Summary
Экспериментальная процедура на Иммунофенотипирование мышиных ортотопическая PDAC homografts направлена на профилирование иммуно микроокружения опухоли. Опухоли являются orthotopically, имплантируются через хирургии. Опухоли3 200 – 600 мм в размере были собраны и отделить подготовить одноклеточных суспензий, следуют мульти иммунных маркеров СУИМ анализ с использованием различных дневно обозначенного антитела.
Abstract
Homograft (сингенных) опухоли являются рабочая лошадка сегодняшних иммуно онкология (ввода/вывода) доклинических исследований. Микроокружения опухоли (ТМЕ), особенно его иммунной компонентов, имеет жизненно важное значение для прогнозирования и прогнозирования результатов лечения, особенно иммунотерапии. TME иммунной компоненты состоят из различных подмножеств проникновения опухоли иммунных клеток оценимый многоцветные СУИМ. Протока поджелудочной железы аденокарцинома (PDAC) — среди страшных malignances, не хватает хорошего лечения, таким образом срочных и неудовлетворенные медицинской необходимости. Одной из важных причин для его способности реагировать различные терапии (химио-, целенаправленных, ввода-вывода) был обильным TME, состоящий из фибробластов и лейкоциты, которые защищают клетки тумора от этих методов лечения. Orthotopically, имплантированных PDAC считается более точно отбить TME человека поджелудочной железой, чем обычные модели подкожной (SC).
Homograft опухоли (КЗК), пересадке мыши спонтанное PDAC, происходящих от генетически КЗК мышей (KРАНG12D / +/P53- / -/Pdx1--Cре) (КПК-ГЭММ). Главным образом тумор ткани разрезать на небольшие фрагменты (3~ 2 мм) и пересаженные подкожно (SC) сингенных получателям (C57BL/6, 7-9 недель). Homografts были затем хирургическим orthotopically пересадили на поджелудочной железы новых мышей C57BL/6, наряду с SC-имплантации, который достиг опухоли объемов 300 – 1000 мм3 17 дней. Только опухоли 400 – 600 мм3 были собирают в утвержденных вскрытие процедуры и очищены, чтобы удалить прилегающих тканей не опухоль. Они были отделены в протокол, с помощью диссоциатором ткани в сингл клеточных суспензий, следуют окрашивание с назначенными группами дневно обозначенного антитела для различных маркеров различных иммунных клеток (лимфоидной, миелоидной и НК, DCs). Окрашенные Образцы анализировались с использованием многоцветные СУИМ для определения количества иммунокомпетентных клеток различных линий, а также их относительная доля в опухоли. Иммунных профили ортотопическая опухоли были затем по сравнению с теми SC опухолей. Предварительные данные продемонстрировал значительно повышенные инфильтрирующие Тилс/ТАМС в опухоли поджелудочной железы, и выше B-клеточной инфильтрации в ортотопическая, вместо того, чтобы SC опухоли.
Introduction
Протока поджелудочной железы аденокарцинома (PDAC) вызывает почти половины миллиона смертность всемирно ежегодно, один из убийц рака Топ 5. Существует несколько вариантов эффективного лечения и не утвержденных immunotherapies; Таким образом отчаянно необходимы новые методы лечения. Раковые заболевания получают все большее признание как иммунологических заболеваний, включая PDAC, помимо генетических заболеваний, как известно сегодня. Иммунологические и генетические факторы скорее всего будет определять прогноза заболевания, а также лечения результаты. Опухоли уклониться от принимающей иммунной наблюдения и в конечном итоге заранее вызвать смерть. Многие из этих иммунных процессов происходят в микроокружения опухоли (ТМЕ)1,2,3,4 , где различные типы иммунных клеток взаимодействуют с опухолевых клеток, друг с другом и с другими опухоли Стромальные компоненты, прямо или косвенно через цитокины, которые в конечном итоге определяют исход заболевания. Таким образом характеристика опухоли иммунной компонентов TME, или иммунофенотипирования опухолевых, включая подтипов, нумерация и локализация различных линий иммунных клеток, имеет решающее значение для понимания противоопухолевый иммунитет. В случае PDAC, было предложено, что повышенные проникновения опухоли подавляющих макрофагов (TAM) и B-клетки привели к предотвращению Т-клеточная инфильтрация и/или активации и высокий уровень фиброза5,6.
Общий подход к расследованию иммунной TMEs экспериментально бы с помощью суррогатного опухоли доклинических животных моделей, главным образом соответствующие мыши опухоли модели7, особенно мышь сингенных (homograft) или генетически модифицированные мыши модели (ГЭММ) рака, на себя подобии человека опухоли и иммунитет8,9и мыши. В действительности понимается, что есть присущи различия между двумя видами10,11.
Пересаженные мыши опухоли имеют значительные оперативные преимущества перед спонтанные опухоли7, а именно развитие синхронизированные опухоли, в отличие от родителей ГЭММ спонтанные опухоли развития. Homografts спонтанные мышиных опухоли считаются первичной опухоли никогда не был манипулировать в пробиркеи зеркального отображения исходного мыши опухоли гисто- / молекулярной патологии7, а также возможных иммунной профилей. Часто эти мышиных homografts считаются «мыши версию пациента производные ксенотрасплантатов (PDXs)». Поэтому они скорее всего есть лучше переводимости чем обычные сингенных клеток линии производные мыши опухоли12. В частности многие homografts являются производными от конкретных ГЭММ, где конкретные болезни человека механизмы, например драйвер онкогенных мутаций, инженерии, и эти homografts, следовательно, должны иметь преимущества для их клиническое значение. В частности КЗК ГЭММ развивать мыши PDAC в течение 15 – 20 недель возраста, что морфологически резюмирует заболеваний человека с преимущественно хорошо умеренно продифференцированным железистой архитектуры и высокообогащенного стромы. Эта модель также резюмирует наиболее распространенных генетических особенностей человека PDAC, а именно крас, активизируя мутации и P53-из функция потерь, которые происходят в 90% и 75% человеческого PDAC, соответственно5,6.
Сайты о трансплантации также было предложено играть свою роль в модели переводимости. Конкретные окружающей среде ткани, например в соответствующей среде ортотопическая, может быть нишу для конкретной опухоли в прогресс, в отличие от единой подкожной (SC) средах для часто пересаженных опухоли. Он будет представлять особый интерес, если, и, какая разница существует между двумя сайтами трансплантации, с точки зрения иммунной микроокружения и значение для человека рак, например. в случае PDAC.
Одним из наиболее важных аспектов иммунной профилирования, или иммунофенотипирование, необходимо определить проникновения опухоли иммунные клетки различных линий, числа, относительная доля в опухоли, а также их активации государств и местах. Это включает в себя опухоли infiltratrating lymphoctyes (Тилс, как T - и B-), проникновения опухоли макрофагов (ТАМС), проникновения опухоли естественных клеток-киллеров (НКС) и опухоли резидентов дендритных клеток,3,13,14 , 15 , 16 , 17и внутриклеточных локализации некоторых ячеек18,19,20, и т.д. Флуоресценции активирован ячейку Сортировка (FACS) или потока цитометрии является технология обнаружения одной ячейки, которая обычно используется для определения конкретных параметров ячейки. Разноцветный поток цитометрии меры несколько маркеров на одну ячейку3,4,21 и является наиболее часто используемым методом для определения числа и относительная доля различных подмножеств иммунных клеток, включая те внутри опухоли.
В настоящем докладе описываются процедуры для профилирования проникновения опухоли клетки иммунной системы: 1) имплантация ортотопическая PDAC мыши опухоль homografts, наряду с SC имплантации; 2) опухоль ткани урожай и подготовка одной клетки через диссоциации опухоли; 3) потока cytometry анализ всех клеток, производный от опухоли в качестве базовых данных; 4) сравнение базовые характеристики обоих подходов трансплантации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы и присутствующими или процедур с участием уход и использование животных будут рассмотрены и одобрены Корона Bioscience институциональный уход за животными и использовать Комитет (IACUC) до проведения исследований. Уход и использование животных, обычно будет проводиться в соответствии с АААЛЖ (ассоциации оценки и аккредитации лабораторных животных ухода) международных руководящих принципов, как сообщили в руководстве для ухода и использования лабораторных животных, национальные исследования Совет (2011). Все животные экспериментальной процедуры будут в стерильных условиях на объектах SPF (конкретного возбудителя бесплатно) и проведено в строгом соответствии с руководством для ухода и использования лабораторных животных из различных государственных учреждений (например Национальные институты здравоохранения). Протокол необходимо будет утверждаться Комитетом по этике животных эксперименты на учреждение фонда (например организационного комитета IACUC).
1. Подготовка к трансплантации опухоли
-
Животных
- Получите универсальные мышей C57BL/6 от поставщика коммерческое разведение.
- Дом мышей (5) в отдельных клетках вентилируемых при следующих условиях: температура: 20 – 26 ° C; влажность 30 – 70%; освещение цикла: 12 h света и 12 h темно.
- Использование кукурузного початка постельные принадлежности это меняется еженедельно.
- Для диеты предоставляют облучения стерилизации сухих гранул пищи в течение всего рассматриваемого периода.
- Для воды обеспечивать свободный доступ к стерильной питьевой воде животных.
-
Подготовка фрагмент опухоли доноров
- Начать с контроля веса тела (BW), через взвешивание с использованием баланса и объем опухоли (ТВ), путем измерения суппорта, опухоль подшипник доноров мышей.
- Когда телевизор достигает 500 – 1200 мм3, усыпить животных в биологической вытяжки согласно протоколу.
- Стерилизуйте кожи вокруг опухоли с помощью йодофора тампоны.
- Хирургическим путем удалить опухоль (детали, описанные в разделе 3: вскрытие и опухоли урожая) и опухоли в чашку Петри, содержащих 20 мл PBS (предварительно охладить СМИ или буфер до 4 ° C до euthanizing животных).
- Если есть загрязняющих кровь, передача опухоли в другой чашке Петри и мыть опухоли с PBS.
- Сократить наполовину, удаление любых дополнительных кожи, сосудов, обызвествление или некроза опухоли.
- Выбрать только неповрежденной части опухоли и поместить их в стерильных 50 мл пластиковых пробирок и добавляют 20 мл PBS то транспорт трубки животных отдельную комнату для фармакологии исследования.
2. ортотопическая и приживления подкожной (SC)
-
SC прививка
- Разрежьте опухоли на 2 мм диаметр куски с помощью скальпеля, положить 1 кусок в каждом троакара, для имплантации SC или позднее ортотопическая имплантации (см. ниже).
- Анестезировать получателя животное с 5% изофлюрановая, который поддерживается носовой конус на 1%. Животное будет начать отдыхать, теряя их восстанавливающих рефлекс и в конечном итоге стать неподвижным. На этой глубине анестезии они могут легко быть разбудил болезненные стимулы; разрешить анестезии углубить до тех пор, пока такие ответы на боли отсутствуют.
- Как только под наркозом, исправьте мышей на доске эксперимент в правой боковой позиции. Стерилизуйте мыши, с помощью йодофора тампоны, особенно в районах вокруг опухоли.
- С помощью скальпеля делают разрез кожи 0,5-1,0 см на левом фланге, точно краниально к бедра.
- Туннель под кожу к передних конечностей, двух-трех сантиметров, с тупым щипцами.
- Асептически передавать один куб опухоли с носителя и место глубоко внутри подкожный туннель.
- Визуально подтвердите, что опухоль находится глубоко в туннеле (а не на разрез кожи).
- Закройте рану с раной клипов.
- Следить за пост прививки животных до тех пор, пока они восстановить достаточно сознания для поддержания грудной recumbence. Возвращение животных в их клетке только после их полного восстановления от анестезии. Полный журнал анестезии и инициировать индикаторы здоровья животных. Весят получателей животных ежедневно в течение трех дней
- Для стандартной процедуры прививать мышей 5-10 на группу для мониторинга роста опухоли.
-
Поджелудочной железы ортотопическая имплантации
- Анестезия и анальгезия
- Использование кетамина 2 мл раствора для инъекций и 0,42 мл Ксилазина инъекции (20 мг/мл) смешиваются в 5.91 стерильному воды или физиологического раствора на объём дозы 0,06-0,1 мл/20-25 г веса тела.
Примечание: Согласно Благосостояние животных, обезболивание необходимо как до и пост операции. 0,05-0,1 мг бупренорфин/кг, SC. Первая доза pre операция и затем дозируется 3 раза каждые 4 часа операции post постоянно.
- Использование кетамина 2 мл раствора для инъекций и 0,42 мл Ксилазина инъекции (20 мг/мл) смешиваются в 5.91 стерильному воды или физиологического раствора на объём дозы 0,06-0,1 мл/20-25 г веса тела.
- Хирургическая операция по имплантации ортотопическая
- Анестезировать мышей через внутримышечной инъекции (IM) за шагом 2.2.1.
- После того, как животные полностью наркоз, исправьте мышей на доске эксперимент в правой боковой позиции.
- Держите мышей в правой боковой позиции. Дезинфекция кожи вокруг селезенки с йодом, а затем де йодированного с 75% этилового спирта.
- Найти точку среднего селезенки и сделать 1 см вертикальный разрез на животе подвергать селезенки.
- Вытянуть часть поджелудочной железы ткани под селезенки аккуратно пинцетом плоским tip и шовные мыши опухоли homograft кусок от семян мыши на поджелудочной железе получателей мыши, рассасывающиеся хирургические шовные 9-0.
- Закройте живота с 6-0 Шелковый шов, двойным швом. Добиться гомеостаза, сжатие.
- После окончания опухоли имплантация если кровотечение не опухоль ткани утечки, держите животных в клетке теплой.
- Мониторинг животных до тех пор, пока он восстанавливает достаточно сознания для поддержания грудной recumbency; вернуть животное животных комнате после полного восстановления от анестезии. Контролировать опухоль, принимая мышей пальпируя живот возле селезенки и выберите из мышей, принимая ортотопическая опухоли.
- Анестезия и анальгезия
-
Опухоль подшипник мышей здоровья мониторинг
- Проверьте ежедневно потребление воды и продовольствия.
- Изучите мыши внешний вид для ungroomed волос пальто, комков, тонкость, ненормальное дыхание или асцит.
- Ощупывайте живот для проверки, если есть спонтанное опухоли на печени или селезенки.
- Взвешивание мышей, за неделю с использованием баланса.
- Если любой из следующих клинических признаков наблюдаются, мышей были принесены в жертву для сбора проб и патанатомия: BW потери > 20%; нарушение подвижности (не в состоянии съесть или выпить); не удается переместить обычно из-за значительный асцит и расширенного живота; усилие в дыхании.
3. Вскрытие и опухоли урожай
- Осмотрите визуально и при пальпации присутствие ощутимым опухолей до окончания.
- Для прекращения сначала усыпить мышей в соответствии с утвержденным протоколом и открыть живота и визуально изучить поджелудочной железы, опухолей.
- Отрезать опухоль пост смертельной хирургическим путем и добавить его в холодной PBS. Поместите все животные в камере чистый, без предъявления обвинений, полупрозрачный эвтаназии с специальной крышкой с портом для доставки углекислого газа, которые будут использоваться.
- Слива газа в камеру со скоростью потока, который производит быстрое бессознательного с минимальными страданиями для животного. Оптимальный расход для CO2 должна быть около 2-2,5 Л/мин.
- Визуально наблюдать каждое животное во время процедуры эвтаназии заверить все животные получить адекватный газообмен концентрации и не восстановить сознание во время процедуры euthanize.
- Сохранение потока газа по крайней мере 1 мин после очевидной клинической смерти, чтобы свести к минимуму возможность того, что животное может восстановить (если апноэ, но не мертвых).
- Удаляет смежные номера опухоль тканей. Уборка опухоли могут быть сфотографированы быстро.
Положите в ткани опухоли в RPMI 1640 и держать на льду до диссоциации.
Примечание: Туши животных мешки и храниться в соответствующие морозильник дождаться удаления.
4. опухоль ткани диссоциации и подготовка одной клетки
-
Подготовка реагента
Примечание: Комплект диссоциации опухоль содержит 2 флакона фермента D (лиофилизированный порошок), 1 флакон фермента R (лиофилизированный порошок), 1 флакон фермента A (лиофилизированный порошок) и 1 мл буфера а.- Подготовьте фермента D путем воссоздания лиофилизированный порошок в каждом флаконе с 3 мл RPMI 1640. Подготовьте аликвоты соответствующие тома, чтобы избежать повторных циклов замораживания оттаивания.
- Подготовьте фермента R, воссоздание лиофилизированный порошок во флаконе с 2,7 мл RPMI 1640. Подготовьте аликвоты соответствующие тома, чтобы избежать повторных циклов замораживания оттаивания.
- Подготовьте энзим A путем воссоздания лиофилизированный порошок в флакон с 1 мл буфера A поставляется с комплектом. Сделать не вихря. Подготовьте аликвоты соответствующие тома, чтобы избежать повторных бесплатно--циклов оттаивания.
- Подготовьте фермент смесь, добавив 2,35 мл RPMI 1640, 100 мкл фермента D, 50 мкл фермента R и 12,5 мкл A фермента в каждой gentleMACS C-Тюбе.
-
Опухоль диссоциации
- Для каждого опухоли подготовить один C-трубка с опухоли пищеварение микс, обратитесь к разделу 4.1 для разбавления буфера пищеварение и подготовки.
- Использование 3 мл пищеварение буфер для опухоли фрагменты < 0.8 g и опухоль полностью переваривается.
- Этикетка с исследование кода, опухоли, ID мыши, группы лечения и вес опухоли.
- Собрать опухоль от мыши, моют в холодной PBS опухоли и очистить ткани придает на опухоли (например, кровеносных сосудов, жир, фасции, и т.д.).
- Положите опухоли в пищеварение средства массовой информации в одной скважиной стерильным 6 пластины хорошо.
- Держите опухоль в месте с стерильным пинцетом/щипцы и фрагмент с помощью скальпеля. Кусочек опухоли достаточно хорошо разорвать на более мелкие куски (3~ 1 мм).
- Поместите кусочки опухоли обратно в C-трубки и использовать оставшиеся пищеварение буфер для мыть тарелку и затем передать жидкость в C-труба, которая помещается на льду до пищеварение.
- Перейти на диссоциатором с нагревом.
- Место опухоли диссоциации C-трубы вниз головой в рукавах вакантных должностей и отрегулируйте статус позиции трубки от свободной Selected. Выберите программу диссоциации (37_c_m_TDK_1), выбор нужной папки, в которой отображается список программ.
- После окончания программы снять C-трубы диссоциатором и спин кратко (300 x g, 4 ° C) для пеллет образца.
- Вновь приостановить образцы и введены в ячейки сита выше 50 мл трубки. Вымойте клетки через стрейнер ячейки с 10 мл буфера мытья предоставлять подвески одной ячейки.
- Центрифуга трубы на 300 x g 5 минут, удалить супернатант и вновь приостановить клетки с 5 мл буфера мытья, количество жизнеспособных клеток с помощью Трипановый синий и/или счетчик соматических клеток и отрегулировать concentraton клеток в 1 x 106 клеток на метро или на образце. Включить правильный isotype антитела управления чтобы убедиться, что окрашивание конкретных
5. иммунной панели дизайн и получение потока данных
-
Дизайн панели
- Смотрите таблицу 1.
-
Иммуноокрашивания
- FC-блок образец клеток: вновь приостановить клетки в 200 мкл окрашивания буфер с 1 мкг/мл Fc-блок, а затем инкубации на льду или 4 ° C охлаждения за 15 мин в темноте.
- Пятно ячейки, используя нужный антитела/флюоресценцию панелей (например. Группа T-Cell, Группа макрофагов и т.д.): добавить смесь антител, разбавленных в блокирующем буфере ФК для каждого образца, пятно, по крайней мере 30 минут на льду в темноте.
- Добавьте 1 mL холодной PBS льда к каждой пробке и вновь приостановить клетки мягко, последующим центрифугированием на 300 x g 5 мин отменить полученный супернатант.
- Повторите дважды мыть клетки.
- Пятно для внутриклеточных маркеров, при необходимости, следующие шаги 6-10, иначе перейти к шагу 10.
- Вновь приостановить клетки Пелле, пульс вихря и 200 мкл подготовленных фиксации/Permeabilization рабочего раствора для каждого образца. Пульс вихрь снова, а затем Инкубируйте на 4 ° C на ночь (предпочитаемый) или 30 мин при комнатной температуре в темноте.
- Спин вниз клетки и удалить супернатант.
- Мыть дважды, добавив 1 мл 1 x Permeabilization буфера (сделанные из 10 x буфер Permeabilization, разбавляют дистиллированной H2O) следуют центрифугирования и переливание из супернатант.
- Добавьте внутриклеточных маркеров антитела в 1 x Permeabilization буфера и инкубации при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте.
- Вымойте клетки дважды с 1 мл раствора 1 x Permeabilization буфера. Центрифуга и сцеживаться супернатант.
- Ресуспензируйте клетки в 150 мкл буфера, окрашивание и анализировать на цитометр. Из-за фиксации и permeabilization процедуры, FSC (вперед свет разброс) / SSC (боковыми источниками света разброс) распределение населения в ячейке будет отличаться жить клетки. Таким образом ворота и напряжений нужно будет изменяться.
-
FMO контроль (флуоресценции минус один элемент управления)
Примечание: Анализ потока многоцветные особенно важна для анализа проникновения опухоли клетки иммунной системы. Таким образом необходимо найти способ, чтобы идентифицировать и строба клетки в контексте данных распространения из-за нескольких флуорохромов в данной панели. FMO (флуоресценции минус один) управления является важным подходом для этой цели.- В этой связи включают дополнительные мышей в каждой группе для элементов управления, FMO (по крайней мере 2 на Rx) и процесс индивидуально для каждой ткани. После диссоциации, бассейн тканей. Например в исследовании с 4 группами Rx, 8 Дополнительные опухоли должны обрабатываться по отдельности и затем объединили в одну выборку для FMOs.
-
Инструмент установки потока
- Сделайте бусы компенсации, в то время как машина нагревается (по крайней мере 20 мин).
- Для проверки производительности используйте CS & T бусины.
- Параметры напряжения и компенсации: используйте UltraComp бусы, вихря, Comp бусины тщательно перед использованием.
- Метки образца трубки2 отдельный 12 x 75 мм для каждого флюрохром конъюгированных антител.
- Пятнать буфер для каждой трубы 100 мкл. Добавьте 1 каплю полный (примерно 60 мкл) из бисера для каждой трубы.
- Добавление антител и пятная процедуру выполнить точно как пример процесса, указано в разделе 4.
- Добавьте 0,5 мл окрашивания буфера, полностью вновь приостановить гранулы шарик через вихря.
- Установка потока цитометр ПЛТ напряжения на ткани-мишени для данного эксперимента.
- Запуск через проточный цитометр для сбора данных, путем стробирования на синглетно шарик населения на FSC и SSC чтений.
- Установить скорость потока вокруг 200 – 300 событий/сек.
- Установите соответствующую компенсацию за данной флуоресцеин [FITC]-конъюгированных антител, использование значения параметров FL1 и FL2 точка сюжет.
- Место штанге ворот так, что негативные бусины находятся в нижнем левом квадранте и позитивные бусины в верхней или ниже справа квадранта. Отрегулируйте значения компенсации до тех пор, пока средний флуоресценции интенсивность (MFI) каждого населения (как показано в окне Статистика квадрант) приблизительно равен (т.е. для FL2-% значения параметров FL1, FL2 МФО из обоих бусины должны быть аналогичные).
- Повторите шаги 5.4.11 и 5.4.12 для всех трубок.
- Перейти для получения фактической витражи образцы. Запустите мастер возмещения и сохранить параметры в формате «Дата эксперимент ваши инициалы».
6. поток данных анализа и презентации
- Анализ данных по Flowjo и/или Калуцы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Имплантация ортотопическая PDAC привело к быстрой опухолевого роста, подобные тому, которое наблюдалось для имплантации SC. После того, как доноры опухоли фрагменты были имплантированы в получателей мышей, как подкожно и orthotopically согласно протоколам описано в шагах 2.1 и 2.2, имплантированных homograft опухоли КЗК продемонстрировали аналогичные быстрый рост как показано в Рисунок 1A . КЗК homograft опухоли собирают в разное время точки показаны на рисунке 1B и представитель H & E изображения показаны на рисунке 1 c. Наши данные свидетельствуют аналогичные рост SC и ортотопическая имплантаты.
Жизнеспособные опухолевых клеток и клеток в ТМЕ, включая проникновения опухоли клетки иммунной системы, возникая от ортотопическая или SC имплантации, могут быть эффективно восстановлены. Опухоли были собраны и переваривается подготовить единый клеточных суспензий для последующего анализа СУИМ, с помощью коммерческих диссоциатором (рисунок 2A) согласно протоколу, описанные в шаге 4. Обычно мы получили достаточно высокой жизнеспособных клеток урожайности от опухоли примеры обоих типов имплантации (~ 80% рентабельности на основе Трипановый синий); Представитель СУИМ сюжет показывает жизнеспособные клетки из опухоли, отделены от мертвых клеток/клеток мусора (рис. 2B).
Проникновения опухоли иммунные клетки различных подмножеств были определены как ортотопическая, так и опухоли имплантируются SC, в то время как их профили имеют отличия. Подвеска одну ячейку, подготовленных от опухолевых тканей с помощью метода, описанного в шаге 4.2 были подвергнуты анализу СУИМ после окрашивания с панелью 16 цвет маркеров показано в таблице 1, которая охватывает различных линий важных иммунных клеток как а также опухолевых клеток. Шлюзовые стратегии или иммунной иерархии линии вместе с представителем потока участков приведены на рисунке 3A. CD45, маркера для всех зрелые клетки иммунной системы, был использован для отличительный опухолевых клеток и проникновения опухоли клетки иммунной системы. Все иммунной линий были впоследствии проанализированы с CD45+ населения, отображаемый в панели (Таблица 1).
Рядом с маркерами, размер ячейки также используется для различения различных субпопуляций (рисунок 3B слева) для количественного определения подмножества ячеек, включая T, B-лимфоцитов, макрофагов и MDSCs, и т.д. Опухоль, проникнув иммунной профиль сравнение SC homografts против ортотопическая поджелудочной железой. Основных перечисленных клеточных популяций подмножеств нескольких ключевых проникновения иммунные клетки опухоли показываются отождествлены рисунок. Данные ясно показывает, что опухоль значительно возросло иммунных клеток инфильтрата, по сравнению с поджелудочной железы здоровых мышей. Кроме того в ортотопическая противбыли обнаружены различные проценты подмножество проникновения опухоли клетки иммунной системы. СК homografts, например , значительно больше B-клетки в ортотопическая чем в SC.
| Маркер | Иммунных клеток населения |
| CD45 | Всего лейкоциты |
| CD3 | Общая Т-клетки |
| CD4 | CD4 + Т-хелперы |
| CD8 | CD8 + цитотоксических Т-клеток |
| CD44 / CD62L * | Наивные, память и эффекторные клетки T |
| CD69/CD44/OX40/CD25 и т.д.* | Маркеры активации |
| CD4 + CD25 + FoxP3 + | Регуляторных клеток T |
| CD11b + Ly6c/Ly6g | G-MDSC и M-MDSC |
| CD11b + F4/80 | Макрофаги |
| IA/IE/CD206 | Макрофаги M1 и M2 |
| CD3-CD335 + | НК-клетки |
| CD3 + CD335 + | NKT клетки |
| CD19 | Клетки B |
| ФНО a/ИФН r/IL-7/Ил-3 и т.д.* | Цитокины |
| PD-1/PD-L1/CTLA-4/TIM-3 и т.д.* | Контрольно-пропускной пункт ингибиторы |
| Granzym B и т.д.* | Наиболее часто запрашиваемые маркеры |
| KI67/Brd U/НСИП и т.д. | Распространение |
| Живой/мертвых (поправимо) | Живой/мертвые |
| * Примечание: Дополнительные маркеры могут быть добавлены при необходимости | |
Таблица 1: поток 16-цветные панели предназначены для анализа проникновения опухоли мыши иммунных клеток.
Рисунок 1: как ортотопическая и SC (subQ) имплантированных PDAC homograft опухоли в продемонстрировал мышей C57BL/6 аналогичный рост с или без лечения гемцитабин. (A) кривая роста: SC-левого и правого ортотопическая. Синий: Транспортное средство; Золото: Гемцитабин (начато на день 10 пост прививка, когда средний объем опухоли SC достиг3200 мм). (B) опухолевых тканей в разное время точках. (C) представитель H & E пятнать обоих типов homografts (40 x 10). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: опухоль ткани диссоциации подготовить жизнеспособных одноклеточного подвеска. (A) использование disassociator; (B) жизнеспособных клеток, отделены от мертвых клеток, как свидетельствует анализ потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: анализ потока многоцветные проникновения опухоли иммунных клеток ортотопическая и SC PDAC homografts. Необработанные данные от каждого образца тумора были приобретены от потока цитометрии документа, затем анализ с использованием программного обеспечения для анализа Flowjo СУИМ. (A) стандартная стробирования стратегия для анализа, отображается в качестве примера; (B) представитель потока стробирования и анализа данных с использованием стандарта стробирования стратегии; (C) представитель проникновения опухоли иммунной cellsare отображается для B-клетки, Treg и макрофагов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя более легко проводятся исследования с использованием SC опухоли, имплантированных orthotopically опухолей модели может быть более актуальной для доклинических фармакологии исследования (особенно расследования операций ввода-вывода) для обеспечения расширенной переводимости. Этот доклад направлен на оказание помощи заинтересованных читателей/аудитории, чтобы иметь возможность непосредственно визуализировать технических процедур, которые могут быть использованы в их соответствующих исследованиях. Наши протоколы продемонстрировать что ортотопическая имплантации PDAC может привести к эффективным опухолевого роста, аналогичные SC имплантации. Наши наблюдения также, как представляется, предположить наличие различных иммунных профилей TMEs от различных имплантации. Основные проблемы адаптации ортотопическая, по сравнению с SC имплантации, что требуются сложные навыки, процесс отнимает много времени, хирургические процедуры для имплантации являются трудоемким, а также трудности в мониторинге ортотопическая опухоли рост в жизни.
Существует четыре важнейшие шаги для обеспечения что ортотопическая опухоль поджелудочной железы успешно эксперименты: 1) хирургическая процедура имплантации; 2) тщательного и своевременного мониторинга развития опухоли; 3) важность выполнения предварительного эксперимента проверяет сначала ознакомиться с процедурой и оценить скорость взять и темпы роста опухоли; 4) с помощью единого клеточных суспензий диссоциированных опухолей как метод альтернативного приживления. Эта процедура доклад является полезным для читателей для выполнения исследований с использованием этой конкретной homograft, а также другие модели поджелудочной ортотопическая, и даже другие ортотопическая модели с участием хирургии живота открытие.
Проточная цитометрия или СУИМ в настоящее время является наиболее важным инструментом для выполнения immunoprofiling. Иммунофенотипирование опухолей, СУИМ значительно отличается от клеток из различных органов, таких как периферической крови, селезенке, лимфатических узлов и костного мозга, в следующим образом. Как правило есть очень небольшой процент иммунных клеток в опухоли (небольшой размер выборки). Крайняя неоднородность опухоли и небольшое количество иммунных клеток делают восстановление жизнеспособных редких иммунные клетки, технически сложных, требующих специально разработанной опухоль ткани диссоциации с участием машины. Оба предыдущих точек делают необходимым одновременное измерение нескольких параметров, используя многоцветные проточной цитометрии. Многоцветные потока требует сложный маркер дизайн панели, компенсации и стробирования стратегии, благодаря флуоресценции спектрального наложения. Этот доклад также пытались продемонстрировать заинтересованных читателей/аудитории процесс опухоли иммунной профилирования через определенные опухоль ткани диссоциации и многоцветные потока cytometry анализ.
Три критических шагов может быть особенно важным для принести продуктивной TIL анализ: во-первых, высокая доходность жизнеспособных клеток, оправился от отделять опухоли с помощью заказной опухоли диссоциации процедур; Во-вторых, оптимизированная конструкция больших многоцветные окрашивания панелей на основе доступных реагентов; в-третьих, оптимизированный стробирования стратегия в анализе. Авторы хотели бы подчеркнуть подготовку и опыт операторов сбора данных и анализа необходимы для успешного потока cytometry анализ ТИЛЬ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы являются нынешних штатных сотрудников Корона Bioscience, Inc.
Acknowledgments
Авторы бы поблагодарить д-ра Джоди Барбо - для критического чтения и редактирования рукописи и благодарю Ральф Мануэль для проектирования произведения искусства. Авторы хотели бы также поблагодарить Корона Bioscience онкологии иммуно-онкология биомаркер команды и команды онкологии В естественных условиях , за их большие усилия технического.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | \ | SAS3119 | \ |
| Trocar 20 | \ | \ | 2 mm |
| Petri dish | \ | \ | 20 mm |
| 100x antibiotic and antimycotic | \ | \ | \ |
| Iodophor swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Alcohol swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Liquid nitrogen | Air chemical | \ | \ |
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | \ |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | \ |
| antibodies | BD | \ | \ |
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | \ |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | \ |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | \ |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70 µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2 mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | \ |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | \ |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | \ |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | \ |
| FlowJo software | FlowJo LLC | \ | vs 10.0 |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50 mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | \ |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | \ |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10 cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10 cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | \ |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100 g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | \ |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | \ |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | \ |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8 mL |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | \ |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | \ | 1-5 mL |
| Studylog software | Studylog | \ | software |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50 mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15 mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4 °C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | -20 °C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | -80 °C |
| RNAlater | Thermo | am7021 | \ |
References
- Chevrier, S., et al. An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
- Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. Monitoring immune responses in the tumor microenvironment. Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).
- Mosely, S. I., et al. Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery. Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).
- Gunderson, A. J., et al. Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer. Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).
- Erdag, G., et al. Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma. Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).
- Gutiérrez-Garcia, G., et al. Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy. Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).
- Paiva, B., et al. PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma. Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).
- Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).
- Lavin, Y., et al. Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses. Cell. 169 (4), 750-765 (2017).
- Mahoney, K. M., et al. PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells. Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).
- Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining. Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).
- Jiang, Y., et al. ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer. Ann. Surg. , (2016).
- Ribas, A., et al. PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells. Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).
