Summary

Whole-mount Microscopía Confocal para el oído adulto piel: un sistema modelo para el estudio de morfogénesis Neuro-vascular de ramificación y distribución de células inmunes

Published: March 29, 2018
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Summary

Aquí, describimos un método imagenológico de alta resolución Monte todo en la piel de oreja de ratón adulto entero, que nos permite visualizar la ramificación de la morfogénesis y el patrón de los nervios periféricos y vasos sanguíneos, así como distribución de células inmunes.

Abstract

Aquí, presentamos un protocolo de una piel de oreja adulto todo montaje de técnica para estudiar la completa morfogénesis tridimensional de ramificación neuro-vascular y patrones, así como distribución de célula inmune a nivel celular. El análisis de estructuras anatómicas del nervio y los vasos sanguíneos periféricos en tejidos adultos proporciona algunas perspectivas en la comprensión del cableado neuro-vasculares funcional y degeneración neuro-vascular en condiciones patológicas como la cicatrización de heridas. Como un sistema modelo muy informativo, nos hemos centrado nuestros estudios en piel de oreja adulto, que es fácilmente accesible para la disección. Nuestro protocolo simple y reproducible proporciona una descripción exacta de los componentes celulares de la piel entera, tales como los nervios periféricos (axones sensoriales, axones simpáticos y células de Schwann), los vasos sanguíneos (células endoteliales y células musculares lisas vasculares ) y células inflamatorias. Creemos que este protocolo allanará el camino para investigar anormalidades morfológicas en los nervios periféricos y vasos sanguíneos, así como la inflamación en la piel de oreja adulto bajo diferentes condiciones patológicas.

Introduction

Piel se compone de tres capas: la epidermis, la dermis y la hipodermis. Se ha utilizado como sistema modelo para estudiar el mantenimiento de la célula de vástago, la diferenciación y la morfogénesis en el desarrollo así como la regeneración, tumorogénesis e inflamación en adulto. Piel es ricamente vascularizada e inervada de tal manera que el desarrollo del sistema vascular y sistema nervioso periférico es bien coordinado.

Previamente hemos demostrado una técnica de imagen de piel embrionaria todo Monte con etiquetas múltiples para el estudio de los nervios periféricos intactos y los vasos sanguíneos incluyendo sus componentes celulares1,2,3, 4: axones sensoriales, axones simpáticos, las células en los nervios de Schwann, células endoteliales, pericitos y células musculares lisas vasculares (VSMCs) en los vasos sanguíneos. Durante la angiogénesis, una red capilar primaria experimenta intensivo remodelado vascular y se convierte en una red jerárquica de ramificación vascular. En la dermis/hipodermis en vías de desarrollo, las arterias ramifican junto a los nervios sensoriales periféricos y venas entonces forman adyacentes a las arterias. Después de la red vascular jerárquica está bien cubierta con VSMCs, los nervios simpáticos se extienden a lo largo e inervan los vasos sanguíneos de gran diámetro1,5,6. A pesar de la importancia de la estrecha asociación entre los sistemas nerviosos y vasculares en desarrollo, ha sido una cuestión importante abordar lo que ocurre con las redes neuro-vasculares en diferentes situaciones patológicas en adultos. Una proyección de imagen de alta resolución tridimensional es necesario apreciar la patogenesia, junto con morfogénesis ramificación anatómica reconocible y patrones.

Morfogénesis neuronal y vascular en piel de ratón adulto se analizan comúnmente por tejido sección coloración. Otros estudios han utilizado proyección de imagen de conjunto de montaje de la piel para visualizar los nervios periféricos y vasos sanguíneos, además de los folículos pilosos, glándulas sebáceas y del arrector pili músculos7,8,9. Sin embargo, el grueso de la piel adulta ha hecho difícil analizar la piel en toda su profundidad.

En el presente estudio, hemos desarrollado una novela alta resolución montaje en toda la proyección de imagen de piel de oreja adulto para superar estos desafíos. Piel del oído es fácilmente accesible para la disección y posterior montaje de toda la proyección de imagen de la piel en toda su profundidad. Por lo tanto, es un método simple y altamente reproducible que puede aplicarse para comparar la arquitectura tridimensional de los sistemas nerviosos y vasculares periféricos en la piel, con las medidas de cuantificación integral. Hemos demostrado que la alineación de los nervios periféricos sensoriales y simpáticas con los vasos sanguíneos de gran diámetro se conserva en la piel adulta. El objetivo de este protocolo es visualizar la ramificación de la morfogénesis y los patrones de los nervios periféricos y vasos sanguíneos, así como la distribución de células inmune a nivel celular en modelos de ratón adulto en varias condiciones tales como la inflamación y regeneración.

Protocol

Todos los experimentos en esta sección fueron realizados bajo aprobación de la nacional del corazón, pulmón, sangre Institute (NHLBI) Animal atención y Comité de uso. 1. adultos ratón oído piel colección Eutanasia a ratones adultos por la exposición de dióxido de carbono (CO2) en una cámara cerrada y luego confirmar la eutanasia por dislocación cervical.Nota: El experimento sigue la pauta de institutos nacionales de salud (NIH) para el método de eutanasia…

Representative Results

Ratón adulto posterior oído piel (figura 1A) y anterior de la oreja (figura 1B) immunostained con anticuerpos αSMA (rojo), Tuj1 (verde) y PECAM-1 (azul). Piel posterior era immunostained para estudiar la distribución de neuro-inmune con anticuerpos CD11b (rojo) y MBP (verde), junto con Tuj1 (azul) (figura 2A). Distribución de CD11b+ las células inflamatorias, incluyendo macrófagos f…

Discussion

Este protocolo describe la imagen de conjunto-Monte immunonohistochemical de piel de oreja adulto para el análisis de estructuras neuro-vasculares y la distribución de células inmunitarias. Creemos que este método tiene numerosas ventajas experimentales para investigadores para el estudio de ramificación de la morfogénesis y los patrones de los nervios periféricos y vasos sanguíneos, así como la distribución tridimensional de los componentes de la piel incluyendo el pelo y las células inmunes folículos. Los r…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos la gestión del laboratorio K. Gill y soporte técnico, J. Hawkins y el personal de institutos nacionales de salud (NIH) facilidad del edificio 50 animales para la ayuda del ratón, y R. Reed y F. Baldrey para asistencia administrativa. Gracias también a Motegi S. y M. Udey para compartir su oído piel disección Protocolo N. quemaduras ayuda editorial y los miembros del laboratorio de células madre y biología Neuro-Vascular para la ayuda técnica y discusión reflexiva. T. Yamazaki fue apoyada por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) NIH-KAITOKU. Este trabajo fue financiado por el programa de investigación intramuros de la National Heart, Lung and Blood Institute (HL005702-11 para Y.M.)

Materials

10 x Phosphate Buffered Saline KD Medical RGE-3210 PBS, without Ca2+/Mg2+
Hank’s Balanced Salt Solution Gibco 14025-092 HBSS, with Ca2+/Mg2+
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 PFA, fixative, diluted in PBS
Triton X-100 Sigma X100 Detergent
Normal goat serum Gibco 16210064 Component of blocking/washing buffer
Normal donkey serum Jackson Immuno research 017-000-121 Component of blocking/washing buffer
Curved fine tweezers Dumont RS-5047
Curved tweezers Integra Miltex Vantage V918-782, V918-784
Filter Unit 0.45 mm Thermo Scientific 157-0045 For filtration
1 mL syringe Coviden 8881501400 For filtration
Syringe filter Unit 0.22 mm Millex-GV SLGVR04NL For filtration
ProLong Gold Thermo Scientific P36934 Anti-fade mounting medium
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180 For sealing
Dissecting microscope Leica MZ95
Confocal microscope Leica TCS SP5
Photoshop CC 2017 Adobe Graphics editor software
Illustrator CC 2017 Adobe Graphics editor software
Image J NIH Image processing software
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody Millipore MAB1398Z Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody BD Pharmingen 553369 Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-aSMA antibody conjugated with cy-3 Sigma C6198 Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500
Anti-EphB1 antibody Santa Cruz sc-9319 Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100
Anti-neuron-specific Class III b-tubulin (Tuj1) Abcam AB18207 Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500
Anti-Tuj1 antibody Covance MMS-435P Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500
Anti-MBP antibody Abcam AB40390 Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200
Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody Chemicon AB152 Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500
Anti-Peripherin antibody Chemicon AB1530 Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000
Anti-CD11b antibody Bio-Rad MCA74G Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50
Anti-CD45 antibody Thermo Fisher Scientific 14-0451-85 Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500
Anti-CD3 antibody Bio-Rad MCA1477T Rat IgG1, immune cell marker, 1:100
Anti-CD45R (B220) antibody Thermo Fisher Scientific 14-0452 Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200
Anti-GFP antibody Thermo Fisher Scientific A11122 Rabbit polyclonal, 1:300
Anti-GFP antibody Abcam Ab13970 Chicken polyclonal, 1:500
Anti-b-gal antibody Cappel 55976 Rabbit polyclonal, 1:5000
Anti-RFP antibody Abcam Ab62341 Rabbit polyclonal, 1:300
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A11034 Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 Jackson Immuno research 127-605-160 Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 Jackson Immuno research 112-585-167 Rat polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 Thermo Fisher Scientific A21136 Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250

References

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Cite This Article
Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution. J. Vis. Exp. (133), e57406, doi:10.3791/57406 (2018).

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