Summary
Murine orthotopic PDAC homografts immunophenotyping에 실험 절차는 종양 면역 microenvironment 프로 파일링 목표로 합니다. 종양은 수술을 통해 이식 하는 orthotopically. 종양 크기에 200-600 m m3 의 수확 되었고 단일 셀 정지, 여러 면역 표식 FACS 분석 다른 붙일 표시 된 항 체를 사용 하 여 다음을 준비 하는 해리.
Abstract
Homograft (syngeneic) 종양은 오늘날의 면역-종양학 (I/O) 전 임상 연구의 주력. 종양의 microenvironment (TME), 특히 면역-구성, 예 후 및 치료 결과, immunotherapy의 특히 그의 예측에 필수적입니다. TME 면역-구성 요소 다 색 FACS에 의해 평가할 수 있는 면역 세포를 종양 침투의 다른 하위 집합으로 구성 됩니다. 췌 장 ductal 선 암 (PDAC) 좋은 치료 옵션, 따라서는 긴급 하 고 미 충족 의료 필요를 부족 한 치명적인 malignances 중 하나입니다. 그것의 비-응답 다양 한 요법 (항 암 치료-, 타겟, I/O)에 대 한 중요 한 이유 중 하나는 섬유 아 세포 및 이러한 치료에서 종양 세포를 보호 하는 백혈구의 구성 된 그것의 풍부한 TME 되었습니다. Orthotopically 이식된 PDAC는으로 더 정확 하 게 기존의 피하 (SC) 모델 보다 인간의 췌장암의 TME 탈환.
Homograft 종양 (KPC)는 마우스 자발적인 PDAC 유전자 조작된 KPC-마우스에서 발생의 이식 (KrasG12D / +/P53-/-/Pdx1-다시C) (KPC-GEMM). 기본 종양 조직 (~ 2 m m3) 작은 조각으로 자르고 피하 이식 (SC) syngeneic 받는 사람 (C57BL/6, 7-9 주 이전)에 게. homografts 수술 후 했다 orthotopically에 SC-주입, 17 일에 의해 300-1000 m m3 의 종양 볼륨에 도달 함께 새로운 C57BL/6 마우스의 췌 장 이식. 400-600 m m3 의 종양만 승인된 부검 절차 당 수확 되었고 인접 한 비 종양 조직을 제거 하는 청소. 그들은 다른 면역 세포의 다양 한 표시에 대 한 항 체 붙일 레이블 지정 패널 얼룩 다음 단일 셀 정지로 조직 dissociator를 사용 하 여 프로토콜 당 해리 했다 (림프, 골수성 NK, Dc). 얼룩진된 샘플 종양 내에서 그들의 상대적인 비율 뿐 아니라 다른 계보의 면역 세포의 숫자를 결정 하기 위해 다 색 FACS를 사용 하 여 분석 되었다. Orthotopic 종양의 면역 프로필 다음 SC 종양의 그들에 비교 되었다. 예비 데이터 췌 장, 그리고 사우스 캐롤라이나 종양 보다는 오히려 orthotopic 높은 B-세포 침투 종양에서 상당히 높은 침투 TILs/Tam을 시연 했다.
Introduction
췌 장 ductal 선 암 (PDAC) 하면 거의 절반 백만 mortalities 세계-넓은 매년 상위 5 암 살인범 중 하나. 몇 가지 효과적인 치료 옵션 및 아무 승인된 immunotherapies; 따라서, 새로운 치료 필사적으로 필요 합니다. 암은 점점 오늘 알려진 유전 질환 뿐만 아니라 PDAC를 포함 하 여 면역 질병으로 인식 되 고 있습니다. 면역 및 유전적 요인 치료 뿐만 아니라 질병의 예 후 결정 가능성이 결과. 종양은 호스트 면역 감시를 회피 하 고 결국 죽음을 미리. 이러한 면역 프로세스의 많은 내 발생 종양 microenvironment (TME)1,2,,34 어디 다른 종류의 면역 세포 작용 종양 세포와, 서로 다른 종양 stromal 구성 요소, 직접 또는 간접적으로 궁극적으로 질병 결과 결정 하는 cytokines. 따라서, TME, 또는 종양 immunophenotyping, 동등, 세는 법 및 면역 세포의 다른 계보의 지역화를 포함 하 여 종양 면역 구성의 특성은 항 종양 면역을 이해 하는 데 중요 합니다. PDAC, 경우 그것은 제안 되었습니다 그 높은 종양 침투 진압 대 식 세포 (TAM) 및 B 세포 T 세포 침투 활성화의 예방 및 섬유 증5,6의 높은 수준으로 이끈.
면역 TMEs을 실험적으로 조사 하는 일반적인 방법은 대리 종양 전 임상 동물 모델을 사용 하는 것, 주로 관련 마우스 종양 모델7, 특히 마우스 syngeneic (homograft) 또는 유전자 조작된 마우스 모델 (GEMM) 암, 마우스와 인간 종양과 면역8,9의 가정된 유사성에. 두 종10,11사이의 고유의 차이 현실에서 이해 된다.
종양 이식된 마우스는 자발적인 종양7, 즉 동기화 된 종양 개발, 부모의 GEMM 자연 종양 개발 달리 상당한 운영 이점이 있다. 자발적인 murine 종양의 homografts 1 차 종양 적 데 조작 생체 외에서미러링 원래 마우스 종양 조직-간주 됩니다 / 분자 병 리7, 뿐만 아니라 가능한 면역 프로필. 이러한 murine homografts는 종종 "환자 파생 xenografts (PDXs)의 마우스 버전" 간주 됩니다. 그들은 따라서 가능성이 있다 기존의 syngeneic 셀 라인 파생 마우스 종양12보다 더 나은 translatability. 특히, 많은 homografts는 특정 인간 질병 메커니즘, 예를 들면 종양 드라이버 돌연변이, 설계는, 그리고이 homografts 그러므로 그들의 임상 관련성에 이점이 있어야 특정 GEMM에서 파생 됩니다. 특히, KPC GEMM 형태학 상으로 주로 잘에 알맞게-차별화 된 선의 건축과 인간의 질병이 고 높은 기질 있는 나이의 15-20 주 이내 마우스 PDAC 개발. 이 모델은 또한 인간의 PDAC, 즉 Kra 90%와 인간의 PDAC, 각각5,6의 75%에서 발생 하는 돌연변이 P53 손실-의-기능을 활성화의 가장 일반적인 유전자 기능을이.
이식의 사이트는 또한 모델 translatability에 역할을 제안 되었습니다. 해당 orthotopic 환경 등 특정 주변 조직 환경 일반적으로 이식된 종양에 대 한 균일 한 피하 (SC) 반대로 진행 환경에 특정 종양에 대 한 틈새 수 있습니다. 그것은 특정 관심의 것 경우, 어떤 차이가 존재 하는 면역-microenvironment, 및 인간의 암에 관련성 두 이식 사이트 간에 예그리고/또한. PDAC 경우.
면역 프로 파일링 또는 immunophenotyping의 가장 중요 한 측면 중 하나는 종양 침투 면역 세포의 다른 계보, 숫자, 종양, 내 상대 비율으로 그들의 활성화 상태 및 위치를 결정 하는. 이 포함 하는 종양-infiltratrating lymphoctyes (TILs, T-와 B-), 종양 침투 대 식 세포 (Tam), 자연 킬러 세포 종양 침투 (NKs) 및 종양 상주 수지상 세포3,,1314 , 15 , 16 , 17, 그리고 특정 셀18,,1920, 등등의 subcellular 지 방화. 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 또는 흐름 cytometry는 일반적으로 셀의 특정 파라미터를 측정 하는 데 사용 되는 단일 셀 탐지 기술. 멀티 컬러 cytometry 조치 단일 셀3,,421 에 여러 마커 흐름과 숫자와 면역 세포의 다른 하위 집합의 상대적 비율을 결정 하기 위해 가장 일반적으로 사용된 방법입니다. 그 종양을 포함 하 여.
이 보고서는 면역 세포 종양 침투를 프로 파일링 하는 절차를 설명 합니다: 1) SC 주입; 함께 orthotopic PDAC 마우스 종양 homografts의 주입 2) 종양 조직 수확 및 종양 분리; 통해 단일 셀 준비 모든 기준;으로 종양에서 파생 된 셀의 3) 흐름 cytometry 분석 4) 두 이식 방법의 기본 프로 파일의 비교.
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Protocol
모든 프로토콜 및 목 또는 동물의 사용 및 관리 절차 검토 하 크라운 생명 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 연구의 행위 사전 승인 합니다. 관심과 동물의 사용 일반적으로 실시 됩니다 AAALAC (평가 및 실험 동물 관리 인증 협회) 국제 지침에 따라 관리를 사용 하 여 실험실 동물의, 국가 연구 가이드에 보고 위원회 (2011 년). 모든 동물 실험 절차 SPF (특정 병원 체 무료) 시설에서 무 균 조건 하에서 것 및에 따라 가이드와 함께 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 (예: 다른 정부 기관에서 실시 국가 학회 건강의). 프로토콜 시설 기관에서 동물 실험의 윤리 위원회에 의해 승인 될 필요가 있을 것 이다 (예: 기관 IACUC 위원회).
1입니다. 종양이 식 위한 준비
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동물 주택
- 상업적인 사육 업체에서 일반 C57BL/6 마우스를 가져옵니다.
- 다음과 같은 조건에서 개별 통풍이 장에 하우스 마우스 (5): 온도: 20-26 ° C; 습도 30-70%; 사이클을 조명: 12 h 빛 및 어두운 12 h.
- 매주 변경 사용 옥수수 옥수수 속 침구입니다.
- 다이어트에 대 한 전체 연구 기간 동안 방사선 살 균 건조과 립 식품을 제공 합니다.
- 물, 동물 식 수 살 균을 무료로 이용할을 제공 합니다.
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기증자 종양 조각 준비
- 종양-베어링 기증자 쥐의 캘리퍼스 측정 하 여 균형, 및 종양 볼륨 (TV)를 사용 하 여 무게를 통해 체중 (BW)를 모니터링 하 여 시작 합니다.
- TV 500-1200 m m3에 도달 하면 프로토콜에 의하여 생물 후드에 동물을 안락사.
- Iodophor 면봉을 사용 하 여 종양 주위의 피부를 소독.
- 수술로 종양을 제거 (섹션 3에서에서 설명 하는 세부 사항: 검 시 및 종양 수확) PBS의 20 mL를 포함 하는 페 트리 접시에 종양을 배치 (미디어 또는 동물을 euthanizing 이전 4 ° C를 버퍼에 미리 진정).
- 오염 혈액이 있는 경우에, 다른 페 트리 접시에 종양을 전송 하 고 PBS 가진 종양을 씻어.
- 어떤 여분의 피부, 혈관, 석 회화 및 괴 제거 반으로 종양을 잘라.
- 그대로 조각의 종양 선택 및 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브에 그들을 배치 그리고 PBS의 20 mL를 추가 약리학 연구에 대 한 별도 동물 방에 튜브를 전송.
2. Orthotopic 및 피하 (SC) Engraftment
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SC 접종
- 잘라 종양 2 mm 직경 조각 각 trocar, SC 주입 또는 나중 orthotopic 주입 (아래 참조)에 1 덩어리를 퍼 팅, 메스를 사용 하 여.
- 코 콘 1%에 의해 유지 되는 5 %isoflurane 받는 사람 동물 anesthetize 동물 자신의 righting 반사를 잃고 긴장, 시작 하 고 결국 움직이지 될 것 이다. 마 취의이 깊이에서 그들은 수 있습니다 쉽게 될로 들었습니다 고통 스러운 자극; 마 취 통증 같은 응답 결 석까지를 허용 합니다.
- 일단 마 취, 오른쪽 측면 위치에 실험 보드에 쥐를 수정 합니다. 소독 iodophor 면봉, 특히 종양 주변 영역을 사용 하 여 마우스.
- 메스, 왼쪽된 측면, 그냥 엉덩이 두개골에 0.5 ~ 1.0 cm 피부 절 개를 만들.
- 무딘 집게와 2 ~ 3 센티미터, forelimb 쪽으로 피부 아래 터널.
- Aseptically 매체에서 종양의 한 큐브를 전송 하 고 피하 터널 깊숙한 곳.
- 시각적으로 확인 종양 깊은 터널에서 (그리고 피부 절 개에 아닙니다).
- 클립을 상처와 상처를 닫습니다.
- 그들은 sternal recumbence를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 동물 게시물 접종을 모니터링 합니다. 마 취에서 그들의 전체 복구 후 그들의 감 금 소에 다시 동물을 반환 합니다. 마 취 로그를 완료 하 고 동물 건강 차트를 시작. 3 일 동안 매일 받는 사람 동물의 무게
- 표준 절차에 대 한 종양 성장 모니터링에 대 한 그룹 당 5-10 쥐를 예방.
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췌 장 orthotopic 주입
- 마 취와 진통
- 2 mL 마 취 제 주입 및 5.91 살 균 분사 물 또는 0.06-0.1의 복용량 볼륨에 식 염 수에 혼합 0.42 mL xylazine 주입 (20 mg/mL)을 사용 하 여 mL/20-25 g 몸 무게.
참고:에 따라 동물 복지, 진통은 필요한 모두 예약 및 게시 작업. 0.05-0.1 mg buprenorphine /kg, 사우스 첫 번째 접종 전 작업이 며, 다음 복용 3 시간 매 4 시간 post 작업 계속.
- 2 mL 마 취 제 주입 및 5.91 살 균 분사 물 또는 0.06-0.1의 복용량 볼륨에 식 염 수에 혼합 0.42 mL xylazine 주입 (20 mg/mL)을 사용 하 여 mL/20-25 g 몸 무게.
- Orthotopic 이식에 대 한 외과 수술
- 2.2.1 단계 마다 근육 주사 (IM)를 통해 마우스 anesthetize
- 동물은 완전히 마 취 후 오른쪽 측면 위치에 실험 보드에 쥐를 수정 합니다.
- 오른쪽 측면 위치에 쥐를 유지. 요오드와 함께 다음 75% 에틸 알코올로 드 iodinate 비장 주위 피부를 소독.
- 비장 중간 지점을 발견 하 고 1 cm 수직 절 개 노출 비장 하 복 부에.
- 아래 비장 췌 장 조직의 일부가 밖으로 부드럽게 플랫 팁 핀셋으로 그리고 받는 사람 마우스의 마우스 homograft 종양 조각 췌 장에 씨 마우스에서 9-0 흡수 성 수술 용 봉합 사로 봉합 합니다.
- 두 배 솔 기 6-0 비단 봉합과 복 부를 닫습니다. 압축 하 여 항상성을 얻을.
- 마무리 종양 이식 후 출혈도 종양 조직 발생, 만약에 따뜻한 동물을 계속.
- Sternal recumbency;을 유지 하기 위해 충분 한 식을 차릴 때까지 동물을 모니터링 마 취에서 완전히 회복 후 동물을 동물을 반환 합니다. 종양 생쥐 비장 근처 복 palpating 하 여 베어링을 모니터링 하 고 orthotopic 종양 방위 쥐 밖으로 선택 합니다.
- 마 취와 진통
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종양 방위 쥐 건강 모니터링
- 매일에 소비를 된 물과 식품을 확인 하십시오.
- Ungroomed 머리 코트, 덩어리, 두께, 비정상적인 호흡 또는 복수에 대 한 마우스 모양을 확인 합니다.
- 복 부 간 또는 비장에 자발적인 종양 확인를 만져합니다
- 매주 균형을 사용 하 여 마우스의 무게.
- 쥐 샘플 수집 및 검 시에 대 한 희생은 다음과 같은 임상 증상의 관찰 하는 경우: BW 손실 > 20%; 장애인 이동성 (먹거나 마실 수 없는); 상당한 ascites 및 확대 복 부; 일반적으로 이동할 수 없습니다 호흡에 노력입니다.
3. 검 시 및 종양 수확
- 시각 및 종료 전에 만져 서 종양의 존재에 대 한 촉진 하 여 검사 합니다.
- 종료, 먼저 승인 된 프로토콜에 따라 마우스를 안락사 하 고 복 부를 열고 시각적으로 췌 장 종양에 대 한 검사.
- 게시물 치명적 수술으로 종양을 잘라내어 차가운 PBS에 추가. 사용 되는 이산화탄소의 배달을 위해 포트와 특별 한 뚜껑 청소, 충전, 반투명 안락사 챔버에 모든 동물을 배치 합니다.
- 동물에 최소한의 고통으로 급속 한 무 의식 생산 유량에 챔버로 가스를 방전. CO2 에 대 한 최적의 유량 약 2-2.5 L/min 이어야 한다.
- 시각을 모든 동물 받을 적절 한 가스 농도 euthanize 절차 동안의 식을 회복 하지 할 안락사 절차 중 각 동물을 관찰 합니다.
- 동물 복구할 수 있는 가능성을 최소화 하기 위해 명백한 임상 죽음 후 적어도 1 분 동안 가스 흐름을 유지 (만약 apneic 하지만 죽지).
- 인접 한 비 종양 조직을 제거 합니다. 청소 종양은 신속 하 게 촬영 될 수 있습니다.
RPMI-1640에 종양 조직을 넣고 분리 전에 얼음에 계속.
참고: 동물 시체는 체포 하 고 기다리고 제거 적절 한 냉장고에 저장.
4. 종양 조직 분리 및 단일 셀 준비
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시 약 준비
참고: 종양 분리 키트 포함 효소 d (동결 건조 된 분말), 효소 R (동결 건조 된 분말), 1 (동결 건조 된 분말) 효소 A의 유리병과 버퍼 a.의 1 mL의 1 유리병 2 병- RPMI-1640의 3 mL와 함께 각 유리병에 동결 건조 된 분말을 재구성 하 여 효소 D를 준비 합니다. Aliquots 반복된 동결-해 동 주기를 피하기 위해 적절 한 볼륨을 준비 합니다.
- RPMI 1640의 2.7 mL와 함께 유리병에 동결 건조 된 분말을 재구성 하 여 효소 연구를 준비 합니다. Aliquots 반복된 동결-해 동 주기를 피하기 위해 적절 한 볼륨을 준비 합니다.
- 버퍼는 키트와 함께 제공 되는 A의 1 mL와 함께 유리병에 동결 건조 된 분말을 재구성 하 여 효소 A를 준비 합니다. 와 동 하지 마십시오. Aliquots 반복된 무료-재개-사이클을 피하기 위해 적절 한 볼륨을 준비 합니다.
- 각 gentleMACS C-튜브에 RPMI-1640, 효소 D의 100 µ L, 효소 R의 50 µ L 및 효소 A의 12.5 µ L의 2.35 mL을 추가 하 여 효소 혼합을 준비 합니다.
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종양 분리
- 각 종양에 대 한 종양 소화 믹스 한 C-튜브 준비, 섹션 4.1 소화 버퍼 희석 및 준비를 참조 하십시오.
- 사용 3 mL 소화 버퍼 종양 조각 < 0.8 g, 그리고 종양 완벽 하 게 소화.
- 코드 연구, 종양, 마우스 ID, 치료 그룹, 및 종양 무게와 레이블을 지정 합니다.
- 마우스에서 종양을 수집, 차가운 PBS에 종양을 세척 하 고 청소 종양 (예: 혈관, 지방, 근 막 등)에 연결 하는 조직.
- 살 균 6 잘 플레이트의 한 잘에서 소화 미디어에 종양을 넣어.
- 멸 균 핀셋/집게와 장소와 메스와 조각에서 종양을 개최. 작은 조각 (~ 1 m m3)에 침입 하는 종양을 충분히 슬라이스.
- C 관으로 다시 종양 조각을 놓고 나머지 소화 버퍼를 사용 하 여 세척 접시를 다음 소화까지 얼음에 배치 된 C-튜브에 액체를 전송 합니다.
- 히터는 dissociator에 스위치.
- 빈 위치의 소매에 거꾸로 종양 분리 C 튜브를 놓고 관 입장 무료 선택의 상태를 조정 합니다. 프로그램 목록 표시 됩니다 필요한 폴더의 선택에 의해 다음 분리 프로그램 (37_c_m_TDK_1)을 선택 합니다.
- 프로그램의 종료 후 C-튜브 dissociator와 스핀 짧게 (300 x g, 4 ° C) 작은 샘플을 벗어.
- 다시 샘플을 일시 중단 하 고 50 mL 튜브 위에 셀 여과기에 넣어. 워시 버퍼를 제공 하는 단일 셀 서 스 펜 션의 10 mL와 함께 셀 스 트레이너를 통해 세포를 씻어.
- 5 분에 대 한 300 x g 에서 튜브 원심, 삭제는 상쾌한 고 다시 중단 워시 버퍼의 5 mL와 함께 셀 수 가능한 셀 trypan 블루 / 셀 카운터를 사용 하 여 1 x 106 셀 튜브 또는 샘플 셀 concentraton 조정. 되도록 얼룩 특정 올바른 isotype 제어 항 체를 포함
5. 면역 패널 설계 및 흐름 데이터 수집
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패널 디자인
- 표 1을 참조 하십시오.
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Immunostaining
- Fc-블록 샘플 셀: 셀 1 µ g/mL Fc-블록, 어둠 속에서 15 분 동안 얼음 또는 4 ° C 냉동에 외피 다음 버퍼를 얼룩이 지기의 200 µ L에 다시 중단.
- (예원하는 항 체/형광 패널을 사용 하 여 얼룩 셀. T-cell 패널, 대 식 세포 패널, 등.): 항 체 혼합물 각 샘플, 어둠 속에서 얼음에 30 분 이상 얼룩에 Fc 블로킹 버퍼에 희석을 추가.
- 각 튜브를 얼음 차가운 PBS의 1 mL을 추가 하 고 다시 일시 중단 셀 부드럽게, 다음 5 분 삭제 결과 상쾌한에 대 한 300 x g 에서 원심 분리.
- 셀을 두 번 씻고를 반복 합니다.
- 필요한 경우 세포내 표식에 대 한 얼룩, 다음 단계 6-10, 그렇지 않으면 10 단계로 이동.
- 다시 펄스 소용돌이 의해 셀 펠 릿을 일시 중지 하 고 각 샘플에 대 한 준비 고정/Permeabilization 작업 솔루션의 200 µ L를 추가 합니다. 다시, 소용돌이 펄스와 다음 4 ° C에서 품 어 하룻밤 (선호) 또는 어둠 속에서 실 온에서 30 분.
- 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 제거는 상쾌한.
- Permeabilization 버퍼 (Permeabilization 버퍼, 희석 증류수 H2O와 x 10에서 만든) x 1의 1 mL 다음 원심 분리 하 여 추가 하 고 상쾌한의 decanting 여 두 번 세척.
- 세포내 마커 항 체 Permeabilization 버퍼 x 1에 추가 하 고 어둠 속에서 30 분 동안 실 온에서 품 어.
- 셀 Permeabilization 버퍼 x 1의 1 mL로 두 번 씻는 다. 원심 및 상쾌한 가만히 따르다.
- Resuspend 얼룩 버퍼의 150 µ L에서 세포 고는 cytometer 분석. 때문에 고정 및 permeabilization 절차, FSC (앞으로 빛 분산형) / 셀 인구의 SSC (들 피해 라) 배포 셀 사는 다른 것입니다. 따라서, 게이트 및 전압 수정 필요 합니다.
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FMO 컨트롤 (컨트롤-형광)
참고: 다 색 흐름 분석 면역 세포 종양 침투의 분석을 위해 특히 중요 하다. 따라서, 주어진된 패널에 여러 형광으로 확산 하는 데이터의 컨텍스트에서 셀 게이트를 식별 하는 방법의 찾을 필요가 있다. FMO (1 마이너스 형광) 컨트롤은이 목적을 위해 중요 한 방법.- 이 위해, FMO 컨트롤 (Rx 당 적어도 2)에 대 한 각 그룹에 개별적으로 각 조직에 대 한 프로세스 추가 마우스를 포함 합니다. 분리, 후 조직 수영장. 예를 들어 4 Rx 그룹 연구, 8 추가 종양 한다 개별적으로 처리 되며 다음 FMOs에 대 한 하나의 샘플에 풀링된.
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흐름 장비 설치
- 기계 (20 분 이상)을 워밍업 하는 동안 보상 비즈를 확인 합니다.
- CS 및 T 비즈를 사용 하 여 성능을 확인 하.
- 전압 및 보상 설정: UltraComp 구슬, 소용돌이 빌려 사용 하기 전에 철저 하 게 비즈를 사용 하 여.
- 각 형광 색소 활용 된 항 체에 대 한 별도 12 x 75 m m2 샘플 튜브를 레이블을 지정 합니다.
- 각 튜브에 버퍼를 얼룩이 지기의 100 µ L를 추가 합니다. 각 튜브를 구슬의 1 전체 드롭 (약 60 µ L)를 추가 합니다.
- 항 체를 추가 하 고 섹션 4에에서 명시 된 샘플 과정으로 정확 하 게 얼룩 절차를 수행 합니다.
- 각, 버퍼 완전히 다시 소용돌이 통해 구슬 알갱이 일시 중단 하려면 얼룩의 0.5 mL를 추가 합니다.
- 주어진 실험 대상 조직 당 교류 cytometer PMT 전압을 설정 합니다.
- 데이터 수집을 위한 교류 cytometer 통해 게이팅 FSC 그리고 SSC 독서 당 내의 비드 인구에 의해 실행 합니다.
- 주위 설정된 유량 200-300 이벤트/s.
- 주어진된 fluorescein [FITC]에 대 한 적절 한 보상을 설정-활용 된 항 체, 사용 된 FL1 대 FL2 점 플롯.
- 사분면 게이트를 부정적인 구슬 낮은 왼쪽된 사분면 내 긍정적인 구슬 상단에는 또는 낮은 오른쪽 장소 사분면. 각 인구 (사분면 통계 창에서와 같이)의 메디아 형광 강도 (MFI)은 약까지 보상 값을 조정 (즉 FL2 %FL1 대 한, 두 구슬의 FL2 MFI 유사 해야).
- 모든 튜브 5.4.11-5.4.12 단계를 반복 합니다.
- 샘플을 얼룩이 실제 인수를 진행 합니다. 보상 마법사를 실행 하 고 "날짜 실험 이니셜" 형식으로 설정을 저장 합니다.
6. 흐름 데이터 분석 및 프레 젠 테이 션
- Flowjo / 칼루 차에 의해 데이터를 분석 합니다.
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Representative Results
PDAC Orthotopic 이식 결과 급속 한 종양 성장 SC 주입에 대 한 본 비슷합니다. 기증자 종양 조각을 받는 쥐로 이식 된 후 모두 피하 및 2.1과 2.2 프로토콜에 따라 orthotopically 단계에 설명 된, 그림 1A와 같이 이식된 KPC homograft 종양 유사한 급속 한 성장을 보여주었다 . KPC homograft 종양 다른 시간 지점에서 수확 그림 1B 에서 표시 되 고 대표 H & E 이미지 그림 1C표시 됩니다. 우리의 데이터 시연 SC의 비슷한 성장 및 orthotopic 임 플 란 트.
실행 가능한 종양 세포 및 셀 orthotopic 또는 SC 주입에서 발생 하는 면역 세포 종양 침투를 포함 하 여 TME, 효율적으로 복구할 수 있습니다. 종양 수확 되었고 이후 FACS 분석 4 단계에서에서 설명 하는 프로토콜에 따라 상업 dissociator (그림 2A)를 사용 하 여 단일 셀 정지 준비를 소화. 우리는 일반적으로 이식 (~ 80% 생존 기반으로 Trypan 파랑); 두 유형의 종양 샘플에서 합리적으로 높은 가능한 셀 수익률을 얻은 FACS 작의 대표적인 종양, 죽은 세포/세포 파편 (그림 2B)에서 분리 가능한 세포를 보여줍니다.
동안 그들의 프로 파일 차이의 다른 하위 집합 면역 세포 종양 침투 orthotopic에 SC 이식 종양 확인 되었습니다. 4.2 단계에서 설명한 방법을 사용 하 여 종양 조직에서 준비 단일 셀 서 스 펜 션 나온 표 1는으로 중요 한 면역 세포의 다른 계보를 커버 하는 마커의 16 색상 패널 얼룩 후 FACS 분석 대상이 됐다 뿐만 아니라 종양 세포. 대표적인 흐름 플롯 함께 제어 전략 또는 면역 혈통 계층 그림 3A에 표시 됩니다. CD45, 모든 성숙 면역 세포에 대 한 마커 구별 종양 세포와 면역 세포 종양 침투를 위해 사용 되었다. 모든 면역 계보 CD45에서 분석 이후에 되었다+ 인구 패널 (표 1)에 의해 표시 된 대로.
마커, 옆에 셀 크기는 셀의 하위 집합, T, B 림프 톨, 대 식 세포와 MDSCs를 포함 하 여 계량 (그림 3B 왼쪽) 다른 부분 모집단을 차별화 하는 또한 사용 한다 등. 종양 면역 프로필 비교 췌장암의 사우스 캐롤라이나 대 orthotopic homografts의 침투. 종양 면역 세포 침투의 몇 가지 주요 하위 집합의 주요 열거 세포 인구 그림 3C표시 됩니다. 데이터는 명확 하 게 종양 건강 한 쥐의 췌에 비해 면역 세포 침투를 증가 크게는 다는 것을 보여줍니다. 또한, 면역 세포 종양 침투의 부분 집합의 다른 비율 orthotopic 대에서 발견 됐다. SC homografts, 예를 들면 사우스에 보다 orthotopic에 훨씬 더 많은 B 세포
| 표식 | 면역 세포 인구 |
| CD45 | 총 백혈구 |
| CD3 | 총 T 세포 |
| CD4 | CD4 + T 보조 세포 |
| CD8 | CD8 + 세포 독성 T 세포 |
| CD44 / CD62L * | 순진한, 메모리 및 효과 기 T 세포 |
| CD69/CD44/OX40/CD25 등* | 활성화 마커 |
| CD4 + CD25 + FoxP3 + | 규정 하는 T 세포 |
| CD11b + Ly6c/Ly6g | G-MDSC 및 M-MDSC |
| CD11b + f 4/80 | 대 식 세포 |
| IA/IE/CD206 | M1 및 m 2 대 식 세포 |
| CD3-CD335 + | NK 세포 |
| CD3 + CD335 + | NKT 세포 |
| CD19 | B 세포 |
| TNF-a/IFN-r/IL-7/일-3 등* | 크린 시 토 킨 |
| PD-1/PD-L1/CTLA-4/팀-3 등* | 검사점 억제제 |
| Granzym B 등* | 일반적으로 요청 된 마커 |
| KI67/Brd U/PNCA 등 | 확산 |
| 라이브/죽은 (고칠 수) | 라이브/죽은 |
| * 참고: 필요에 따라 추가 될 수 있습니다 더 마커 | |
표 1: 16 색 흐름 패널 마우스 면역 세포 종양 침투의 분석을 위해 설계 되었습니다.
그림 1: 모두 orthotopic 및 SC (subQ) 이식 C57BL/6 마우스 시연 비슷한 성장 또는 gemcitabine 치료 없이 PDAC homograft 종양. (A) 성장 곡선: 사우스 캐롤라이나-왼쪽, 그리고 orthotopic 오른쪽. 블루: 차량; 골드: Gemcitabine (평균 SC 종양 볼륨 200 m m3에 도달 하면 하루 10 게시물 접종에 시작). (B) 종양 조직에서 서로 다른 포인트를 시간. (C) 대표 H & E homografts (40 x 10)의 두 종류의 얼룩. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 종양 조직 분리 가능한 단일 세포 현 탁 액을 준비 하. (A) disassociator;의 사용 흐름 분석에 의해 표시 된 것 처럼 (B)는 실행 가능한 세포, 죽은 세포에서 분리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: orthotopic와 SC PDAC homografts의 면역 세포 종양 침투의 멀티 컬러 흐름 분석. 각 종양 샘플에서 원시 데이터 분석 Flowjo FACS 분석 소프트웨어를 사용 하 여 다음 흐름 cytometry 악기에서 인수 했다. (A) 표준 제어 전략 분석, 대 한 예를 들어; 표시 (B) 대표적인 흐름 게이팅 및 분석 사용 하 여 데이터 표준 게이팅 전략; (C) 대표적인 종양 침투 면역 cellsare B-세포, 대 식 세포, Treg 등을 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
비록 연구 SC 종양을 사용 하 여 더 쉽게 실시 하 고, orthotopically 이식 종양 모델 수 있습니다 전 임상 약리학 연구 (특히 I/O 조사)에 대 한 관련성이 향상 된 translatability를 제공 하. 이 보고서는 관심이 독자/시청자 직접 그들의 각각 연구에 사용할 수 있는 기술 절차를 시각화 수 있도록 목표로 합니다. 우리의 프로토콜 입증 그 orthotopic PDAC 이식 효율적인 종양 성장, SC 주입 비슷한 발생할 수 있습니다. 우리의 관측은 또한 다른 implantations에서 TMEs의 다른 면역 프로 파일의 존재를 제안 것 같다. SC implantations에 비해 orthotopic 맞게 주요 과제는 복잡 한 기술은 필요 하다, 과정은 많은 시간이 소요, 이식에 대 한 수술 절차는 노동 집약은 또한 모니터링 orthotopic 종양에 어려움 인생에서 성장입니다.
Orthotopic 췌 장 종양 실험은 성공적으로 수행 되도록 4 개의 중요 한 단계가 있다: 1) 수술 주입; 2) 신중 하 고 적절 한 모니터링 종양 개발; 3) 사전 실험을 수행의 중요성은 먼저 테스트 절차를 숙지 하 고 평가 받아 속도 종양 성장 율; 4) 해리 종양의 단일 셀 정지 engraftment 대체 방법으로 사용합니다. 이 보고서 절차가 특정 homograft 뿐만 아니라 다른 췌 장 orthotopic 모델을 사용 하 여 연구를 수행 하기 위한 독자 들에 게 도움이 이며 심지어 다른 orthotopic 모델 관련 된 복 부 개방 수술.
Cytometry 교류 또는 FACS는 현재 immunoprofiling를 수행 하기 위해 가장 중요 한 도구입니다. FACS에 의해 종양의 Immunophenotyping는 크게 다음과 같은 방법으로 골 수, 림프절, 비장, 말 초 혈액 등 다른 장기에서 세포의 다릅니다. 일반적으로, 면역 세포 종양 (작은 샘플 크기)에의 아주 작은 %가 있다. 종양과 면역 세포 존재의 적은 수의 극단적인이 회복 가능한 희귀 면역 세포 기술적으로 도전, 요구 하는 사용자 지정 개발 종양 조직 분리와 관련 된 기계를 확인 합니다. 두 이전 포인트 필수 멀티 컬러 cytometry 사용 하 여 동시 다중 매개 변수 측정을 확인 합니다. 멀티 컬러 흐름 복잡 한 마커 패널 디자인, 보상, 및 전략, 형광 스펙트럼 오버랩 때문 게이팅 해야 합니다. 이 보고서는 또한 관심이 독자/관객 들에 게 종양 면역 정의 된 종양 조직 분리 및 다 색 흐름 cytometry 분석을 통해 프로 파일링의 과정을 설명 하려고.
3 개의 중요 한 단계는 특히 생산성 분석까지 항복 하는 것이 중요 수: 첫째, 고수익 가능한 셀에서 발견 한 해리 종양 사용 하 여 사용자 지정 된 종양 분리 절차; 둘째, 큰 다 색 얼룩 패널 사용 가능한 약;에 따라 최적화 된 설계 셋째, 분석에 최적화 된 제어 전략. 저자는 훈련을 강조 하 고 싶습니다 하 고 데이터 수집 및 분석의 연산자의 경험의 때까지 성공적인 교류 cytometry 분석을 위해 필수적입니다.
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Disclosures
모든 저자는 크라운 생명 과학, i n c.의 현재 풀 타임 직원
Acknowledgments
저자는 박사 조디 Barbeau-중요 한 읽기 및 원고, 편집에 대 한 감사 드리고 그리고 삽화를 디자인 하기 위한 랄 프 마누엘을 감사 합니다. 저자는 또한 크라운 생명 종양 면역-종양학 바이오 마커 팀과 그들의 기술 노력에 대 한 종양 Vivo에서 팀을 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | \ | SAS3119 | \ |
| Trocar 20 | \ | \ | 2 mm |
| Petri dish | \ | \ | 20 mm |
| 100x antibiotic and antimycotic | \ | \ | \ |
| Iodophor swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Alcohol swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Liquid nitrogen | Air chemical | \ | \ |
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | \ |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | \ |
| antibodies | BD | \ | \ |
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | \ |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | \ |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | \ |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70 µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2 mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | \ |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | \ |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | \ |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | \ |
| FlowJo software | FlowJo LLC | \ | vs 10.0 |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50 mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | \ |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | \ |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10 cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10 cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | \ |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100 g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | \ |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | \ |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | \ |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8 mL |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | \ |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | \ | 1-5 mL |
| Studylog software | Studylog | \ | software |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50 mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15 mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4 °C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | -20 °C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | -80 °C |
| RNAlater | Thermo | am7021 | \ |
References
- Chevrier, S., et al. An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
- Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. Monitoring immune responses in the tumor microenvironment. Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).
- Mosely, S. I., et al. Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery. Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).
- Gunderson, A. J., et al. Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer. Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).
- Erdag, G., et al. Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma. Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).
- Gutiérrez-Garcia, G., et al. Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy. Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).
- Paiva, B., et al. PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma. Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).
- Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).
- Lavin, Y., et al. Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses. Cell. 169 (4), 750-765 (2017).
- Mahoney, K. M., et al. PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells. Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).
- Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining. Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).
- Jiang, Y., et al. ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer. Ann. Surg. , (2016).
- Ribas, A., et al. PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells. Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).
