018).

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