Summary
La procedura sperimentale su immunophenotyping di omotrapianti PDAC murino ortotopico mira a profilatura immuno-microambiente tumorale. I tumori sono orthotopically impiantato tramite intervento chirurgico. Tumori di 200 – 600 mm3 dimensioni sono state raccolte e dissociati per preparare sospensioni unicellulari, seguite da analisi dell'indicatore multi-immuni FACS usando diversi anticorpi fluorescente etichettati.
Abstract
Omotrapianto (syngeneic) tumori sono il cavallo di battaglia di ricerca preclinica di immuno-Oncologia (i/o) di oggi. Il microambiente tumorale (TME), in particolare sua immunitario-componenti, è di vitale importanza per la prognosi e la previsione di risultati di trattamento, specialmente quelli di immunoterapia. TME immunitario-componenti sono composte di diverse sottopopolazioni di cellule immunitarie tumore-infiltrazione valutabile da FACS multi-colore. L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è tra i più letali malignances mancano opzioni di buon trattamento, così un'esigenza medica urgente e insoddisfatta. Una ragione importante per la sua non-risposta alle varie terapie (chemio-, mirati, I/O) è stata la sua abbondante TME, composto da fibroblasti e leucociti che proteggono le cellule del tumore da queste terapie. Orthotopically PDAC impiantato è creduto per più accuratamente riconquistare la TME di cancri del pancreas umani rispetto ai modelli convenzionali sottocutanei (SC).
Tumori dell'omotrapianto (KPC) sono trapianti di mouse spontanea PDAC originari da KPC-topi geneticamente ingegnerizzati (ras diKG12D / +/P53- / -/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). Il tessuto del tumore primario è tagliato in piccoli frammenti (~ 2 mm3) e trapiantato per via sottocutanea (SC) ai destinatari syngeneic (C57BL/6, 7 – 9 settimane di età). Gli omotrapianti erano quindi chirurgicamente orthotopically trapiantato sul pancreas dei topi C57BL/6 nuovi, insieme a SC-impianto, che ha raggiunto volumi del tumore di 300 – 1.000 mm3 da 17 giorni. Solo i tumori di 400 – 600 mm3 sono state raccolte per la procedura di analisi approvati e puliti per rimuovere i tessuti non tumorali adiacenti. Essi fossero dissociati per protocollo utilizzando un dissociatore di tessuto in sospensioni unicellulari, seguite dalla macchiatura con pannelli designati di anticorpi fluorescente-etichetta per i vari indicatori di diverse cellule immunitarie (linfoidi, mieloidi e NK, DCs). I macchiato campioni sono stati analizzati utilizzando multi-colore FACS per determinare i numeri delle cellule immuni di stirpi differenti, come pure la loro percentuale relativa all'interno dei tumori. I profili immuni di orthotopic tumori poi sono stati confrontati a quelli dei tumori SC. I dati preliminari hanno dimostrato significativamente elevata infiltrazione TILs/TAMs nei tumori sopra pancreas e infiltrazione della B-cellula superiore orthotopic piuttosto che i tumori SC.
Introduction
L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) fa sì che quasi la metà un milione mortalità universalmente ogni anno, uno dei top 5 cancro killer. Ci sono poche opzioni terapeutiche efficaci e nessun immunoterapie approvati; di conseguenza, nuovi trattamenti sono disperatamente necessari. I cancri sempre più stanno riconoscendi come malattie immunologiche, tra cui PDAC, oltre le malattie genetiche come la conosciamo oggi. Fattori immunologici e genetici probabilmente sarebbero determinare prognosi della malattia così come il trattamento dei risultati. I tumori eludere la sorveglianza immunitaria ospite e finalmente avanzano per causare la morte. Molti di questi processi immunitari si verificano all'interno del microambiente tumorale (TME)1,2,3,4 dove diversi tipi di cellule immunitarie interagiscono con le cellule del tumore, con l'altro e con altri del tumore componenti stromal, direttamente o indirettamente tramite citochine che determinano l'esito della malattia. Di conseguenza, caratterizzazione dei componenti immunitarie tumore della TME o tumore immunophenotyping, tra cui la definizione di sottotipo, la numerazione e la localizzazione degli stirpi differenti delle cellule immuni, è fondamentale per comprendere l'immunità anti-tumorale. Nel caso di PDAC, è stato proposto che elevati di tumore-infiltrazione di macrofagi soppressivi (TAM) e cellule di B hanno portato alla prevenzione di infiltrazione a cellula T e/o attivazione e alti livelli di fibrosi5,6.
L'approccio comune per indagare sperimentalmente TMEs immuni sarebbe utilizzando modelli animali preclinici di surrogato del tumore, il tumore del mouse principalmente i modelli7, particolarmente del mouse syngeneic (omotrapianto) o modelli murini geneticamente (GEMM) di cancri, sulla presunta somiglianza di mouse e umani per tumori e immunità8,9. È inteso in realtà che ci sono differenze intrinseche tra le due specie10,11.
Tumori trapiantati del topo hanno notevoli vantaggi operativi rispetto tumori spontanei7, vale a dire lo sviluppo del tumore sincronizzata, in contrasto con lo sviluppo di tumore spontaneo GEMM parentale. Gli omotrapianti di tumori murini spontanei sono considerati tumori primari non essendo mai stato manipolato in vitroe tumore del mirroring del mouse originale histo- / molecolare patologia7, nonché possibili profili immuni. Questi omotrapianti murini sono spesso considerati "una versione del mouse degli xenotrapianti paziente-derivati (PDXs)". Hanno quindi probabilmente una migliore traducibilità rispetto convenzionale delle cellule syngeneic del mouse linea-derivato tumori12. In particolare, molti gli omotrapianti sono derivati da GEMM specifici dove meccanismi di malattia umana specifica, ad esempio mutazioni oncogeniche driver, sono progettati e questi omotrapianti dovrebbero quindi avere vantaggi per la loro rilevanza clinica. In particolare, KPC GEMM sviluppano mouse PDAC entro 15-20 settimane di età, che ricapitola morfologicamente malattia umana con prevalentemente bene - a-differenziato moderatamente architettura ghiandolare e altamente arricchito lo stroma. Questo modello inoltre ricapitola le caratteristiche genetiche più comuni del PDAC umana, vale a dire Kras attivazione mutazione e P53 perdita di funzione, che si presentano nel 90% e 75% di umano PDAC, rispettivamente5,6.
Siti di trapianto sono stati suggeriti anche a svolgere un ruolo in traducibilità modello. Ambiente specifico per il tessuto circostante, ad esempio un ambiente di orthotopic corrispondente, potrebbe essere una nicchia per tumori specifici per ambienti di progresso, in contrasto con l'uniforme sottocutanea (SC) per i tumori comunemente trapiantati. Sarebbe di particolare interesse se, e/o, che differenza esiste tra i due siti di trapianto, in termini di immunitario-microambiente e la rilevanza di cancro umano, ad es. nel caso di PDAC.
Uno degli aspetti più importanti di profilazione immuni, o immunophenotyping, consiste nel determinare il tumore-infiltrazione di cellule immuni di stirpi differenti, i numeri, percentuale relativa all'interno dei tumori, così come loro Stati di attivazione e luoghi. Questo include il tumore-infiltratrating lymphoctyes (TILs, sia T - e B-), tumore-infiltrazione macrofagi (TAMs), tumore-infiltrazione di cellule di assassino naturali (NKs) e tumore-residente dendritiche cellule3,13,14 , 15 , 16 , 17e la localizzazione subcellulare di determinate cellule18,19,20, ecc. Fluorescenza attivato Cell Sorting (FACS) o flusso cytometry è una tecnologia di rilevamento a cella singola che è comunemente usata per misurare i parametri specifici di una cella. Multi-colore flusso cytometry misure marcatori multipli in una singola cella3,4,21 ed è il metodo più comunemente utilizzato per determinare i numeri e la percentuale relativa delle diverse sottopopolazioni di cellule immunitarie, compresi quelli all'interno dei tumori.
Questo rapporto descrive le procedure per la profilatura di tumore-infiltrazione di cellule immuni: 1) l'impianto di orthotopic PDAC topo tumore gli omotrapianti, insieme con l'impianto di SC; 2) tumore del tessuto raccolto e preparazione di singola cellula tramite dissociazione del tumore; 3) analisi di citometria a flusso di tutte le cellule derivate da tumori come una linea di base; 4) confronto dei profili di linea di base di entrambi gli approcci di trapianto.
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Protocol
Tutti i protocolli e integrazioni o procedure che coinvolgono la cura e l'uso di animali saranno riesaminate e approvate dalla corona Bioscience istituzionale animale cura ed uso Committee (IACUC) prima lo svolgimento degli studi. La cura e l'uso degli animali sarà solitamente condotta conformemente alle linee guida internazionali AAALAC (associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio Animal Care) come riportato nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, ricerca nazionale Consiglio (2011). Tutte le procedure sperimentali animali saranno in condizioni di sterilità presso strutture di SPF (specifico patogeno-libera) e condotta in stretta conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio da diverse istituzioni (ad es. Il National Institutes of Health). Il protocollo dovranno essere approvati dal Comitato per l'etica di animale esperimenti presso l'Istituto di struttura (ad es. Comitato istituzionale IACUC).
1. preparazione per il trapianto di tumore
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Custodia degli animali
- Ottenere topi C57BL/6 generici da un fornitore di allevamento commerciale.
- Mouse della casa (5) in gabbie individuali ventilate alle seguenti condizioni: temperatura: 20 – 26 ° C; umidità 30 – 70%; ciclo di illuminazione: 12h di luce e 12 ore di buio.
- Uso mais pannocchia biancheria è cambiata settimanalmente.
- Per la dieta, fornire cibo secco granello irradiazione sterilizzato durante l'intero periodo di studio.
- Per acqua, fornire animali libero accesso all'acqua potabile sterile.
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Preparazione di frammento del tumore donatore
- Iniziare con il monitoraggio del peso corporeo (BW), tramite pesatura utilizzando un equilibrio e il volume del tumore (TV), tramite la misura di calibro, dei topi del tumore-cuscinetto donatore.
- Quando la TV raggiunge 500 – 1.200 mm3, eutanasia l'animale in una cappa biohazard come da protocollo.
- Sterilizzare la pelle intorno al tumore utilizzando tamponi di iodophor.
- Rimuovere chirurgicamente il tumore (dettagli descritti nella sezione 3: raccolto l'autopsia e del tumore) e posizionare il tumore in una piastra Petri contenente 20 mL di PBS (pre-raffreddare il supporto o il tampone a 4 ° C prima dell'eutanasia di animali).
- Se c'è sangue contaminanti, trasferire il tumore in un'altra piastra di Petri e lavare il tumore con PBS.
- Tagliare il tumore a metà, rimuovendo qualsiasi pelle supplementare, vasi, calcificazione e/o necrosi.
- Scegliere solo i parti intatte del tumore e inserirli in una provetta sterile da 50 mL e aggiungere 20 mL di PBS quindi il tubo per un animale separato per gli studi di farmacologia di trasporto.
2. Orthotopic ed Engraftment sottocutanea (SC)
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Inoculazione di SC
- Tagliare i tumori in 2 mm diametro pezzi usando un bisturi, mettere 1 pezzo in ogni trocar, per l'impianto SC o per successive orthotopic l'impianto (Vedi sotto).
- Anestetizzare l'animale destinatario con isoflurano 5%, che è mantenuta da un cono di naso all'1%. L'animale sarà iniziare a rilassarsi, a perdere loro riflesso di raddrizzamento e alla fine diventare immobile. A questa profondità dell'anestesia può facilmente essere risvegliati da stimoli dolorosi; consentire l'anestesia ad approfondire fino a quando tali risposte al dolore sono assenti.
- Una volta anestetizzato, fissare i topi su una scheda di esperimento nella posizione laterale di destra. Sterilizzare il mouse utilizzando tamponi di iodophor, particolarmente nelle aree che circonda i tumori.
- Con un bisturi, fare un'incisione della pelle di 0,5-1,0 cm sul fianco sinistro, appena cranico all'anca.
- Tunnel sotto la pelle verso la zampa anteriore, due-tre centimetri, con forcipe smussato.
- Asetticamente trasferire un cubo di tumore dal mezzo e posizionarla dentro il tunnel sottocutaneo.
- Confermare visivamente che il tumore è profondo nel tunnel (e non presso l'incisione cutanea).
- Chiudere la ferita con clip di ferita.
- Monitorare l'inoculazione di post di animali fino a quando non riacquistano la coscienza sufficiente per mantenere recumbence sternale. Riportare gli animali alla loro gabbia solo dopo il loro completo recupero dall'anestesia. Completare il registro di anestesia e avviare il grafico di salute animale. Pesare gli animali destinatari ogni giorno per tre giorni
- Per una procedura standard, inoculare 5-10 topi per gruppo per il monitoraggio di crescita del tumore.
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Impianto ortotopico del pancreas
- Anestesia e Analgesia
- Utilizzare un 2ml ketamina iniezione e iniezione di xilazina 0,42 mL (20 mg/mL) mescolato in 5.91 acqua sterile per iniezione o soluzione fisiologica ad un volume di dose di 0.06-0.1 mL/20-25 g di peso di corpo.
Nota: Secondo al benessere degli animali, l'analgesia è necessario sia pre e post operazione. 0,05-0,1 mg/kg la buprenorfina, SC. La prima dose è pre operazione e quindi somministrato 3 volte ogni 4 ore post operazione continuamente.
- Utilizzare un 2ml ketamina iniezione e iniezione di xilazina 0,42 mL (20 mg/mL) mescolato in 5.91 acqua sterile per iniezione o soluzione fisiologica ad un volume di dose di 0.06-0.1 mL/20-25 g di peso di corpo.
- Operazione chirurgica per l'impianto ortotopico
- Anestetizzare topi tramite iniezione intramuscolare (IM) al punto 2.2.1.
- Dopo che gli animali sono completamente anestetizzati, fissare i topi su una scheda di esperimento nella posizione laterale di destra.
- Mantenere i topi nella posizione laterale di destra. Disinfettare la pelle intorno alla milza con iodio quindi de-iodinate con alcool etilico al 75%.
- Trovare il punto medio della milza e praticare un'incisione verticale di 1 cm sull'addome per esporre la milza.
- Estrarre una parte di tessuto pancreatico sotto la milza delicatamente con una pinzetta piatto-punta e suturare un pezzo di tumore omotrapianto di mouse da mouse seme sul pancreas del destinatario mouse da sutura chirurgica riassorbibile di 9-0.
- Doppia cucitura nelle vicinanze l'addome con una sutura in seta 6-0. Raggiungere l'omeostasi di compressione.
- Dopo finitura impianto del tumore, in caso di sanguinamento né tumore perdite di tessuto, tenere gli animali in una gabbia calda.
- Monitorare l'animale fino a quando riprende conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale; restituire l'animale per stanza animale dopo il completo recupero dall'anestesia. Monitorare il tumore topi del cuscinetto di palpazione dell'addome vicino la milza e seleziona i topi che sopportano i tumori ortotopico.
- Anestesia e Analgesia
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Del tumore-cuscinetto topi salute monitoraggio
- Controllare il consumo di acqua e cibo tutti i giorni.
- Esaminare l'aspetto del mouse per un pelo Ted, grumi, magrezza, respiro anormale o ascite.
- Palpare l'addome per verificare se ci sono tumori spontanei sul fegato o milza.
- Pesare topi settimanale usando una bilancia.
- Se uno qualsiasi dei seguenti segni clinici si osservano i topi sono sacrificati per la raccolta del campione e l'autopsia: perdita di BW > 20%; Difficoltà di deambulazione (non in grado di mangiare o bere); Impossibile spostare normalmente a causa di ascite significativo e addome allargata; sforzo nella respirazione.
3. l'autopsia e tumore Harvest
- Ispezionare visivamente e mediante palpazione per la presenza di tumori evidenti prima della terminazione.
- Per la terminazione, prima eutanasia topi secondo il protocollo approvato e aprire l'addome ed esaminare visivamente il pancreas per i tumori.
- Tagliare il tumore dalla chirurgia mortale dell'alberino e aggiungerlo al PBS freddo. Posizionare tutti gli animali in una camera pulita, senza carica, traslucido eutanasia con un coperchio speciale con una porta per la consegna dell'anidride carbonica per essere utilizzato.
- Gas di scarico nella camera ad una portata che produce incoscienza rapida con minimo disagio per l'animale. La portata ottimale per CO2 dovrebbe essere di circa 2 – 2,5 L/min.
- Osservare visivamente ogni animale durante la procedura di eutanasia per assicurare tutti gli animali ricevono le concentrazioni di gas adeguata e non riacquistare coscienza durante la procedura di euthanize.
- Mantenere il flusso di gas per almeno 1 min dopo l'apparente morte clinica per minimizzare la possibilità che un animale può recuperare (se apneica ma non è morto).
- Rimuovere tessuti non tumorali adiacenti. Tumore puliti possa essere fotografati rapidamente.
Mettere i tessuti del tumore in RPMI-1640 e tenere il ghiaccio prima di dissociazione.
Nota: Le carcasse di animali sono insaccate e conservate nel congelatore appropriato in attesa di rimozione.
4. tumore del tessuto dissociazione e preparazione singola cella
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Preparazione dei reagenti
Nota: Il Kit di dissociazione del tumore contiene 2 flaconi di enzima D (polvere liofilizzata), 1 flacone di enzima R (polvere liofilizzata), 1 flacone di enzima A (polvere liofilizzata) e 1 mL di tampone A.- Preparare enzima D mediante la ricostituzione della polvere liofilizzata in ogni flaconcino con 3 mL di RPMI-1640. Preparare le aliquote di un volume adeguato per evitare freeze-thaw-cicli ripetuti.
- Preparare enzima R mediante la ricostituzione della polvere liofilizzata nel flaconcino con 2,7 mL di RPMI 1640. Preparare le aliquote di un volume adeguato per evitare freeze-thaw-cicli ripetuti.
- Preparare enzima A ricostituire la polvere liofilizzata nel flacone con 1 mL di tampone A fornito nel kit. Non centrifugare. Preparare le aliquote di un volume adeguato per evitare ripetute gratis-disgelo-cicli.
- Preparare la miscela di enzima aggiungendo 2,35 mL di RPMI-1640, 100 µ l di enzima D, 50 µ l di enzima R e 12,5 µ l della A enzima in ogni gentleMACS C-tubo.
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Dissociazione di tumore
- Per ogni tumore preparare uno C-tubo con mix di digestione di tumore, fare riferimento alla sezione 4.1 per la preparazione e la diluizione del tampone di digestione.
- Tampone di digestione di 3ml di uso per i frammenti di tumore < 0,8 g e garantire il tumore è completamente digerito.
- Etichetta con il codice di studio, tumore, ID del mouse, gruppo di trattamento e peso del tumore.
- Raccogliere il tumore dal mouse, lavare il tumore in PBS freddo e ripulire il tessuto fissato sul tumore (ad esempio, vasi sanguigni, grasso, cover, ecc.).
- Mettere il tumore nei media di digestione in un pozzetto di una piastra sterile di ben 6.
- Tenere il tumore in luogo con pinzette/pinze sterili e fetta con un bisturi. Affettare il tumore abbastanza bene per rompere in pezzi più piccoli (~ 1 mm3).
- Inserire nuovamente i pezzi di tumore il C-tube e utilizzare il buffer di digestione restanti per lavare la piastra e poi trasferire il liquido in C-tubo che viene inserito sul ghiaccio finché la digestione.
- Accendere il dissociatore con riscaldatori.
- Dissociazione del tumore C-tubi upside-down in maniche di posizioni vacanti e regolare lo stato delle posizioni di tubo da Free to Selected. Scegliere un programma di dissociazione (37_c_m_TDK_1), seguito dalla selezione della cartella richiesta, dove viene visualizzato l'elenco dei programmi.
- Dopo il termine del programma, togliere il dissociatore e spin brevemente (300 x g, 4 ° C) a pellet il campione C-tubi.
- Risospendere i campioni e mettere in un colino di cella sopra un tubo da 50 mL. Lavare le cellule attraverso il filtro delle cellule con 10 mL di tampone di lavaggio per fornire una sospensione unicellulare.
- Centrifugare le provette a 300 x g per 5 min, scartare il surnatante e risospendere le cellule con 5 mL di tampone di lavaggio, conteggio di cellule vitali utilizzando trypan blu e/o di contatore di cellule e regolare la concentrazione cellulare di 1 x 106 cellule per tubo o per campione. Comprendono gli anticorpi di controllo isotipo corretta per garantire la macchiatura è specifica
5. sistema immunitario pannello Design e acquisizione di dati di flusso
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Design del pannello
- Vedere tabella 1.
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Immunostaining
- Campione di cellule FC-Block: risospendere le cellule in 200 µ l di tampone con 1 µ g/mL Fc-blocco, seguita da incubazione su refrigerazione ghiaccio o a 4 ° C per 15 min al buio di colorazione.
- Macchia le celle utilizzando i pannelli di anticorpo/fluorescenza desiderato (ad es. T-Cell pannello, pannello del macrofago, ecc.): aggiungere la miscela di anticorpo diluita in tampone bloccante Fc per ogni campione, macchia per almeno 30 min in ghiaccio al buio.
- Aggiungere 1 mL di PBS freddo ghiaccio in ogni provetta e Risospendere delicatamente, le cellule seguita da centrifugazione a 300 x g per 5 min, scartare il surnatante risultante.
- Ripetere l'operazione per lavare le cellule due volte.
- Mordente per marcatori intracellulari, se necessario, segue 6-10, altrimenti saltare al passaggio 10.
- Risospendere il pellet cellulare di impulso vortice e aggiungere 200 µ l di soluzione di lavoro di fissazione/Permeabilization preparata per ogni campione. Vortice di impulso nuovamente e poi incubare a 4 ° C durante la notte (preferito) o 30 min a temperatura ambiente al buio.
- Rotazione verso il basso le cellule ed eliminare il surnatante.
- Lavare due volte, aggiungendo 1 mL di tampone di permeabilizzazione (fatto da 10 x Permeabilization Buffer, diluito con acqua distillata H2O) 1x seguita da centrifugazione e decantazione del surnatante.
- Aggiungere intracellulare marker della malattia in 1 x Permeabilization Buffer e incubare a temperatura ambiente per 30 min al buio.
- Lavare le cellule due volte con 1 mL di tampone di permeabilizzazione 1x. Centrifugare e decantare il supernatante.
- Risospendere le cellule in 150 µ l di tampone di macchiatura e analizzare su un citometro. A causa della procedura di fissazione e permeabilizzazione, FSC (avanti-luce XY) / SSC (dispersione laterale) distribuzione della popolazione cellulare sarà diversa da cellule vive. Di conseguenza, il cancello e tensioni dovranno essere modificati.
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FMO controlli (fluorescenza meno un controllo)
Nota: L'analisi di flusso multi-color è particolarmente importante per l'analisi di tumore-infiltrazione di cellule immunitarie. Di conseguenza, c'è la necessità di trovare un modo per identificare e cancello le cellule nel contesto dati sparsi a causa i fluorocromi multiple in un oggetto panel specificato. Controllo FMO (fluorescenza Minus One) è un approccio importante per questo scopo.- A tal fine, di topi supplementari in ogni gruppo per controlli FMO (almeno 2 a Rx) e processo individualmente per ogni tessuto. Dopo dissociazione, tessuti di piscina. Ad esempio, in uno studio con 4 gruppi di Rx, 8 ulteriori tumori dovrebbero essere elaborati individualmente e poi riuniti in un campione per protocolli.
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Messa in funzione del flusso
- Fare compensazione perline mentre la macchina si sta riscaldando (almeno 20 min).
- Usare le perline di CS & T per verificare le prestazioni.
- Le impostazioni di tensione e compensazione: utilizzare UltraComp perline, vortice il Comp perline accuratamente prima dell'uso.
- Etichettare una provetta per campioni separati 12 x 75 mm2 per ogni fluorocromo-coniugate dell'anticorpo.
- Aggiungere 100 µ l di buffer per ogni tubo di colorazione. Aggiungere 1 goccia completo (circa 60 µ l) di perline in ogni provetta.
- Aggiungere gli anticorpi ed eseguire la procedura di colorazione esattamente come il processo di esempio indicato nella sezione 4.
- Aggiungere 0,5 mL di buffer ogni, per completamente risospendere il pellet perlina via vortice di colorazione.
- Impostare la tensione PMT citometro a flusso al tessuto dell'obiettivo per l'esperimento dato.
- Attraversano il citometro a flusso per l'acquisizione di dati, di gating sulla popolazione di perlina di singoletto a letture FSC e SSC.
- Tasso di flusso set intorno a 200 – 300 eventi/s.
- Impostare una compensazione adeguata per una determinato della fluorescina [CIC]-anticorpo coniugato, uso un FL1 vs FL2 dot plot.
- Posto un cancello quadrante affinché perle negativi sono all'interno del quadrante inferiore sinistro e le perle positive sono in alto o più basso proprio quadrante. Regolare i valori di compensazione fino a quando l'intensità della fluorescenza media (MFI) di ogni popolazione (come mostrato nella finestra Statistiche del quadrante) è circa uguale (cioè per FL2-% FL1, FL2 IFM di entrambi i talloni dovrebbe essere simile).
- Ripetere i passaggi 5.4.11 e 5.4.12 per tutte le provette.
- Procedere all'acquisizione l'effettivo macchiato campioni. Eseguire la procedura guidata di compensazione e salvare le impostazioni con il formato "data di sperimentare le proprie iniziali".
6. flusso dati analisi e presentazione
- Analizzare i dati da Flowjo e/o Kaluza.
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Representative Results
Impianto di orthotopic del PDAC ha provocato sviluppo veloce del tumore simile a quello visto per l'impianto di SC. Dopo i frammenti di tumore donatore sono stati impiantati in topi destinatari, sia per via sottocutanea e orthotopically secondo i protocolli descritto ai punti 2.1 e 2.2, i tumori di omotrapianto KPC impiantati dimostrato a rapida crescita come mostrato in figura 1A . Tumori dell'omotrapianto KPC raccolti in diversi momenti sono mostrati in Figura 1B e rappresentante H & E immagini sono mostrati nella figura 1. I nostri dati hanno dimostrato una crescita simile di SC e orthotopic impianti.
Cellule vitali del tumore e cellule nella TME, compreso tumore-infiltrazione di cellule immunitarie, che proviene da orthotopic o l'impianto di SC, possono essere recuperate in modo efficiente. I tumori sono state raccolte e digeriti per preparare sospensioni di singola cellula per la successiva analisi di FACS usando un dissociatore commerciale (Figura 2A) secondo il protocollo designato nel passaggio 4. Abbiamo ottenuto di solito cellule vitali ragionevolmente elevati rendimenti da campioni del tumore di entrambi i tipi di impianto (~ 80% redditività basato su Trypan Blue); la trama di FACS rappresentativa Mostra cellule vitali da tumore, separati dai detriti cellule/cellula morta (Figura 2B).
Tumore-infiltrazione di cellule immuni di diversi sottoinsiemi sono state identificate in orthotopic sia tumori SC impiantato, mentre loro profili hanno differenze. La sospensione unicellulare preparata da tessuti tumorali utilizzando il metodo descritto al punto 4.2 sono stati sottoposti ad analisi al FACS dopo colorazione con un pannello di 16 colori degli indicatori illustrato nella tabella 1, che copre diversi lignaggi di cellule immunitarie importanti come così come le cellule del tumore. La gerarchia di lignaggio di gating strategia o immunitario insieme rappresentativo flusso trame è mostrata in Figura 3A. CD45, un indicatore per tutte le cellule immunitarie mature, è stato utilizzato per distinguere le cellule del tumore e tumore-infiltrazione di cellule immunitarie. Tutti i lignaggi immuni sono stati successivamente analizzati da CD45+ popolazioni come visualizzato dal pannello (tabella 1).
Al lato di marcatori, dimensione delle celle è anche usato per differenziare le sottopopolazioni differenti (Figura 3B sinistro) per quantificare i sottoinsiemi di cellule, tra cui T, linfociti B, macrofagi e MDSC, ecc. Tumore infiltrante confronto profilo immunitario di SC vs orthotopic omotrapianti dei cancri del pancreas. Le popolazioni principali delle cellule enumerato di chiave diversi sottoinsiemi di cellule immuni di infiltrazione del tumore sono mostrate nella figura 3. I dati mostrano chiaramente che il tumore ha aumentato significativamente l'infiltrazione delle cellule immuni rispetto con il pancreas dei topi sani. Inoltre, diverse percentuali di sottoinsieme di tumore-infiltrazione di cellule immuni sono state trovate in orthotopic vs. Gli omotrapianti SC, ad es. significantly more B-cellule in orthotopic rispetto a SC.
| Marcatore | Popolazione delle cellule immuni |
| CD45 | Quantità totale dei leucociti |
| CD3 | Cellule di T totali |
| CD4 | Linfociti CD4 + T helper |
| CD8 | CD8 + cellule di T citotossiche |
| CD44 / CD62L * | Cellule T naïve, memoria ed effettrici |
| CD69/CD44/OX40/CD25 ecc* | Indicatori di attivazione |
| CD4 + CD25 + FoxP3 + | Cellule T regolatorie |
| CD11b + Ly6c/Ly6g | G-MDSC e M-MDSC |
| CD11b + F4/80 | Macrofagi |
| IA/IE/CD206 | Macrofagi M1 e M2 |
| CD3-CD335 + | Cellule NK |
| CD3 + CD335 + | Cellule NKT |
| CD19 | Cellule di B |
| TNF-a/IFN-r/IL-7/IL-3 ecc* | Citochine |
| PD-1/PD-L1/CTLA-4/TIM-3 ecc* | Inibitori di checkpoint |
| Granzym B ecc* | Marcatori comunemente richiesti |
| KI67/Brd U/CPNA ecc | Proliferazione |
| Live/dead (risolvibile) | Live/dead |
| * Nota: Si possono aggiungere ulteriori marcatori come necessario | |
Tabella 1: pannelli 16-colore flusso progettati per l'analisi di tumore-infiltrazione di cellule immuni del mouse.
Figura 1: sia orthotopic e SC (subQ) impiantato PDAC omotrapianto tumori in C57BL/6 topi ha dimostrati crescita simile con o senza trattamento di gemcitabina. (A) curva di crescita: SC-sinistra e destra orthotopic. Blu: Veicolo; Oro: Gemcitabina (iniziata il giorno 10 post inoculazione quando il volume del tumore SC medio raggiunto 200 mm3). (B) i tessuti del tumore in diversi momenti. (C) rappresentante H & E colorazione di entrambi i tipi di omotrapianti (40 x 10). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: dissociazione del tessuto del tumore per preparare la sospensione unicellulare praticabile. (A) l'uso di disassociator; (B) il vitali cellule, separate dalle cellule morte, come indicato dall'analisi di flusso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: analisi di flusso multi-colore di tumore-infiltrazione di cellule immuni di orthotopic sia gli omotrapianti PDAC SC. I dati non elaborati da ciascun campione di tumore sono stati acquisiti dallo strumento citometria a flusso, seguito da analisi utilizzando software di analisi Flowjo FACS. (A) la strategia di gating standard per l'analisi, viene visualizzato come un esempio; (B) flusso rappresentante gating e analisi dei dati utilizzando lo standard gating strategia; (C) rappresentativo del tumore-infiltrazione immune cellulesono visualizzata per includere le B-cellule, Treg e macrofagi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sebbene più facilmente vengono condotti studi utilizzando i tumori SC, orthotopically impiantati tumori modelli possono essere potenzialmente più rilevanti per gli studi di farmacologia preclinica (in particolare le indagini di I/O) per fornire una maggiore traducibilità. Questo rapporto mira ad aiutare i lettori/pubblico interessato di essere in grado di visualizzare direttamente le procedure tecniche che possono essere utilizzate nelle loro rispettive ricerche. Nostri protocolli dimostrano che orthotopic l'impianto del PDAC può provocare nella crescita del tumore efficiente, simile all'impianto SC. Le nostre osservazioni, inoltre, sembrano suggerire la presenza di diversi profili immuni di TMEs dai diversi impianti. Le principali problematiche di adattarsi ortotopico, rispetto ad impianti di SC, sono che sono richieste competenze complesse, il processo è molto tempo, le procedure chirurgiche per l'impianto sono ad alta intensità di manodopera e anche la difficoltà nel monitoraggio ortotopico del tumore crescita nella vita.
Ci sono quattro passaggi critici per garantire che gli esperimenti di tumore pancreatico di orthotopic vengono eseguiti con successo: 1) la procedura chirurgica di impianto; 2) il monitoraggio attento e tempestivo di sviluppo del tumore; 3) l'importanza di effettuazione pre-esperimento test prima di acquisire con la procedura e valutare il tasso di prendere e il tasso di crescita del tumore; 4) utilizzando sospensioni di cellule singole dei tumori dissociate come un metodo alternativo di attecchimento. Questa procedura di relazione è utile ai lettori per eseguire la ricerca utilizzando questo omotrapianto specifico, nonché altri modelli ortotopici del pancreas, e anche altri orthotopic modelli che coinvolgono addome-apertura chirurgia.
Citometria a flusso o FACS è attualmente lo strumento più importante per eseguire immunoprofiling. Immunophenotyping dei tumori da FACS differisce considerevolmente da quello delle cellule da vari organi, sangue periferico, milza, linfonodi e midollo osseo nei modi seguenti. In generale, c'è una percentuale molto piccola di cellule immunitarie presenti nei tumori (piccola dimensione del campione). L'estrema eterogeneità dei tumori e il piccolo numero di cellule immunitarie presenti rendono le cellule immuni rare praticabile recuperare tecnicamente impegnativo, che necessitano di tumore personalizzati tessuto dissociazione che coinvolgono macchine. Entrambi i punti precedenti rendono essenziale simultanea misurazione multi-parametro mediante citometria a flusso multi-colore. Multi-colore flusso richiede design del pannello indicatore complesso, compensazione e gating strategie, a causa di sovrapposizione spettrale di fluorescenza. Questo rapporto inoltre tentato di dimostrare al pubblico/lettori interessato il processo del tumore immune il profiling via tumore definito tessuto dissociazione e analisi di citometria a flusso multi-colore.
Tre fasi critiche potrebbero essere particolarmente importante per la resa produttiva TIL analisi: in primo luogo, un'alta resa di cellule vitali recuperato da dissociato tumori utilizzando le procedure di dissociazione del tumore su misura; secondo, il design ottimizzato della grande multi-colore colorazione pannelli basati su reagenti disponibili; in terzo luogo, una strategia di gating ottimizzata nell'analisi. Gli autori vorrei sottolineare l'addestramento e l'esperienza degli operatori di acquisizione dati e di analisi sono essenziali per l'analisi di citometria a flusso successo di TIL.
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Disclosures
Tutti gli autori sono dipendenti a tempo pieno di corona Bioscience, Inc.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare Dr. Jody Barbeau - per la lettura critica e di editing del manoscritto e grazie Ralph Manuel per la progettazione di opere d'arte. Gli autori vorrei anche ringraziare il team corona Bioscience oncologia Immuno-Oncology Biomarker e oncologia In Vivo , per i loro grandi sforzi tecnici.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | \ | SAS3119 | \ |
| Trocar 20 | \ | \ | 2 mm |
| Petri dish | \ | \ | 20 mm |
| 100x antibiotic and antimycotic | \ | \ | \ |
| Iodophor swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Alcohol swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Liquid nitrogen | Air chemical | \ | \ |
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | \ |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | \ |
| antibodies | BD | \ | \ |
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | \ |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | \ |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | \ |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70 µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2 mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | \ |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | \ |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | \ |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | \ |
| FlowJo software | FlowJo LLC | \ | vs 10.0 |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50 mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | \ |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | \ |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10 cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10 cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | \ |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100 g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | \ |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | \ |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | \ |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8 mL |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | \ |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | \ | 1-5 mL |
| Studylog software | Studylog | \ | software |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50 mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15 mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4 °C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | -20 °C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | -80 °C |
| RNAlater | Thermo | am7021 | \ |
References
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