Summary
O procedimento experimental sobre o immunophenotyping de stent de murino ortotópico PDAC visa perfilação a imuno-microambiente do tumor. Os tumores são orthotopically implantado através de cirurgia. Tumores de 200-600 mm3 no tamanho foram colhidos e dissociados para preparar suspensões de célula única, seguidas de análise multi imune marcador FACS usando diferentes anticorpos fluorescente-etiquetadas.
Abstract
Homograft (syngeneic) tumores são o carro-chefe de pesquisa pré-clínica do hoje imuno-Oncologia (i/o). O microambiente do tumor (TME), particularmente seus componentes-imunológico, é vital para o prognóstico e previsão de resultados dos tratamentos, especialmente aqueles de imunoterapia. TME imune-componentes são compostos de diferentes subconjuntos de tumor infiltrando as células imunes avaliável por multi cor FACS. Adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) está entre os mais mortíferos malignances falta de opções de tratamento bom, assim, uma necessidade urgente e insatisfeita médica. Uma razão importante para a sua não-capacidade de resposta às diversas terapias (quimioterapia-, alvo, I/O) tem sido seu TME abundante, composta por fibroblastos e leucócitos que protegem as células do tumor destas terapias. Orthotopically implantado PDAC acredita-se que mais precisão recapturar o TME de cânceres pancreáticos humanos do que os modelos convencionais de subcutânea (SC).
Tumores homograft (KPC) são transplantes de rato espontânea PDAC originários de KPC-ratos geneticamente modificados (K-rasG12D / +/P53- / -/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). O tecido do tumor primário é cortado em pequenos fragmentos (~ 2 mm3) e transplantado por via subcutânea (SC) para os destinatários syngeneic (C57BL/6, 7-9 semanas de idade). O stent foram então cirurgicamente orthotopically transplantado para o pâncreas de novos camundongos C57BL/6, juntamente com SC-implantação, que atingiram volumes de tumor de 300 – 1.000 mm3 por 17 dias. Somente os tumores de 400 – 600 mm3 foram colhidos por procedimento aprovado autópsia e limpo para remover os tecidos de tumor não adjacentes. Eles foram dissociados por protocolo usando um dissociador tecido em suspensões de célula única, seguidas por coloração com painéis designados de fluorescente etiquetado anticorpos para os vários marcadores de diferentes células do sistema imunológico (linfoide, mieloide e NK, DCs). As amostras coradas foram analisadas usando FACS multi cor para determinar o número de células do sistema imunológico de linhagens diferentes, bem como a sua percentagem relativa dentro de tumores. Os perfis imunes de ortotópico tumores foram então comparados dos tumores do SC. Os dados preliminares demonstraram TILs/TAMs infiltrante significativamente elevados em tumores sobre o pâncreas e infiltração de células B maior ortotópico em vez de tumores do SC.
Introduction
Adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) faz com que quase a metade um milhão mortalidade mundial anualmente, um dos top 5 câncer assassinos. Há poucas opções de tratamento eficazes e imunoterapias não aprovadas; Portanto, novos tratamentos são desesperadamente necessários. Cancros são cada vez mais sendo reconhecidos como doenças imunológicas, incluindo PDAC, além das doenças genéticas, como conhecido hoje. Fatores imunológicos e genéticos provavelmente iria determinar o prognóstico da doença, bem como tratamento os resultados. Tumores de iludir a vigilância imune hospedeiro e eventualmente avançam para causar a morte. Muitos destes processos imunes ocorrerem dentro o microambiente do tumor (TME)1,2,3,4 onde diferentes tipos de células do sistema imunológico interagem com células tumorais, com o outro e com outro tumor componentes do estroma, diretamente ou indiretamente através de citocinas que, finalmente, determinar o resultado de doença. Portanto, a caracterização dos componentes imunes tumor da TME ou tumor immunophenotyping, incluindo subtipos, numeração e localização de diferentes linhagens de células do sistema imunológico, é fundamental para compreensão imunidade anti-tumoral. No caso do PDAC, foi proposto que elevou o tumor infiltrando supressivos macrófagos (TAM) e células B conduziram a prevenção da infiltração de células T e/ou ativação e níveis elevados de fibrose5,6.
A abordagem comum para TMEs imunes a investigar experimentalmente estaria usando modelos animais pré-clínicos de substituto tumor, tumor de rato principalmente relevante os modelos7, particularmente do mouse syngeneic (homograft) ou modelos de rato geneticamente modificados (GEMM) de câncer, na similaridade assumida de rato e humanos para tumores e imunidade8,9. Entende-se na realidade que existem diferenças inerentes entre as duas espécies de10,11.
Transplantado rato tumores têm vantagens operacionais significativas sobre tumores espontânea7, ou seja desenvolvimento de tumor sincronizado, em contraste com o desenvolvimento de tumor espontânea GEMM parental. Stent de tumores murino espontâneas é considerados tumores primários nunca tendo sido manipularam in vitroe espelhamento original rato tumor histo - molecular patologia7, bem como possíveis perfis imunes. Estes murino stent é muitas vezes consideradas ser "uma versão do mouse do paciente-derivado xenografts (PDXs)". Portanto eles provavelmente têm um melhor Traduzibilidade próprios que cela syngeneic convencional linha-derivado do mouse tumores12. Em particular, muitos stent é derivadas do GEMM específico onde mecanismos de doenças humanas específicas, por exemplo, as mutações de motorista oncogênica, são projetados, e estes stent, portanto, deve ter vantagens para sua relevância clínica. Em particular, a KPC GEMM desenvolver rato PDAC dentro de 15-20 semanas de idade, que recapitula morfologicamente a doença humana com predominantemente bem a moderadamente-diferenciadas de arquitetura glandular e altamente enriquecido o estroma. Este modelo também recapitula as características genéticas mais comuns de PDAC humana, nomeadamente Kras ativando mutação e perda-de-função P53, que ocorrem em 90% e 75% do PDAC humana, respectivamente de5,6.
Sites de transplante também sugeridos que desempenham um papel na Traduzibilidade próprios do modelo. Específicos do ambiente circundante de tecido, como um ambiente ortotópico correspondente, poderia ser um nicho para tumores específicos para ambientes de progresso, em oposição a uniforme subcutânea (SC) para tumores comumente transplantados. Seria de particular interesse se, e/ou, que diferença existe entre os dois locais de transplante, em termos de microambiente imunológico e a relevância para câncer humano, por exemplo. no caso do PDAC.
Um dos aspectos mais importantes da criação de perfil imune, ou immunophenotyping, é determinar o tumor infiltrando as células imunes de linhagens diferentes, os números, percentual relativo dentro tumores, bem como seus Estados de ativação e locais. Isso inclui o tumor-infiltratrating lymphoctyes (TILs, ambos T - e B-), tumor infiltrando macrófagos (TAMs), tumor infiltrando células assassinas naturais (NKs) e residente em tumor dendrítica células3,13,14 , 15 , 16 , 17e a Localização subcellular de certas células18,19,20, etc. Fluorescência citometria de fluxo ou classificação de celular ativado (FACS) é uma tecnologia de deteção de célula única que é comumente usada para medir os parâmetros específicos de uma célula. Multi cor medidas de citometria de fluxo vários marcadores em uma única célula3,4,21 e é o método mais comumente utilizado para determinar o número e a percentagem relativa de diferentes subconjuntos de células do sistema imunológico, incluindo aqueles dentro de tumores.
Este relatório descreve procedimentos para perfilação tumor infiltrando células do sistema imunológico: 1) implantação de ortotópico PDAC rato tumor stent, juntamente com a implantação de SC; 2) tumor tecido colheita e preparação única célula através de dissociação de tumor; 3) análise de citometria de fluxo de todas as células derivadas de tumores, como uma linha de base; 4) comparação dos perfis de linha de base de ambas as abordagens de transplante.
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Protocol
Todos os protocolos e aditamentos ou procedimentos que envolvem o cuidado e a utilização de animais serão revistos e aprovados pela coroa Bioscience institucional Animal Care e Use Comité (IACUC) antes da realização de estudos. O cuidado e a utilização de animais serão normalmente conduzidas em conformidade com as diretrizes internacionais AAALAC (Associação para a avaliação e acreditação of Laboratory Animal Care) conforme relatado no guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório, pesquisa nacional Conselho (2011). Todos os procedimentos experimentais animais estarão sob condições estéreis, nas instalações da SPF (específico isentos de organismos patogénicos) e conduzido em estrita conformidade com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório, de instituições de governo diferentes (por exemplo Os institutos nacionais de saúde). O protocolo terá de ser aprovado pelo Comité de ética de Animal experiências na instituição de instalação (por exemplo, Comissão dos assuntos institucionais IACUC).
1. preparação para o transplante de Tumor
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Alojamento dos animais
- Obter genéricos camundongos C57BL/6 de um fornecedor de reprodução comercial.
- Ratos de casa (5) em gaiolas ventiladas individuais nas seguintes condições: temperatura: 20-26 ° C; 30 – 70% de umidade; ciclo de iluminação: luz 12 h e 12 h de escuro.
- Uso milho espiga de cama é mudada semanalmente.
- Para dieta, fornece irradiação esterilizada grânulo seco comida durante o período de estudo inteiro.
- Para a água, fornece animais livre acesso à água potável estéril.
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Preparação de fragmento de tumor de doador
- Começar pelo monitoramento do peso corporal (PC), através de pesagem usando um contrapeso e tumor volume (TV), pela medição da maxila, dos ratos de tumor-rolamento doador.
- Quando TV atinge 500 – 1.200 mm3, abater o animal em uma capa de risco biológico conforme protocolo.
- Esterilize a pele ao redor do tumor, usando cotonetes Iodofor.
- Remover cirurgicamente o tumor (detalhes descritos na secção 3: colheita de necropsia e tumor) e coloque o tumor em uma placa de Petri contendo 20 mL de PBS (pre-chill a mídia ou o buffer de 4 ° C antes da eutanásia de animais).
- Se houver sangue contaminante, transferir o tumor em outra placa de Petri e lavar o tumor com PBS.
- Cortado ao meio, removendo qualquer excesso de pele, vasos, calcificação e/ou necrose, o tumor.
- Escolha apenas intactas partes do tumor e colocá-los em um tubo de centrífuga estéril 50 mL e adicionar 20 mL de PBS então transportar o tubo para uma sala separada de animais para estudos de farmacologia.
2. ortotópico e enxertia subcutânea (SC)
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Inoculação de SC
- Corte de tumores em 2 mm peças de diâmetro utilizando um bisturi, colocar 1 pedaço cada trocarte, para implantação de SC ou para posterior implantação ortotópico (veja abaixo).
- Anestesia o animal destinatário com 5% de isoflurano, que é mantido por um cone de nariz em 1%. O animal vai começar a relaxar, perder seu braço endireitante reflex e eventualmente tornar-se imóvel. A esta profundidade da anestesia pode facilmente ser despertados por estímulos dolorosos; permitir que a anestesia aprofundar até tais respostas à dor estão ausentes.
- Uma vez anestesiado, consertar os ratos em uma placa de experiência em posição lateral direita. Esterilize o mouse usando cotonetes Iodofor, particularmente as áreas circundantes dos tumores.
- Com um bisturi, faça uma incisão de pele de 0,5 a 1,0 cm no flanco esquerdo, só craniano até à anca.
- Túnel sob a pele no sentido do membro anterior, dois ou três centímetros, com fórceps rombudo.
- Assepticamente, transferir um cubo de tumor do meio e coloque no fundo do túnel subcutâneo.
- Visualmente, confirme que o tumor é no fundo do túnel (e não da incisão na pele).
- Feche a ferida com clipes de ferida.
- Monitore a animais post inoculação até recobra a consciência suficiente para manter o decúbito esternal. Animais de retorno de volta para sua gaiola somente após sua completa recuperação da anestesia. Completar o Log de anestesia e iniciar o gráfico de Saúde Animal. Pesar o destinatários animais diariamente por três dias
- Para um procedimento padrão, inocule os ratos de 5-10 por grupo para monitoramento de crescimento do tumor.
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Implantação ortotópico pancreático
- Anestesia e Analgesia
- Usar uma injeção de 2 mL cetamina e injeção de xilazina 0,42 mL (20 mg/mL) misturado com 5.91 água de injeção estéril ou solução salina em um volume de dose de 0,06 – 0.1 mL/20-25 g de massa corporal.
Nota: De acordo com o bem-estar dos animal, analgesia é necessária ambos pré e pós operação. 0,05-0,1 mg /kg de buprenorfina, SC. A primeira dose é pré operação e depois uma dose 3 vezes cada operação de post 4 horas continuamente.
- Usar uma injeção de 2 mL cetamina e injeção de xilazina 0,42 mL (20 mg/mL) misturado com 5.91 água de injeção estéril ou solução salina em um volume de dose de 0,06 – 0.1 mL/20-25 g de massa corporal.
- Operação cirúrgica para implantação ortotópico
- ANESTHETIZE ratos através de injeção intramuscular (IM) por passo 2.2.1.
- Depois que os animais são totalmente anestesiados, consertar os ratos em uma placa de experiência em posição lateral direita.
- Manter os ratos na posição lateral direita. Desinfecte a pele ao redor do baço com iodo depois de-iodinate com 75% de álcool etílico.
- Encontrar o ponto médio do baço e fazer uma incisão vertical de 1 cm no abdômen para expor o baço.
- Tirar uma parte do tecido do pâncreas sob o baço delicadamente com uma pinça de ponta plana e um pedaço de tumor homograft do mouse do mouse semente no pâncreas de rato destinatário de sutura por sutura cirúrgica de 9-0.
- Feche o abdômen com uma sutura de seda 6-0 a costura dupla. Alcançar a homeostase por compressão.
- Após o implante de tumor acabamento, se ocorrer sangramento nem tumor vazamento de tecido, manter os animais em uma gaiola quente.
- Monitorar o animal até que recupere a consciência suficiente para manter a prostração esternal; devolver o animal para a sala de animais após a completa recuperação da anestesia. Monitorar o tumor rolamento ratos por palpação do abdômen, perto do baço e selecionar para fora os ratos com tumores ortotópico.
- Anestesia e Analgesia
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Tumor-rolamento ratos saúde monitoramento
- Verifica o consumo de água e comida diariamente.
- Examine a aparência do mouse para uma pelagem ungroomed, pedaços, magreza, respiração anormal ou ascite.
- Palpe o abdómen para verificar se existem espontâneas tumores no fígado ou baço.
- Ratos, semanalmente, utilizando uma balança de pesar.
- Se qualquer um dos seguintes sinais clínicos são observados, os ratos são sacrificados para coleta de amostra e necropsia: perda de BW > 20%; prejudicada mobilidade (não é capaz de comer ou beber); incapaz de se mover normalmente devido à ascite significativa e alargada do abdome; esforço na respiração.
3. necrópsia e colheita de Tumor
- Inspecione visualmente e por palpação para a presença de tumores palpáveis antes do término.
- Rescisão, primeiro eutanásia em ratos conforme protocolo aprovado e abrir o abdômen e examinar visualmente o pâncreas para tumores.
- Corte o tumor por cirurgia mortal post e adicioná-lo ao frio PBS. Coloque todos os animais em uma câmara de eutanásia limpo, sem acusações, translúcido com tampa especial com uma porta para a entrega do dióxido de carbono a ser usado.
- Descarga de gás para a câmara a uma taxa de fluxo que produz inconsciência rápida com mínimo desconforto para o animal. A taxa de fluxo ideal para CO2 deve ser cerca de 2-2,5 L/min.
- Observe visualmente cada animal durante o procedimento de eutanásia para garantir a todos os animais recebem as concentrações de gases adequada e não recuperar a consciência durante o procedimento de euthanize.
- Manter o fluxo de gás pelo menos 1 min após a aparente morte clínica para minimizar a possibilidade de que um animal pode se recuperar (se apneicos mas não morto).
- Remova tecidos adjacentes não-tumoral. Tumor limpo pode ser fotografada rapidamente.
Coloque os tecidos de tumor em RPMI-1640 e manter no gelo antes de dissociação.
Nota: Carcaças de animais são ensacadas e armazenadas no congelador apropriado aguardar a remoção.
4. tumor tecido dissociação e única célula preparação
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Preparação do reagente
Nota: O Kit de dissociação de Tumor contém 2 frascos de enzima D (pó liofilizado), 1 frasco de enzima R (pó liofilizado), 1 frasco de enzima A (pó liofilizado) e 1 mL de tampão A.- Prepare-se D enzima reconstituir o pó liofilizado em cada frasco com 3 mL de RPMI-1640. Prepare alíquotas de um volume adequado para evitar o congelamento-descongelamento-ciclos repetidos.
- Prepare a enzima R, reconstituir o pó liofilizado no frasco com 2,7 mL de RPMI 1640. Prepare alíquotas de um volume adequado para evitar o congelamento-descongelamento-ciclos repetidos.
- Prepare-se enzima A reconstituir o pó liofilizado no frasco com 1 mL de tampão A fornecidos com o kit. Fazer não o vórtice. Prepare alíquotas de um volume adequado para evitar grátis-degelo-ciclos repetidos.
- Prepare a mistura de enzima adicionando 2,35 mL de RPMI-1640, 100 µ l de enzima D, 50 µ l de enzima R e 12,5 µ l da enzima A em cada gentleMACS C-tubo.
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Dissociação do tumor
- Para cada tumor preparar um tubo C com mistura de digestão do tumor, por favor consulte a secção 4.1 para a preparação e diluição de tampão de digestão.
- Uso 3 mL digestão de tampão para fragmentos de tumor < 0,8 g e garantir que o tumor é totalmente digerido.
- Etiqueta com o código de estudo, tumor, rato ID, grupo de tratamento e peso do tumor.
- Recolher o tumor do mouse, lave o tumor em PBS fria e limpa o tecido anexado do tumor (tais como os vasos sanguíneos, gordura, fáscia, etc.).
- Colocar o tumor em mídia de digestão em um poço de um prato bem 6 estéril.
- Segure o tumor no lugar com uma pinça/Pinças esterilizadas e corte com um bisturi. Fatie o tumor bem o suficiente para quebrar em pedaços menores (~ 1 mm3).
- Coloque os pedaços de tumor volta no tubo de C... e usar o buffer de digestão restantes para lavar a placa e depois transferir o líquido para o C-tubo que é colocado no gelo até a digestão.
- Ligue o dissociador com aquecedores.
- Coloque a dissociação de tumor C-tubos de cabeça para baixo em mangas das posições vagas e ajustar o status de posições do tubo de Free para selecionado. Escolha um programa de dissociação (37_c_m_TDK_1), seguido pela seleção da pasta necessária, onde a lista de programas é exibida.
- Após o término do programa, tire C-tubos a dissociador e spin brevemente (300 x g, 4 ° C) para a amostra de Pelotas.
- Re-suspender as amostras e coloque em um coador de célula acima de um tubo de 50 mL. Lave as células através do filtro de celular com 10 mL de tampão de lavagem para fornecer uma suspensão de célula única.
- Centrifugar os tubos a 300 x g por 5 min, desprezar o sobrenadante e ressuspender as células com 5 mL de tampão de lavagem, contagem de células viáveis usando trypan azul e/ou pelo contador de célula e ajustar a célula concentraton a 1 x 106 células por tubo ou por amostra. Incluem os anticorpos de controle isotipo correta para garantir a coloração é específica
5. projeto do painel imune e aquisição de dados de fluxo
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Projeto do painel
- Por favor, consulte a tabela 1.
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Immunostaining
- Células de amostra FC-bloco: re-suspender as células em 200 µ l de buffer com 1 µ g/mL Fc-bloco, seguido de incubação sobre refrigeração de gelo ou a 4 ° C por 15 min no escuro a coloração.
- Mancha de células usando os painéis de anticorpos/fluorescência desejado (por exemplo. T-Cell painel, painel do macrófago, etc.): Adicione a mistura de anticorpo diluída em tampão de bloqueio de Fc para cada amostra, a mancha pelo menos 30 min no gelo no escuro.
- Adicionar 1 mL de PBS frio gelo a cada tubo e ressuspender as células suavemente, seguido por centrifugação a 300 x g durante 5 min. descartar o sobrenadante resultante.
- Repita o procedimento para lavar as células duas vezes.
- Mancha para marcadores intracelulares, se necessário, seguintes passos 6-10, caso contrário pule para o passo 10.
- Ressuspender o centrifugado pelo vórtice do pulso e adicionar 200 µ l de solução de trabalho de fixação/permeabilização preparada para cada amostra. Vórtice de pulso novamente e então incubar a 4 ° C durante a noite (preferencial) ou 30 min à temperatura ambiente no escuro.
- Gire para baixo as células e remover o sobrenadante.
- Lave duas vezes pela adição de 1 mL de tampão de permeabilização (feita a partir de 10x Buffer de permeabilização, diluída com água destilada H2O) 1x seguido de centrifugação e decantação do sobrenadante.
- Adicione o anticorpo marcador intracelular em tampão de permeabilização 1x e incubar a temperatura ambiente por 30 min no escuro.
- Lave as células duas vezes com 1 mL de tampão de permeabilização 1x. Centrifugar e decantar o líquido sobrenadante.
- Ressuspender as células em 150 µ l de tampão de coloração e analisar em um citômetro. Devido ao processo de fixação e permeabilização, o FSC (dispersão de luz para a frente) / distribuição de SSC (dispersão sidelight) da população celular será diferente de células vivas. Portanto, o portão e tensões precisará ser modificado.
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Controles FMO (fluorescência menos um controle)
Nota: Análise de fluxo de multi-color é particularmente importante para a análise das células do sistema imunológico tumor infiltrando. Portanto, há uma necessidade de encontrar uma maneira de identificar e células no contexto de dados se espalhou devido as várias fluorochromes em um determinado painel da porta. Controle FMO (menos uma fluorescência) é uma abordagem importante para essa finalidade.- Para este fim, incluem mouses adicionais em cada grupo para controles FMO (pelo menos 2 por Rx) e processo individual para cada tecido. Após a dissociação, tecidos de piscina. Por exemplo, em um estudo com 4 grupos de Rx, 8 tumores adicionais devem ser processados individualmente e então agrupados em uma amostra para FMO.
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Configuração de instrumento de fluxo
- Fazer contas de compensação, enquanto a máquina está a aquecer (pelo menos 20 min).
- Use grânulos do CS & T para verificar o desempenho.
- Configurações de tensão e compensação: usar grânulos UltraComp, vórtice o Comp grânulos cuidadosamente antes de usar.
- Rotule um tubo de amostra2 12 x 75mm separado para cada anticorpo conjugado fluorocromo.
- Adicione 100 µ l de buffer para cada tubo de coloração. Adicione 1 gota cheia (cerca de 60 µ l) dos grânulos para cada tubo.
- Acrescente os anticorpos e realizar o procedimento de coloração exatamente como o processo de amostra afirmado na seção 4.
- Adicione 0,5 mL de tampão cada, completamente re-suspender pelotas grânulo através do vórtice de coloração.
- Definir a tensão de PGTO de citômetro de fluxo por tecido-alvo para a determinada experiência.
- Execute através do citômetro de fluxo para aquisição de dados, por retenção na população de grânulo singlete por leituras de FSC e SSC.
- Definir taxa de fluxo em torno de 200 – 300 eventos/s.
- Definir a compensação adequada para uma determinado fluoresceína [FITC]-anticorpo conjugado, uso um FL1 vs FL2 ponto enredo.
- Coloque um portão do quadrante grânulos negativos estão no quadrante inferior esquerdo e os grânulos positivos estão na parte superior ou inferior direito quadrante. Ajuste os valores de compensação até a intensidade de fluorescência mediana (IFM) de cada população (como mostrado na janela de estatísticas do quadrante) é aproximadamente igual (ou seja, para FL2-% FL1, FL2 IFM de ambas as contas devem ser semelhante).
- Repita as etapas 5.4.11 e 5.4.12 para todos os tubos.
- Proceda para adquirir o real manchada de amostras. Execute o assistente de compensação e salvar as configurações com o formato "data experimentar suas iniciais".
6. fluxo de dados análise e apresentação
- Analise dados por Flowjo e/ou Kaluza.
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Representative Results
Ortotópico implantação do PDAC resultou no crescimento do tumor rápida semelhante à observada para implantação de SC. Depois que os fragmentos de tumor de doadores foram implantados em ratos destinatários, tanto por via subcutânea e orthotopically de acordo com os protocolos descrito nos passos 2.1 e 2.2, os tumores de homograft KPC implantados demonstraram semelhante rápido crescimento, como mostrado em figura 1A . Tumores de homograft KPC colhidas nos pontos de tempo diferentes são mostrados na figura 1B e representante H & E imagens são mostradas Figura 1. Nossos dados demonstraram crescimento semelhante de SC e ortotópico implantes.
Células tumorais viáveis e células no TME, incluindo tumor infiltrando as células imunes, originários de ortotópico ou implantação de SC, podem ser recuperadas de forma eficiente. Tumores foram colhidas e digeridos para preparar suspensões celulares único para posterior análise de FACS usando um dissociador comercial (Figura 2A), de acordo com o protocolo descrito na etapa 4. Nós geralmente obtido rendimentos razoavelmente alta célula viável das amostras de tumor de ambos os tipos de implantação (viabilidade de ~ 80% baseada em Trypan azul); o enredo de FACS representativo mostra células viáveis de tumor, separada os restos de células mortas/célula (Figura 2B).
Tumor infiltrando as células imunes de subconjuntos diferentes foram identificadas em ortotópico e tumores SC implantado, enquanto seus perfis têm diferenças. A suspensão de célula única preparada a partir de tecidos do tumor, usando o método descrito na etapa 4.2 foram submetidas a análise de FACS após coloração com um painel de 16 cores de marcadores mostrados na tabela 1, que abrange diferentes linhagens de células do sistema imunológico importantes como bem como as células do tumor. A hierarquia de linhagem de estratégia ou imune associada juntamente com parcelas representativas do fluxo é mostrada na Figura 3A. CD45, um marcador para todas as células do sistema imunológico maduros, foi usado para o distintivo de células tumorais e células imunes tumor infiltrando. Todas as linhagens imunes foram posteriormente analisadas de CD45+ populações conforme exibido pelo painel (tabela 1).
Ao lado de marcadores, tamanho da célula também é usado para diferenciar diferentes subpopulações (Figura 3B esquerdo) para quantificar a subconjuntos de célula, incluindo T, linfócitos B, macrófagos e MDSCs, etc. Tumor infiltrando a comparação do perfil imune de SC vs ortotópico stent de cânceres pancreáticos. As populações de grandes células enumerado de vários subconjuntos chaves de tumor infiltrando as células imunes são mostradas Figura 3. Os dados mostram claramente que o tumor aumentou significativamente a infiltração de células imunes, em comparação com o pâncreas de ratos saudáveis. Além disso, diferentes percentagens de subconjunto de células do sistema imunológico tumor infiltrando foram encontradas em ortotópico vs. Stent de SC, por exemplo, significativamente mais B-cells em ortotópico do que em SC.
| Marcador | População de células imunes |
| CD45 | Leucócitos totais |
| CD3 | Pilhas de T totais |
| CD4 | Células de CD4 + T helper |
| CD8 | Células T citotóxicas CD8 + |
| CD44 / CD62L * | Ingênuo, memória e efetoras células T |
| CD69/CD44/OX40/CD25 etc* | Marcadores de ativação |
| CD4 + CD25 + FoxP3 + | Pilhas de T reguladoras |
| CD11b + Ly6c/Ly6g | MDSC-G e M-MDSC |
| CD11b + F4/80 | Macrófagos |
| IA/IE/CD206 | Macrófagos M1 e M2 |
| CD3-CD335 + | Células NK |
| CD3 + CD335 + | Células NKT |
| CD19 | Células B |
| TNF-a/IFN-r/IL-7/IL-3 etc.* | Citocinas |
| PD-1/PD-L1/CTLA-4/TIM-3 etc.* | Inibidores de ponto de verificação |
| B Granzym etc* | Comumente solicitados marcadores |
| KI67/Brd U/PNCA etc | Proliferação |
| Ao vivo/morto (conserto) | Ao vivo/morto |
| * Nota: Marcadores adicionais podem ser adicionados conforme necessário | |
Tabela 1: painéis de 16 cores fluxo projetados para análise de células do sistema imunológico do mouse tumor infiltrando.
Figura 1: tanto ortotópico e SC (fosse) implantaram tumores de homograft PDAC C57BL/6 ratos demonstrados crescimento semelhante com ou sem tratamento de gemcitabina. Curva de crescimento (A): SC-esquerda e direita ortotópico. Azul: Veículo; Ouro: Gemcitabina (iniciada na inoculação de post do dia 10, quando o volume médio de tumor SC chegou a 200 mm3). (B) os tecidos de tumor em pontos diferentes do tempo. (C) representante H & E mancha de dois tipos de stent (40 x 10). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: dissociação de tecido do Tumor para preparar a suspensão de célula única viável. (A) o uso da disassociator; Células (B) o viável, separou as células mortas, como demonstrado pela análise do fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: análise de fluxo de multi-color do tumor infiltrando células do sistema imunológico de ambos ortotópico e stent PDAC SC. Os dados brutos de cada amostra de tumor foram adquiridos a partir do instrumento de citometria de fluxo, seguido de análise usando o software de análise de Flowjo FACS. (A), a estratégia padrão associada para a análise, é exibido como um exemplo; (B) fluxo representativo de canais e análise de dados usando o padrão de retenção de estratégia; (C) representante tumor infiltrando imune célulasestão exibido para incluir as células B, Treg e dos macrófagos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Embora estudos utilizando tumores de SC são mais facilmente conduzidos, modelos de tumores orthotopically implantado podem potencialmente ter mais relevantes para os estudos de farmacologia pré-clínica (particularmente as investigações I/O) fornecer Traduzibilidade próprios reforçado. Este relatório visa ajudar o leitores/público interessado para ser capaz de Visualizar diretamente os procedimentos técnicos que podem ser usados em suas respectivas pesquisas. Nossos protocolos de demonstram essa ortotópico implantação do PDAC pode resultar no crescimento do tumor eficiente, semelhante à implantação de SC. Nossas observações também parecem sugerir que a presença de diferentes perfis imunes de TMEs das implantações diferentes. Os principais desafios para se adaptar ortotópico, em comparação com implantes de SC, são que habilidades complexas são necessárias, o processo é demorado, os procedimentos cirúrgicos para implantação são mão de obra intensiva e também a dificuldade de monitoramento ortotópico tumor crescimento na vida.
Existem quatro passos críticos para garantir que com êxito são realizados experimentos de tumor pancreático ortotópico: 1) o procedimento cirúrgico de implantação; 2) a monitorização cuidadosa e atempada do desenvolvimento do tumor; 3) a importância de realizar o pré-experimento testa primeiro familiarizar-se com o procedimento e avaliar a taxa de tomada e taxa de crescimento do tumor; 4) utilizando suspensões única célula de tumores dissociadas como um método alternativo de enxertia. Este procedimento de relatório é útil para os leitores para a realização de pesquisa usando este homograft específico, bem como outros modelos ortotópico pancreático, e até mesmo outros ortotópico modelos envolvendo cirurgia de abdômen-abertura.
Citometria de fluxo ou FACS é atualmente a ferramenta mais importante para executar immunoprofiling. Immunophenotyping de tumores por FACS difere significativamente de células de diferentes órgãos, tais como o sangue periférico, baço, linfonodos e medula óssea das seguintes maneiras. Geralmente, há uma porcentagem muito pequena de células do sistema imunológico presentes em tumores (pequeno tamanho da amostra). A extrema heterogeneidade dos tumores e o pequeno número de células do sistema imunológico presentes fazer recuperação raras imunes células viáveis tecnicamente desafiador, necessitando de tumor desenvolvidos tecido dissociação envolvendo máquinas. Os dois pontos anteriores fazem medição simultânea de vários parâmetro usando citometria de fluxo multi cor essencial. Fluxo de multi cor requer complexo marcador painel design, compensação e retenção de estratégias, devido à sobreposição espectral de fluorescência. Este relatório também tentou demonstrar para o leitores/público interessado, o processo de tumor imune de perfil através de dissociação de tecido do tumor definidos e análise de citometria de fluxo multi cor.
Três passos críticos podem ser particularmente importantes para o rendimento produtivo TIL análise: primeiro, um alto rendimento de células viáveis recuperadas dissociado tumores usando procedimentos de dissociação de tumor personalizado; segundo, o projeto aperfeiçoado de grande multi cor coloração painéis em reagentes disponíveis; terceiro, uma estratégia associada otimizado em análise. Os autores gostaria de enfatizar a formação e experiência dos operadores de aquisição de dados e de análise são essenciais para a análise de citometria de fluxo bem sucedida de TIL.
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Disclosures
Todos os autores são empregados em tempo integral da coroa Bioscience, Inc.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer o Dr. Jody Barbeau - leitura crítica e edição do manuscrito e graças a Ralph Manuel para a concepção de obras de arte. Os autores também gostaria de agradecer a equipe de coroa Bioscience biomarcador de imuno-Oncologia Oncologia e a equipe de Oncologia In Vivo , por seus grandes esforços técnicos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | \ | SAS3119 | \ |
| Trocar 20 | \ | \ | 2 mm |
| Petri dish | \ | \ | 20 mm |
| 100x antibiotic and antimycotic | \ | \ | \ |
| Iodophor swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Alcohol swabs | \ | \ | Daily pharmacy purchase |
| Liquid nitrogen | Air chemical | \ | \ |
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | \ |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | \ |
| antibodies | BD | \ | \ |
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | \ |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | \ |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | \ |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70 µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2 mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | \ |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | \ |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | \ |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | \ |
| FlowJo software | FlowJo LLC | \ | vs 10.0 |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50 mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | \ |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | \ |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10 cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10 cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | \ |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100 g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | \ |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | \ |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | \ |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8 mL |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | \ |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | \ | 1-5 mL |
| Studylog software | Studylog | \ | software |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50 mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15 mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4 °C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | -20 °C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | -80 °C |
| RNAlater | Thermo | am7021 | \ |
References
- Chevrier, S., et al. An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
- Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. Monitoring immune responses in the tumor microenvironment. Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).
- Mosely, S. I., et al. Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery. Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).
- Gunderson, A. J., et al. Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer. Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).
- Erdag, G., et al. Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma. Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).
- Gutiérrez-Garcia, G., et al. Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy. Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).
- Paiva, B., et al. PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma. Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).
- Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).
- Lavin, Y., et al. Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses. Cell. 169 (4), 750-765 (2017).
- Mahoney, K. M., et al. PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells. Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).
- Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining. Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).
- Jiang, Y., et al. ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer. Ann. Surg. , (2016).
- Ribas, A., et al. PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells. Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).
