Det experimentella förfarandet på immunophenotyping av murina ortotop PDAC homografts syftar till profilering av tumör immuno-mikromiljö. Tumörer är orthotopically implanteras via kirurgi. Tumörer i 200 – 600 mm3 i storlek var skördas och skiljas för att förbereda encelliga suspensioner, följt av flera immun markör FACS analys med hjälp av olika fluorescently-märkt antikroppar.
Homograft (syngena) tumörer är arbetshästen i dagens immunonkologiska (I/O) preklinisk forskning. Den tumör närmiljön (TME), särskilt dess immun-komponenter, är avgörande för prognos och Prediktion av behandlingsresultat, särskilt de av immunterapi. TME immun-komponenter består av olika undergrupper av tumör-infiltrera immunceller som taxeras av flerfärgade FACS. Pankreas duktal adenokarcinom (PDAC) är bland de dödligaste malignances saknar bra behandlingsalternativ, således ett brådskande och otillfredsställda medicinska behov. En viktig orsak till dess icke-lyhördhet för olika terapier (kemo-, målinriktad, I/O) har varit dess rikliga TME, bestående av fibroblaster och leukocyter som skydda tumörceller från dessa behandlingar. Orthotopically implanterade PDAC tros mer exakt återta TME av mänskliga pankreas cancer än konventionell subkutan (SC) modeller.
Homograft tumörer (KPC) är transplantationer av mus spontana PDAC härrör från genetiskt modifierade KPC-möss (KrasG12D / +/P53– / –/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). Den primära tumor vävnaden skärs i små fragment (~ 2 mm3) och transplanteras subkutant (SC) till syngena mottagare (C57BL/6, 7 – 9 veckor gamla). Homografts var sedan kirurgiskt orthotopically transplanteras på bukspottkörteln av nya C57BL/6 möss, tillsammans med SC-implantation, som nådde tumör volymer av 300 – 1000 mm3 av 17 dagar. Endast tumörer av 400 – 600 mm3 var skördas per godkänt obduktion förfarande och rengöras för att avlägsna de intilliggande icke-tumörvävnad. De var separerade per protokoll använder en vävnad dissociator i enskild cell suspensioner, följt av färgning med utsedda paneler av fluorescently-märkta antikroppar för olika markörer av olika immunceller (lymfoida, myeloisk och NK, DCs). De färgade proverna analyserades med flerfärgade FACS för att bestämma antalet immunceller som olika härstamningar, samt deras relativa procentandel inom tumörer. Immun profiler av ortotop tumörer jämfördes sedan med SC tumörer. De preliminära uppgifterna visade förhöjt infiltrera TILs/TAMs i tumörer över bukspottkörteln och högre B-cell infiltration i ortotop i stället för SC tumörer.
Pankreas duktal adenokarcinom (PDAC) orsakar nästan hälften en miljon dödlighet world-wide årligen, en av de topp 5 cancer mördarna. Det finns några effektiva behandlingsalternativ och inga godkända immunterapier; Därför behövs desperat nya behandlingar. Cancer är alltmer att erkännas som immunologiska sjukdomar, inklusive PDAC, förutom de genetiska sjukdomarna som kallas idag. Immunologiska och genetiska faktorer skulle sannolikt avgöra sjukdom prognos samt behandling utfall. Tumörer undgå värd immun övervakning och så småningom avancera för att orsaka död. Många av dessa immuna processer förekommer inom den tumör närmiljön (TME)1,2,3,4 där olika typer av immunceller interagera med tumörceller, med varandra och med andra tumör stromaceller komponenter, direkt eller indirekt via cytokiner som i slutändan avgör sjukdom resultatet. Karakterisering av tumör immun komponenter av TME eller tumör immunophenotyping, inklusive subtypning, numrering och lokalisering av olika härstamningar av immunceller, är därför avgörande för att förstå anti-tumor immunitet. När det gäller PDAC, har det föreslagits att förhöjda tumör-infiltrera suppressiv makrofager (TAM) och B-celler har lett till förebyggande av T-cell infiltration eller aktivering och höga nivåer av fibros5,6.
Det gemensamma förhållningssättet till utreda immun TMEs experimentellt skulle använda surrogat tumör prekliniska djurmodeller, främst relevant mus tumör modeller7, särskilt mus syngena (homograft) eller genetiskt modifierade musmodeller (GEMM) av cancer, den förmodade likheten mellan mus och människa för tumörer och immunitet8,9. I verkligheten är det underförstått att det finns inneboende skillnader mellan två arter10,11.
Transplanterade mus tumörer har betydande operativa fördelar över spontana tumörer7, nämligen synkroniserade tumörutveckling, i motsats till den föräldra GEMM spontana tumörutveckling. Homografts av spontana murina tumörer anses primära tumörer har aldrig varit manipulerade in vitro-och spegling ursprungliga mus tumör histo- / molekylär patologi7, samt möjligt immuna profiler. Dessa murina homografts anses ofta vara ”en mus version av patientderiverade xenograft (PDXs)”. De har därför sannolikt en bättre översättbarhet än konventionella syngena cell linje-derived mus tumörer12. Särskilt härrör många homografts från specifika GEMM där specifika mänskliga sjukdomsmekanismer, e.g. onkogena driver mutationer, är konstruerade, och dessa homografts bör därför ha fördelar till deras kliniska relevans. I synnerhet utveckla KPC GEMM mus PDAC inom 15 – 20 veckor ålder, som morfologiskt recapitulates mänskliga sjukdomar med huvudsakligen brunn – till måttligt-differentierade glandular arkitektur och höganrikat stroma. Denna modell recapitulates också de vanligaste genetiska särdrag av mänskliga PDAC, nämligen Kras aktiverande mutation och P53 förlust-av-funktion, som förekommer i 90% och 75% av mänskliga PDAC, respektive5,6.
Platser av transplantation har också föreslagits för att spela en roll i modell översättbarhet. Specifik vävnad omgivningen, såsom en motsvarande ortotop miljö, kan vara en nisch för specifika tumörer till framsteg, i motsats till den enhetliga subkutan (SC) miljöer för vanligen transplanterade tumörer. Det skulle vara av särskilt intresse om och/eller, vilken skillnad finns mellan de två platserna som transplantation, vad gäller immun-närmiljön och relevansen för människa cancer, t.ex. När det gäller PDAC.
En av de viktigaste aspekterna av immun profilering, eller immunophenotyping, är att fastställa tumör-infiltrera immunceller av olika härstamningar, numrerar, relativa andel inom tumörer, samt deras aktivering stater och platser. Detta inkluderar tumör-infiltratrating lymphoctyes (TILs, både T- och B-), tumör-infiltrera makrofager (TAMs), tumör-infiltrera naturliga mördarceller (NKs) och tumör-resident dendritiska celler3,13,14 , 15 , 16 , 17och subcellulär lokalisering av vissa celler18,19,20, etc. Fluorescens aktiverad Cell sortering (FACS) eller flöde flödescytometri är en encellig detection-teknik som ofta används för att mäta de specifika parametrarna i en cell. Flerfärgade flow flödescytometri åtgärder flera markörer på en enda cell3,4,21 och är den vanligaste metoden för att fastställa antal och relativa andel av olika undergrupper av immunceller, inklusive de inom tumörer.
Denna rapport beskriver procedurer för profilering tumör-infiltrera immunceller: 1) Implantation av ortotop PDAC mus tumör homografts, tillsammans med SC implantation; (2) tumör vävnad skörd och enda cell förberedelse via tumör dissociation; (3) Flödesanalys för flödescytometri av alla celler härstammar från tumörer som utgångspunkt; (4) jämförelse av baslinjen profiler både metoder för transplantation.
Även om studier med SC tumörer görs lättare, kan orthotopically implanteras tumörer modeller potentiellt vara mer relevant för prekliniska farmakologiska studier (särskilt I/O utredningar) att ge förbättrad översättbarhet. Denna rapport syftar till att hjälpa intresserade läsare/publiken för att kunna direkt visualisera de tekniska förfaranden som kan användas i deras respektive forskning. Våra protokoll visar att ortotop implantation av PDAC kan leda till effektiv tumörtillväxt, liknar SC implantation…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr Jody Barbeau – för kritisk läsning och redigering av manuskriptet och tacka Ralph Manuel för utformning av konstverk. Författarna vill även tacka Crown Bioscience onkologi immunonkologiska biomarkör laget och onkologi I Vivo team, för deras stora tekniska insatser.
Anesthesia machine | SAS3119 | ||
Trocar 20 | 2mm | ||
Petri dish | 20mm | ||
100x antibiotic and antimycotic | |||
Iodophor swabs | Daily pharmacy purchase | ||
Alcohol swabs | Daily pharmacy purchase | ||
Liquid nitrogen | Air chemical | ||
Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | |
FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | |
antibodies | BD | ||
Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | |
FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | |
Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | |
cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70µm |
routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2mL |
Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
6-well plates | Corning | 3516 | |
Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | |
UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | |
Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | |
FlowJo software | FlowJo LLC | vs 10.0 | |
PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50mL |
RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | |
Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
knife handle | Jin zhong | J11010 | |
eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10cm |
eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10cm with teeth |
Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | |
Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100g |
Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | |
Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | |
Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8ml |
Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | |
syringes | Shanghai MIWA medical industry | 1-5mL | |
Studylog software | Studylog | software | |
Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50mL |
Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15mL |
Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4°C |
Ice bucket | Thermo | PLF-276 | —20°C |
Ice bucket | Thermo | DW-862626 | —80°C |
RNAlater | Thermo | am7021 |