Summary
El procedimiento experimental en el immunophenotyping de homoinjertos PDAC Murino ortotópico pretende perfilar el inmuno-microambiente tumoral. Los tumores son orthotopically implantado mediante cirugía. Tumores de 200 – 600 mm3 en tamaño fueron cosechados y disociados para preparar suspensiones de unicelular, seguidos del análisis de marcador múltiple inmunológico FACS utilizando diferentes anticuerpos marcados con fluorescencia.
Abstract
Tumores (syngeneic) homoplastia son el caballo de batalla de investigación preclínica de la inmuno-Oncología (entrada-salida) de hoy. El microambiente del tumor (TME), particularmente sus inmune-componentes, es de vital importancia para el pronóstico y la predicción de los resultados del tratamiento, especialmente los de inmunoterapia. TME inmune-componentes están compuestos de diferentes subconjuntos de células inmunes tumor-infiltración evaluables por FACS de varios colores. Adenocarcinoma ductal pancreática (PDAC) es entre el malignances mortales falta de opciones de buen trato, así una necesidad médica urgente y no satisfecha. Una razón importante para su no respuesta a diversos tratamientos (quimio-, apunta, I/O) ha sido su abundante TME, formado por fibroblastos y leucocitos que protegen las células del tumor de estas terapias. Orthotopically PDAC implantada parece más precisa recuperar la TME de los cánceres pancreáticos humanos que los modelos convencionales de (SC) subcutáneos.
Tumores de la homoplastia (KPC) son transplantes de ratón espontáneo PDAC origina KPC-ratones transgénicos (KrasG12D / +/ /Pdx1-53- / -PCre) (KPC-GEMM). El tejido del tumor primario se corta en fragmentos pequeños (~ 2 mm3) y trasplantado por vía subcutánea (SC) a los destinatarios syngeneic (C57BL/6, 7 – 9 semanas de edad). Los homoinjertos fueron entonces quirúrgico orthotopically trasplantado en el páncreas de ratones C57BL/6 nueva junto con la implantación de SC, que volúmenes tumor de 300 – 1.000 mm3 por 17 días. Sólo tumores de 400 – 600 mm3 fueron cosechados por el procedimiento de autopsia aprobado y limpiarse para eliminar los tejidos no tumorales adyacentes. Se disocia según el protocolo utilizando un Disociador de tejido en suspensión unicelular, seguida de tinción con paneles designados de anticuerpos marcados con fluorescencia para diversos marcadores de células inmunes diferentes (linfoide, mieloide y NK, DCs). Las muestras teñidas se analizaron varios colores FACS para determinar el número de células inmunes de diferentes linajes, así como su porcentaje relativo dentro de los tumores. Los perfiles inmunes de los tumores ortotópicos entonces fueron comparados con los de tumores de SC. Los datos preliminares demostraron significativamente elevadas infiltración TILs/TAMs en tumores en el páncreas y mayor infiltración de células B en orthotopic en lugar de tumores SC.
Introduction
Adenocarcinoma ductal pancreática (PDAC) provoca casi la mitad un millón mortalidades por todo el mundo anualmente, uno de los asesinos de cáncer top 5. Hay pocas opciones de tratamiento eficaz y no inmunoterapias aprobadas; por lo tanto, se necesitan desesperadamente nuevos tratamientos. Tipos de cáncer están siendo reconocidos cada vez más como enfermedades inmunológicas, incluyendo la PDAC, además de las enfermedades genéticas como hoy. Factores inmunológicos y genéticos probablemente determinaría pronóstico de la enfermedad así como el tratamiento de los resultados. Los tumores evaden la vigilancia inmune del anfitrión y eventualmente avanzan para causar la muerte. Muchos de estos procesos inmunes producen en el microambiente tumoral (TME)1,2,3,4 donde diferentes tipos de células inmunes interactúan con las células del tumor, uno con el otro y con otro tumor componentes stromal, directamente o indirectamente vía citoquinas que determinan en última instancia, resultado de la enfermedad. Por lo tanto, caracterización de los componentes inmunes de tumor de la TME o tumor immunophenotyping, incluyendo subtyping, numeración y localización de distintos linajes de células inmunes, es fundamental para la comprensión de la inmunidad antitumoral. En el caso de PDAC, se ha propuesto que elevado macrófagos supresores tumorales infiltrantes (TAM) y células B han llevado a la prevención de la infiltración de células T y la activación y los niveles de fibrosis5,6.
El enfoque común para investigar experimentalmente TMEs inmunes sería usando sustituto modelos animales preclínicos de tumor, tumor de ratón principalmente relevantes modelos7, especialmente ratón syngeneic (homoinjerto) o modelos de ratón modificados genéticamente (GEMM) de cánceres, en la supuesta semejanza de ratón y humano para tumores e inmunidad8,9. Se entiende en realidad que hay diferencias inherentes entre los dos especies10,11.
Los tumores de ratón trasplantado tienen ventajas operacionales significativas en tumores espontáneos7, es decir, un desarrollo de tumores sincronizado, en contraste con el desarrollo de espontánea del tumor parental de GEMM. Homoinjertos de tumores murinos espontáneos se consideran tumores primarios nunca haber sido manipularon in vitroy ratón original espejado tumor histo- / molecular patología7, así como posibles perfiles inmunes. Estos homoinjertos murinos son considerados a menudo "una versión del ratón de xenoinjertos derivados del paciente (PDXs)". Por lo tanto tienen probablemente una mejor traducción de syngeneic de la célula convencional línea derivada ratón tumores12. En particular, muchos homoinjertos se derivan de GEMM específico donde se han diseñado mecanismos de enfermedades humanas específicas, por ejemplo mutaciones oncogénicas driver, y estos homoinjertos deben por lo tanto tienen ventajas a su relevancia clínica. En particular, la KPC GEMM desarrollar ratón PDAC dentro de 15 a 20 semanas de edad, que recapitula morfológicamente enfermedad humana predominantemente bien-moderadamente-distinguido arquitectura glandular y altamente enriquecido estroma. Este modelo también recoge las características genéticas más comunes de PDAC humano, es decir, Kras activa la mutación y pérdida-de-función P53, que ocurren en el 90% y 75% de PDAC humano, respectivamente de5,6.
Sitios del trasplante también se han sugerido para desempeñar un papel en la traducibilidad de la modelo. El específico entorno de tejido, como un entorno de orthotopic correspondiente, podría ser un nicho para tumores específicos para entornos de progreso, en contraposición a la subcutánea (SC) de uniforme para los tumores comúnmente trasplantados. Sería de particular interés if, o, qué diferencia existe entre los dos sitios de trasplante, en términos de microambiente inmunológico y la relevancia en cáncer en humanos, por ejemplo. en el caso de la PDAC.
Uno de los aspectos más importantes del perfil inmune o Inmunofenotipificación, es determinar infiltrantes de tumor de las células inmunes de diferentes linajes, los números, porcentaje relativo dentro de los tumores, así como sus Estados de activación y ubicaciones. Esto incluye lymphoctyes de infiltratrating de tumor (TILs, tanto T - y B-), macrófagos infiltrantes de tumor (TAMs), infiltrantes de tumor de células de asesino naturales (NKs) y reside en el tumor dendrítico de las células3,13,14 , 15 , 16 , 17y la localización subcelular de ciertas células18,19,20, etcetera. Fluorescencia activada célula clasificación (FACS) o flujo cytometry es una tecnología de detección unicelular que comúnmente se utiliza para medir los parámetros específicos de una célula. Varios colores las medidas de la citometría de flujo marcadores múltiples en una sola celda3,4,21 y es el método más comúnmente utilizado para determinar el número y porcentaje relativo de diferentes subconjuntos de células inmunes, las de los tumores incluidas.
Este informe describe los procedimientos para el perfilado de tumor infiltrante de células inmunes: 1) implantación de homoinjertos tumor orthotopic PDAC ratón, junto con la implantación de SC; 2) tumor tejido cosecha y preparación de la célula vía disociación del tumor; 3) análisis de citometría de flujo de todas las células derivadas de tumores, como una línea de base; 4) comparación de perfiles de línea de base de ambos enfoques de trasplante.
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Protocol
Todos los protocolos y enmiendas o procedimientos que involucran el cuidado y uso de animales serán revisados y aprobados por la corona Bioscience atención Animal institucional y el Comité uso (IACUC) antes de la realización de estudios. El cuidado y uso de los animales generalmente se realizará conforme a las directrices internacionales de AAALAC (Asociación para la evaluación y acreditación del cuidado de animales de laboratorio) como se informó en la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, investigación Consejo (2011). Todos los procedimientos experimentales de animales bajo condiciones estériles en las instalaciones de SPF (libres de patógenos específicos) y llevado a cabo estrictamente de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de instituciones de gobierno (p. ej. Los institutos nacionales de salud). El protocolo tendrá que ser aprobado por el Comité sobre el ética de los experimentos animales en la institución de la instalación (por ejemplo, Comité institucional de IACUC).
1. preparación para el trasplante del Tumor
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Alojamiento de los animales
- Obtener ratones C57BL/6 genéricos de un vendedor de cría comercial.
- Ratones de la casa (5) en jaulas ventiladas individuales en las siguientes condiciones: temperatura: 20-26 ° C; humedad 30 – 70%; ciclo de iluminación: luz 12 h y 12 h de oscuro.
- Uso maíz mazorca del lecho que cambia semanalmente.
- Dieta, proporcionar alimentos de gránulo seco esterilizada la irradiación durante el período de estudio todo.
- Agua, proporcionar animales libre acceso a agua potable estéril.
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Preparación de fragmento de tumor de donantes
- Comenzar mediante el control de peso corporal (PC), por medio de pesaje mediante un equilibrio y el volumen del tumor (TV), de la medición del calibre, de ratones donantes con tumores.
- Cuando el TV llega a 500-1.200 mm3, eutanasia al animal en una campana de biohazard según protocolo.
- Esterilizar la piel alrededor del tumor utilizando hisopos de yodoforo.
- Extirpar quirúrgicamente el tumor (detalles descritos en la sección 3: cosecha de necropsia y tumor) y el tumor en una placa Petri que contiene 20 mL de PBS (enfriado previamente los medios de comunicación o buffer a 4 ° C antes de euthanizing animales).
- Si hay sangre contaminante, transferir el tumor en otra placa de Petri y el tumor con PBS.
- Corte el tumor por la mitad, quitando cualquier exceso de piel, los vasos, calcificación y necrosis.
- Escoger sólo piezas intactas del tumor y colocarlos en un tubo de centrífuga estéril 50 mL agregar 20 mL de PBS y transportar el tubo a una sala de animales para estudios de Farmacología.
2. ortotópico y Engraftment subcutánea (SC)
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Inoculación de SC
- Cortar tumores en 2 mm de diámetro con un bisturí, poner 1 trozo en cada trocar, para la implantación de SC o para posterior implantación ortotópica (véase abajo).
- Anestesiar el animal receptor con 5% isoflurano, que es mantenido por un cono de nariz en 1%. El animal comenzará a relajarse, perdiendo su righting reflex y a ser inmóvil. A esta profundidad de la anestesia puede fácilmente provocados por estímulos dolorosos; permite anestesia profundizar hasta que esas respuestas al dolor están ausentes.
- Una vez anestesiados, fijar los ratones en un experimento tablero en la posición de lateral derecho. Esterilizar el ratón utilizando hisopos de yodoforo, particularmente los alrededores de los tumores.
- Con un bisturí, haga una incisión de piel de 0.5 a 1.0 cm en el costado izquierdo, justo craneal a la cadera.
- Túnel debajo de la piel hacia la extremidad delantera, dos a tres centímetros, con fórceps romos.
- Asépticamente transferir un cubo del tumor desde el medio y lugar dentro del túnel subcutáneo.
- Confirmar visualmente que el tumor es profundo en el túnel (y no en la incisión de piel).
- Cerrar la herida con pinzas de la herida.
- Monitorear la animales post inoculación hasta recuperar la conciencia suficiente para mantener la postración esternal. Regresar los animales a su jaula sólo después de su plena recuperación de la anestesia. Completar el registro de anestesia e iniciar el cuadro de salud del Animal. Peso receptoras animales diariamente durante tres días
- Para un procedimiento estándar, inocular ratones de 5-10 por grupo para la supervisión del crecimiento del tumor.
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Implantación ortotópica pancreático
- Anestesia y Analgesia
- Usar una inyección de 2 mL ketamina y 0,42 mL de xilacina la inyección (20 mg/mL) mezclados en 5.91 agua inyectable estéril o solución salina en un volumen de dosis de 0.06 – 0.1 mL/20-25 g de peso corporal.
Nota: Según el bienestar de los animales, la analgesia es necesaria ambos pre y post operación. 0.05 – 0.1 mg buprenorfina/kg, SC. La primera dosis pre operación y luego dosificar 3 veces cada 4 horas post operación continuamente.
- Usar una inyección de 2 mL ketamina y 0,42 mL de xilacina la inyección (20 mg/mL) mezclados en 5.91 agua inyectable estéril o solución salina en un volumen de dosis de 0.06 – 0.1 mL/20-25 g de peso corporal.
- Operación quirúrgica para la implantación ortotópica
- Anestesiar ratones vía inyección intramuscular (IM) por paso 2.2.1.
- Después de que los animales están completamente anestesiados, fijar los ratones en un experimento tablero en la posición de lateral derecho.
- Mantener los ratones en la posición de lateral derecho. Desinfectar la piel alrededor del bazo con yodo después de picolinato con alcohol etílico al 75%.
- Encuentre el punto medio del bazo y una incisión vertical de 1 cm en el abdomen para exponer el bazo.
- Extraer una parte del tejido de páncreas con el bazo suavemente con las pinzas de punta plana y un pedazo de tumor de ratón homoplastia de ratón de la semilla en el páncreas de ratón receptor la sutura por 9-0 sutura quirúrgica absorbible.
- Cerrar el abdomen con una sutura de seda 6-0 doble cierre. Lograr la homeostasis por la compresión.
- Después de la implantación de tumor acabado, si ni sangrado ni tumor tejido gotea, mantener los animales en una jaula caliente.
- Seguimiento del animal hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal; devolver el animal a la sala de animales después de la completa recuperación de la anestesia. Supervisar el tumor teniendo ratones palpando el abdomen cerca del bazo y seleccionar a los ratones con tumores ortotópicos.
- Anestesia y Analgesia
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Con tumores de ratones salud control
- Compruebe el consumo de agua y alimento diariamente.
- Examinar el aspecto de ratón para una capa de pelo desaliñada, bultos, delgadez, respiración anormal o ascitis.
- Palpe el abdomen para comprobar si hay tumores espontáneos en el hígado o el bazo.
- Pesar ratones semanalmente usando una balanza.
- Si cualquiera de los siguientes signos clínicos son observado, se sacrifican los ratones para recogida de muestras y necropsia: pérdida de BW > 20%; personas con problemas de movilidad (no puede comer o beber); no se puede mover normalmente debido a ascitis importantes y agrandamiento del abdomen; esfuerzo en la respiración.
3. la autopsia y la cosecha de Tumor
- Inspeccione visualmente y por palpación la presencia de tumores palpables antes de terminación.
- Para la terminación, eutanasia primero ratones según el protocolo aprobado y abrir el abdomen y examinar visualmente el páncreas para tumores.
- Cortar el tumor mediante cirugía mortal el post y agregarlo a PBS frío. Colocar todos los animales en una cámara de eutanasia limpio, sin cargos, translúcido con tapa especial con un puerto para la entrega del bióxido de carbono para ser utilizado.
- Descarga de gas en la cámara a una velocidad de flujo que produce rápida pérdida del conocimiento con el mínimo sufrimiento para el animal. El caudal óptimo para CO2 debe ser aproximadamente 2 – 2,5 L/min.
- Observar visualmente cada animal durante el procedimiento de eutanasia para asegurar todos los animales reciben las concentraciones de gases adecuada y no recuperar la consciencia durante el procedimiento euthanize.
- Mantener el flujo de gas durante al menos 1 minuto después de la aparente muerte clínica para reducir al mínimo la posibilidad de que un animal puede recuperar (si apnea pero no muerto).
- Eliminar los tejidos no tumorales adyacentes. Tumor limpio puede ser fotografiado rápidamente.
Poner los tejidos del tumor en RPMI-1640 y mantener en hielo antes de la disociación.
Nota: Cadáveres de animales en bolsas y almacenados en el congelador adecuado a la espera de eliminación.
4. tumor tejido disociación y preparación de la célula
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Preparación del reactivo
Nota: El Kit de disociación Tumor contiene 2 frascos de enzima D (polvo liofilizado), 1 frasco de enzimas R (polvo liofilizado), 1 frasco de enzima A (polvo liofilizado) y 1 mL de Buffer A.- Preparación de enzima D por reconstituir el polvo liofilizado en cada frasco con 3 mL de RPMI-1640. Preparar alícuotas de un volumen adecuado para evitar repetidos ciclos de congelación descongelación.
- Preparación de enzima R por reconstituir el polvo liofilizado en frasco con 2,7 mL de RPMI 1640. Preparar alícuotas de un volumen adecuado para evitar repetidos ciclos de congelación descongelación.
- Preparar la enzima A reconstituir el polvo liofilizado en frasco con 1 mL de tampón A suministrado con el kit. No no agitar con vortex. Preparar alícuotas de un volumen adecuado para evitar el libre-deshielo-ciclos repetidos.
- Preparar la mezcla de la enzima agregando 2,35 mL de RPMI-1640, 100 μl de enzima D, 50 μl de enzima R y 12,5 μl de la enzima A en cada gentleMACS C tubo.
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Disociación de tumor
- Para cada tumor preparar un tubo de C con mezcla de digestión del tumor, por favor consulte la sección 4.1 para la dilución del tampón de digestión y preparación.
- Tampón de digestión de 3 mL uso de fragmentos de tumor < 0.8 g y el tumor está completamente digerido.
- Etiqueta con el código de estudio, tumor, ratón ID, grupo de tratamiento y peso del tumor.
- Recoger el tumor de ratón, lavar el tumor en PBS frío y limpie el tejido fijado en el tumor (por ejemplo, los vasos sanguíneos, grasa, fascia, etcetera).
- Poner el tumor en medio de la digestión en un pocillo de una placa bien 6 estéril.
- Sostenga el tumor con pinzas/pinzas estériles y corte con un bisturí. Cortar el tumor lo suficientemente bien como para romper en trozos más pequeños (~ 1 mm3).
- Coloque las piezas de tumor en el tubo C y usar el tampón de digestión restantes para lavar la placa y luego transferir el líquido al tubo de C que se coloca en hielo hasta la digestión.
- Encienda el disociador con calentadores.
- Lugar la disociación tumor C-tubos boca abajo en las mangas de los puestos vacantes y ajustar el estado de posiciones tubo libre seleccionado. Elegir un programa de disociación (37_c_m_TDK_1), seguido por la selección de la carpeta requerida, donde se muestra la lista de programas.
- Después de la terminación del programa, sacar los tubos C el disociador y vuelta brevemente (300 x g, 4 ° C) a la muestra de la pelotilla.
- Resuspenda las muestras y poner en un colador celular sobre un tubo de 50 mL. Lavar las células a través de la coladera de celular con 10 mL de tampón de lavado para proporcionar una suspensión unicelular.
- Centrifugar los tubos a 300 x g durante 5 min, descartar el sobrenadante y resuspender las células con 5 mL de tampón de lavado, cuenta células viables con trypan azul o contador celular y ajustar la celda concentraton a 1 x 106 células por el tubo o por muestra. Incluyen los anticuerpos control de isotipo correcta para asegurar la coloración específica
5. inmune Panel de diseño y adquisición de datos de flujo
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Diseño del panel
- Por favor consulte la tabla 1.
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Inmunotinción
- Las células de muestra en bloque FC: Resuspenda las células en 200 μL de tampón con 1 μg/mL Fc-bloque, seguido por la incubación en hielo o a 4 ° C refrigeración durante 15 min en la oscuridad de la coloración.
- Tinción de las células utilizando los paneles de anticuerpos/fluorescencia deseada (por ej. T-cell panel, panel de macrófago, etcetera.): Agregue la mezcla de anticuerpos diluida en solución amortiguadora de bloqueo Fc para cada muestra, mancha durante al menos 30 min en hielo en la oscuridad.
- Añadir 1 mL de hielo frío PBS a cada tubo y resuspender las células, seguida por centrifugación a 300 x g durante 5 min., descartar el sobrenadante resultante.
- Repita el procedimiento para lavar las células dos veces.
- Manchas de marcadores intracelulares si es necesario, pasos 6-10, de lo contrario ir a paso 10.
- Resuspenda el precipitado de células en el vórtex de pulso y añada 200 μL de solución de trabajo de fijación/permeabilización preparada para cada muestra. Vórtice de pulso otra vez y luego incubar a 4 ° C durante la noche (preferido) o 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Desactivación de las células y eliminar el sobrenadante.
- Lavar dos veces por la adición de 1 mL de 1 x Buffer de permeabilización (hecha de 10 x Buffer de permeabilización, diluido con agua destilada de H2O) seguido de centrifugación y decantación del sobrenadante.
- Añadir anticuerpo marcador intracelular en 1 x Buffer de permeabilización e incubar a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad.
- Lavar las células dos veces con 1 mL de 1 x Buffer de permeabilización. Centrifugar y decantar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 150 μL de tampón de tinción y análisis en un citómetro. Debido al procedimiento de fijación y permeabilización, el FSC (forward-luz dispersión) distribución de SSC (dispersión de la luz lateral) de la población celular será diferente a las células en vivo. Por lo tanto, la puerta y tensiones tendrá que modificarse.
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Controles FMO (fluorescencia menos un Control)
Nota: El análisis de flujo de varios colores es particularmente importante para el análisis del tumor infiltrante de células inmunes. Por lo tanto, es necesario encontrar una manera de identificar a las células en el contexto de datos extendido debido a los múltiples fluorocromos en un determinado panel de la puerta. Control FMO (fluorescencia Minus One) es un enfoque importante para este propósito.- Con este fin, incluyen ratones adicionales en proceso individualmente para cada tejido y cada grupo de controles FMO (al menos 2 por Rx). Después de la disociación, los tejidos de la piscina. Por ejemplo, en un estudio con 4 grupos de Rx, 8 tumores adicionales deben procesar individualmente y luego agrupados en una muestra de consistente.
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Instalación de instrumentos de flujo
- Hacer cuentas de compensación, mientras que la máquina se está calentando (por lo menos 20 min).
- Uso CS & T granos para comprobar el funcionamiento.
- Ajustes de tensión y compensación: usar abalorios UltraComp, vórtice la Comp granos cuidadosamente antes de usar.
- Etiquetar un tubo de muestra separada 12 x 75 mm2 para cada anticuerpo conjugado con fluorocromo.
- Añada 100 μl de buffer a cada tubo de coloración. Añada 1 gota completa (aproximadamente 60 μL) de los granos a cada tubo.
- Añadir anticuerpos y realizar el procedimiento de tinción como el proceso de muestra indicado en la sección 4.
- Agregar 0,5 mL de buffer cada uno, totalmente volver a suspender pellets de grano a través del vórtice de la coloración.
- Ajuste tensión PMT de citómetro de flujo por el tejido diana para el experimento dado.
- Ejecutar a través del citómetro de flujo para la obtención de datos, por que bloquean en la población de tira de camiseta por lecturas de FSC y SSC.
- Determinado caudal alrededor de 200 – 300 eventos/s.
- Establecer una indemnización apropiada por un determinado fluoresceína [FITC]-anticuerpo conjugado, terreno para uso un FL1 y FL2 dot.
- Colocar una puerta de cuadrante son negativos en el cuadrante izquierdo más bajo y las cuentas positivas en la parte superior o inferior derecho cuadrante. Ajuste los valores de compensación hasta que la intensidad de fluorescencia media (IFM) de cada población (como se muestra en la ventana de estadísticas de cuadrante) es aproximadamente igual (es decir, para FL2-% FL1, la IMF FL2 de ambas cuentas debe ser similar).
- Repita los pasos 5.4.11 y 5.4.12 para todos los tubos.
- Proceder a adquirir el teñido de muestras. Ejecutar al asistente de compensación y guardar a la configuración con el formato "fecha experimento sus iniciales".
6. flujo de datos de análisis y presentación
- Analizar los datos por Flowjo y Kaluza.
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Representative Results
Implantación ortotópica de PDAC dio lugar a crecimiento rápido del tumor similar al visto para la implantación de SC. Después de que los fragmentos de tumor donantes fueron implantados en ratones receptores, tanto por vía subcutánea y orthotopically según los protocolos descritos en los pasos 2.1 y 2.2, los tumores de la homoplastia KPC implantados demostraron crecimiento similar como se muestra en el figura 1A . Tumores de la homoplastia KPC cosechados en diferentes puntos temporales se muestran en la figura 1B y representante de H & E imágenes se muestran la figura 1. Nuestros datos demostraron un crecimiento similar de SC y orthotopic del implantes.
Las células viables del tumor y las células en el TME, incluyendo las células inmunes infiltrantes de tumor, originarios de orthotopic o implantación de SC, se pueden recuperar eficientemente. Los tumores fueron cosechados y digeridos para preparar suspensiones celulares solo para posterior análisis FACS usando un disociador comercial (figura 2A) según el protocolo descrito en el paso 4. Nos obtenidos generalmente célula viable razonablemente altos rendimientos de las muestras de tumor de ambos tipos de implantación (~ 80% de viabilidad basado en azul de tripán); la trama de la FACS representativa muestra células viables del tumor, separada de los desechos de las células/células muertas (figura 2B).
Tumor infiltrante de células inmunes de subconjuntos diferentes se han identificado en ortotópico y tumores SC implantado, mientras que sus perfiles tienen diferencias. La suspensión de células individuales preparada a partir de los tejidos del tumor mediante el método descrito en el paso 4.2 se sometieron a análisis FACS después de la tinción con un panel de 16 colores de marcadores que se muestra en la tabla 1, que cubre distintos linajes de células inmunes importantes como así como las células del tumor. La jerarquía linaje bloquea estrategia o inmune junto con diagramas de flujo representativos se muestra en la Figura 3A. CD45, un marcador para todas las células inmunes maduras, fue utilizado para distinguir las células del tumor y tumor infiltrante de células inmunes. Posteriormente se analizaron todos los linajes inmunes de CD45+ poblaciones como muestra del grupo (tabla 1).
Al lado de marcadores, tamaño de la célula también se utiliza para diferenciar las subpoblaciones diferentes (figura 3B a la izquierda) para cuantificar subconjuntos de la célula, incluyendo T, linfocitos B, macrófagos y MDSCs, etcetera. Tumor infiltrante comparación perfil inmune de SC vs orthotopic homoinjertos de los cánceres de páncreas. Las poblaciones principales enumerados celular de varios subconjuntos principales de las células inmunes de la infiltración del tumor se muestran figura 3. Los datos muestran claramente que el tumor ha aumentado significativamente la infiltración de células inmunes en comparación con el páncreas de ratones sanos. Además, diferentes porcentajes de subconjunto de tumor infiltrante de células inmunes se encontraron en orthotopic vs. Homoinjertos de SC, por ejemplo, mucho más de las células de B de orthotopic que en SC.
| Marcador | Población de células inmunes |
| CD45 | Leucocitos totales |
| CD3 | Células T totales |
| CD4 | Linfocitos T CD4 + |
| CD8 | Células de T citotóxicas CD8 + |
| CD44 / CD62L * | Células de T ingenuas, memoria y efectoras |
| CD69 CD44, OX40/CD25, etcetera* | Marcadores de la activación |
| CD4 + CD25 + FoxP3 + | Células T reguladoras |
| CD11b + Ly6c/Ly6g | G-MDSC y M-MDSC |
| CD11b + F4/80 | Macrófagos |
| IA/IE/CD206 | Macrófagos M1 y M2 |
| CD3-CD335 + | Células NK |
| CD3 + CD335 + | Células NKT |
| CD19 | Células de B |
| TNF-a/IFN-r/IL-7/IL-3 etcetera* | Citoquinas |
| PD-1/PD-L1/CTLA-4/TIM-3 etcetera* | Inhibidores de Checkpoint |
| B Granzym etcetera* | Marcadores comúnmente solicitados |
| KI67/Brd U/PNCA etcetera | Proliferación |
| Live/dead (corregir) | Vivo/muerto |
| * Nota: Otros marcadores se pueden agregar según lo necesitado | |
Tabla 1: paneles de color de 16-flujo diseñados para el análisis de la tumor-infiltración inmune las células de ratón.
Figura 1: tanto ortotópico y SC (subQ) implantaron tumores de la homoplastia PDAC en C57BL/6 ratones demostrados un crecimiento similar con o sin tratamiento de gemcitabina. Curva de crecimiento (A): SC-izquierda y derecha ortotópico. Azul: Vehículo; Oro: Gemcitabina (iniciada en 10 día post inoculación al volumen de tumor SC promedio alcanzó 200 mm3). (B) los tejidos del tumor en diferentes puntos temporales. (C) representante de H & E tinción de ambos tipos de homoinjertos (40 x 10). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: disociación de tejido del Tumor para preparar suspensión unicelular viable. (A) el uso de la disassociator; (B) la viable células, separadas de las células muertas, como se muestra en el análisis de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de flujo de varios colores de infiltración por el tumor de las células inmunes del ortotópico y homoinjertos PDAC SC. Los datos de cada muestra de tumor fueron adquiridos desde el instrumento de citometría de flujo, seguido de análisis utilizando software de análisis FACS Flowjo. (A) la estrategia bloquea estándar para el análisis, se muestra como un ejemplo; (B) flujo representativo que bloquean y análisis de datos utilizando el estándar gating estrategia; (C) representante tumor-infiltración inmune cellsare muestra a las células de B, Treg y macrófagos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aunque estudios con tumores SC se realizan más fácilmente, orthotopically implantado modelos de tumores pueden ser potencialmente más relevantes para los estudios de Farmacología Preclínica (particularmente las investigaciones I/O) para proporcionar la traducción mejorada. Este informe tiene como objetivo ayudar a la lectores/audiencia interesada a ser capaces de visualizar directamente los procedimientos técnicos que se pueden utilizar en sus investigaciones respectivas. Nuestros protocolos demuestran que orthotopic implantación de PDAC puede resultar en el crecimiento del tumor eficiente, similar a la implantación de SC. Nuestras observaciones también parecen sugerir la presencia de diferentes perfiles inmunes de TMEs de las implantaciones diferentes. Los principales desafíos para adaptar ortotópico, en comparación con los implantes de SC, son que se requieren habilidades complejas, el proceso es lento, los procedimientos quirúrgicos para la implantación son intensivos en mano de obra y también la dificultad en el seguimiento de orthotopic tumor crecimiento en la vida.
Hay cuatro pasos críticos para asegurar que con éxito se realizan experimentos de tumor pancreático ortotópico: 1) el procedimiento quirúrgico de implantación; 2) la supervisión cuidadosa y oportuna de desarrollo del tumor; 3) la importancia de realizar el pre-experimento primero pruebas para familiarizarse con el procedimiento y evaluar la tasa de toma y la tasa de crecimiento del tumor; 4) utilizar suspensiones celulares solo de tumores disociados como método alternativo de engraftment. Este procedimiento de informe es útil a los lectores para realizar investigaciones utilizando este homoplastia específica, así como otros modelos de orthotopic pancreático y otra orthotopic modelos que implican cirugía de abdomen-apertura.
Citometría de flujo o FACS es actualmente la herramienta más importante para llevar a cabo immunoprofiling. Immunophenotyping de tumores por FACS difiere significativamente de células de diferentes órganos, tales como sangre periférica, bazo, ganglios linfáticos y médula ósea de la siguiente manera. Generalmente, es un muy pequeño porcentaje de células inmunes presentes en los tumores (tamaño muestral pequeño). La extrema heterogeneidad de los tumores y el pequeño número de células inmunes presentes hacer recuperación viables inmunes células técnicamente desafiante, que requiere máquinas participación de disociación de tejido de tumor desarrollados a medida. Ambos puntos anteriores hacen medición simultánea de múltiples parámetro mediante citometría de flujo de varios colores esenciales. Flujo de múltiples color requiere diseño del panel marcador complejo, compensación y control estrategias, debido a la superposición espectral de fluorescencia. Este informe también intentó demostrar a la lectores/audiencia interesada del proceso del tumor inmune perfiles definidos tumor tejido disociación y análisis de citometría de flujo de varios colores.
Tres pasos críticos podrían ser particularmente importantes para el rendimiento productivo TIL análisis: en primer lugar, un alto rendimiento de células viables de disociado tumores utilizando procedimientos de disociación de tumor modificado para requisitos particulares; en segundo lugar, el diseño optimizado de grande varios colores paneles tinción basados en reactivos disponibles; en tercer lugar, una estrategia optimizada bloquea en el análisis. Los autores desean hacer hincapié en la formación y experiencia de los operadores de adquisición de datos y análisis son esenciales para el análisis de citometría de flujo exitosa de TIL.
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Disclosures
Todos los autores son empleados a tiempo completo actuales de corona Bioscience, Inc.
Acknowledgments
Los autores le agradezco Dr. Jody Barbeau - crítica de la lectura y edición del manuscrito y gracias a Ralph Manuel para el diseño de obras de arte. Los autores quisieran agradecer al equipo corona Bioscience Oncología inmuno-Oncología biomarcadores y equipo de Oncología En el Vivo , por su gran esfuerzo técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | \ | SAS3119 | \ |
| Trocar 20 | \ | \ | 2 mm |
| Petri dish | \ | \ | 20 mm |
| 100x antibiotic and antimycotic | \ | \ | \ |
| Iodophor swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Alcohol swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Liquid nitrogen | Air chemical | \ | \ |
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | \ |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | \ |
| antibodies | BD | \ | \ |
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | \ |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | \ |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | \ |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70 µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2 mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | \ |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | \ |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | \ |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | \ |
| FlowJo software | FlowJo LLC | \ | vs 10.0 |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50 mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | \ |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | \ |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10 cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10 cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | \ |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100 g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | \ |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | \ |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | \ |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8 mL |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | \ |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | \ | 1-5 mL |
| Studylog software | Studylog | \ | software |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50 mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15 mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4 °C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | -20 °C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | -80 °C |
| RNAlater | Thermo | am7021 | \ |
References
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