Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

שיתוף השתלת רקמת השחלה האנושי עם תאי אנדותל מהונדסים: שילוב אסטרטגיה מבוסס תא מואצת זלוף עם מסירה ישירה Paracrine

doi: 10.3791/57472 Published: May 16, 2018

Summary

עבור חלק מהחולים, האפשרות היחידה לשימור פוריות היא הקפאה קריוגנית רקמת השחלה. למרבה הצער, שאיחרו revascularization מערערת הכדאיות הזקיקים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שיתוף להשתיל רקמה אנושית השחלות עם תאי אנדותל עבור זלוף ניצול כאסטרטגיה מבוססת תא שילוב מואצת עם משלוח ישיר paracrine של מולקולות ביו...

Abstract

פוריות היא תופעת לוואי תכופים של כימותרפיה ו/או הקרנות, עבור חלק מהחולים, הקפאה קריוגנית של oocytes או עוברי הוא לא אופציה. כחלופה, מספר גדל והולך של חולים אלו בוחרים cryopreserve רקמות השחלה עבור בשתל בעקבות התאוששות, הפוגה. למרות שיפורים בתוצאות בקרב חולים שעברו אוטומטי-השתלת רקמת השחלה cryopreserved, revascularization יעיל של רקמות המושתל נשאר ולקידמה. כדי להמתיק איסכמיה ובכך לשפר את התוצאות בחולים העוברים השתלת אוטומטי, פיתחנו כלי הדם מבוססת תא אסטרטגיה האצת זלוף רקמת השחלה. נתאר שיטת שיתוף השתלת תאי אנדותל אקסוגני (המנהלים) עם cryopreserved רקמות השחלה במודל xenograft של עכברים. אנחנו מרחיבים גישה זו להעסיק. את המנהלים כי יש מהונדס לבטא צורונים הורמון אנטי-mullerian מעורבת (AMH), ובכך מאפשר paracrine מתמשכת איתות של הקלט שתלי השחלות. השתלת שיתוף עם המנהלים גדל נפח הזקיקים ופיתוח זקיק antral משופר, המנהלים לבטא AMH קידום השמירה של זקיקי הקדמוני השבתה הדרגתית. אסטרטגיה משולבת זו עשויה להיות כלי שימושי מקלים איסכמיה להתכוונן הפעלה הזקיקים בהקשר של שימור פוריות ו/או עקרות בכללותו.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הסרטן נשאר בין הגורמים המובילים. למוות בעולם המפותח, עדיין עשורים של מחקר הניבו התקדמות משמעותית במרבית הסוגים של סרטן, ובעוד כמה שיעורי הישרדות כמעט כפולים מקרים1. למרבה הצער, סוכנים כימותרפיות הם לעתים קרובות gonadotoxic, depleting השמורה של זקיקים הקדמוני של השחלות והפחתת פוריות2. זו אוכלוסיה גדלה יכולים להפיק תועלת שיטות שונות של שימור פוריות כולל הקפאה קריוגנית oocyte ו/או העובר, עם זאת, חולים הנזקקים בקש חניכה של טיפול בסרטן ומטופלים מראש המתבגר הם מושעים. אפשרויות אלה. לחלופין, בחרו חלק מהחולים cryopreserve רקמות השחלה לפני התחייבות משטר טיפולי שלהם, וגם על שחזור, רמיסיה, אוטומטי משתילים רקמה לשחזור פוריות3. ובכל זאת, עד כה, הישרדות השתל פלט הזקיקים בעקבות אוטומטי-השתלת עדיין נמוך יחסית4, בעיקר בשל רקמת איסכמיה, היפוקסיה5,6,7. למרות המאמצים הרבים כדי לשפר את הכדאיות של שתלי קורטיקלית השחלות באמצעות8,נוגדי חמצון9, pro-אנגיוגנזה ציטוקינים10,11,12,1 איסכמיה שתל 3או מניפולציות מכני14, ב- 5 עד 7 יום חלון שלאחר ההשתלה מערער את יכולת הקיום וההישרדות של שתל7. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו אסטרטגיה המבוססת על התא כדי להקל על השקה של המארח וספינות השתל ובכך לזרז פגיעה reperfusion רקמת השחלה.

בנוסף העלבון איסכמי המושתל רקמת השחלה בחלון שלאחר ההשתלה, שיבוש איתות בין הזקיקים עשוי לתרום דלדול של מאגר ה-15,16. כי תאי אנדותל אקסוגני (המנהלים) לתרום כלי יציב ופועל בפריפריה של השתל, הם מציגים הזדמנות ייחודית להעביר קלט מולקולרית מוגדר לרקמות המושתלים. מהווה הוכחה של עיקרון, המנהלים היו מתוכנן אקספרס סופר-פיזיולוגיים רמות של הורמון אנטי-mullerian מעורבת (AMH), חבר הפיכת superfamily בטא (TGFβ) גורם גידול זה הוכח להגבלת פוליקולרי17. השוואה של הזקיקים הזרעון השתלים מושתלים במשותף עם שליטה והתאים לבטא AMH מאמת את פעילות ביולוגית ואת העוצמה של המנהלים מהונדסים.

לסיכום, על ידי שיפור שתל הכדאיות ודיכוי גיוס מוקדמת של מאגר הזקיקים, גישה זו יכול להגדיל את הפרודוקטיביות של מושתלים אוטומטי רקמת השחלה בחולים שעברו שימור פוריות. יתר על כן, הפלטפורמה מבוססת ExEC מאפשרת חקירה ניסויית של ווסתי מולקולרית כי היו מעורבים בהתפתחות הזקיקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בכל ההליכים הכרוכים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) במכללה לרפואה וייל קורנל. כל הניסויים השתלת איברים מבעלי חיים באמצעות רקמות השחלה בוצעו בהתאם להנחיות הרלוונטיים ולתקנות. . מרקמות השחלה נאסף מחולים מתוכננת כימותרפיה או הקרנות לטיפול בסרטן או השתלת מח עצם מוקדמת. ועדת הבדיקה מוסדיים (IRB) ועדה של וייל קורנל גוויות אישרה את האוסף של רקמות לשימוש עצמיים פוטנציאל ובעת מדעת של החולה שתרומה של עד 10% רקמת השחלה שלהם לשימוש המחקר בוצע.

1. אוסף של השחלות רקמה אנושית

הערה: כאשר רקמות השחלה מועבר מן מעבר מתקן מרחוק, הזמן לא יעלה על 5 שעות18,19.

  1. לאסוף את רקמת השחלה ולשטוף עם פתרון סטרילי מלוחים.
  2. מקם את השחלה במיכל סטרילי.
  3. יוצקים L-15 בינוני של ליבוביץ עד השחלה הוא שקוע לגמרי המדיום.
  4. סגור, לסגור את המיכל.
  5. תחבורה המכולה על קרח.

2. עיבוד רקמת השחלה Procured, מ. שמידט et al. 18

  1. ההכנות לקראת הקפאה ועיבוד השחלות
    1. להתכונן 100 מ של מדיום עיבוד: L-15 בינונית 99 מ ל + 1 מ"ל פתרון של ליבוביץ אנטיביוטיקה-antimycotic. לסנן מדיה באמצעות 0.2 µm סינון. שמור את המדיום בקירור.
    2. הכן 100 מ של פתרון הקפאת שימוש דימתיל סולפוקסיד הקפאה-חדש. להוסיף של 69.64 mL ליבוביץ L-15 בינוני, 17.66 mL עוברי שור סרום (FBS), 3.42 גר' סוכרוז (כדי ליצור ריכוז סופי של 0.1 מול/ליטר), 10.65 mL דימתיל סולפוקסיד (כדי ליצור ריכוז סופי של 1.5 מול/ליטר), הפתרון אנטיביוטיקה-antimycotic 1 מ"ל. לסנן את המדיום באמצעות יחידת מסנן 150 מ"ל, 0.2 µm. חנות המדיום ב 4 º C.
    3. סטריליזציה של כלי ניתוח באמצעות החיטוי מתוכנת מחזור עיקור עטופה מוצקים.
  2. עם ההגעה של הרקמה
    1. להגדיר את כלי כירורגי סטרילי ארון אבטחה: מספריים סכין עם להב מספר 21, חד בסדר מעוקל ומלקחיים -מגוון גדלים: ארוך (כ- 150 מ מ אורך) ו- 2 בגודל בינוני (כ-110 מ מ אורך).
    2. ללבוש כפפות סטריליות, לפתוח למכולה בתוך ארון אבטחה. לקחת את השחלה, מניחים אותה 150 מ מ פטרי ויוצקים מדיום קר מוכן בשלב 2.1.1 על גבי השחלה כדי למנוע התייבשות של רקמת השחלה.
    3. לבודד את השחלה מרקמות כל שיורית ולשטוף אותו קר בינונית עד שזה חסר ברקמות ובדם.
    4. למקם את השחלה מ מ 150 נקי פטרי, להוסיף קור בינונית, מוכן בשלב 2.1.1 עד השחלה הוא חצי שקוע בה.
  3. דיסקציה של רקמת השחלה
    1. קטיעות השחלה ולהסיר לשד לראשונה על ידי חיתוך חדות, באמצעות מספריים בסדר מעוקל. ואז לגרד לשד, באמצעות אזמל סטרילי עם מספר להב 21. להקדים עד הרקמה קורטיקלית 1-1.5 מ מ עובי.
    2. חותכים את הרקמה קורטיקלית ניצוצות של 2-3 מ מ רוחב, אורך רצועת יהיה לכל אורכה של חתיכה השחלות, עובדה.

3. השחלה רקמות איטי הקפאה, Adapted של ניוטון ואח. ו. Oktay et al. 6 , 20

  1. לקראת הקפאה
    1. תווית cryovials (1.8 מ ל).
    2. להוסיף 1.5 מ של הפתרון מקפיא המבושלות צעד 2.1.2 כל מבחנה.
    3. העברת רצועה קורטיקלית אחת לכל קריוגני בקבוקון המכיל את הפתרון מקפיא.
    4. Equilibrate רצועת קורטיקלית במשך 20 דקות על צלחת מסתובבת, להחיל עצבנות עדין ב 4 º C.
  2. לאט הקפאת רקמת השחלה
    1. לטעון את cryovials לתוך מקפיא פלנר לתכנות החל מ- 0 מעלות צלזיוס.
    2. מגניב ב- 2 ° C/דקה ל-7 מעלות צלזיוס.
    3. לשמור על הרקמות בטמפרטורה קבועה זו במשך 10 דקות.
    4. לבצע זריעה ידנית עבור אינדוקציה התגרענות של גביש קרח, על-ידי נגיעה כל cryovial עם טיפ כותנה שקוע חנקן נוזלי (LN2).
    5. המשך להתקרר ב- 0.3 מעלות צלזיוס/דקה עד טמפרטורה מדגם מגיע ל-40 מעלות צלזיוס.
    6. מגניב בקצב מהיר יותר של 10 ° C/min ל-140 מעלות צלזיוס.
    7. להעביר cryovials דיואר עבור אחסון ב- LN2 (-196 מעלות צלזיוס).

4. ההכנות הניתוחים (Oophorectomy דו-צדדיים והשתלות משותף)

  1. הכנת לוחות
    1. יום לפני מפשיר את רקמת השחלה עבור השתלת
      1. מניחים חתיכת סרט פרפין פלסטיק בתחתית של 50 מ מ פטרי, תשפריץ עם 70% אתנול עד זה יכוסו לחלוטין.
      2. השאירו את צלחות פטרי בן לילה אבטחה בארון. להכין 2 צלחות פטרי לכל העכבר.
    2. ביום של ניתוחים
      1. האחות האתנול מ הפטרי המכיל הסרט פלסטיק פרפין בתוך ארון אבטחה.
      2. להשאיר את ההובלה פטרי חצי פתוחות עד אתנול מתאדה לחלוטין.
      3. סגור את מכסה הפטרי כאשר הסרט פלסטיק פרפין הוא יבש לחלוטין. להשאיר את זה בגדר אבטחה הקבינט.
      4. ובכן, בארות תווית של 6 צלחת בהתאם, 0.1 מול/ליטר סוכרוז + 1 מול/ליטר דימתיל סולפוקסיד, 0.1 מול/ליטר סוכרוז + 0.5 מול/ליטר דימתיל סולפוקסיד, 0.1 מול/ליטר סוכרוז, בסיסי מפשיר פתרון (BTS), בינוני.
  2. אופן ההכנה של פתרונות
    1. להכין 100 מ של מוזיקה עממית מודרנית: L-15 של ליבוביץ mL 79 בינוני + FBS 20 מ"ל + אנטיביוטיקה-Antimycotic פתרון 1 מ"ל. לסנן עם מערכת סינון 0.22 מיקרומטר.
    2. הכינו 10 מ"ל של מוזיקה עממית מודרנית עם 0.1 מול/ליטר סוכרוז. קנה מידה 0.342 גר' סוכרוז ולהוסיף 10 מ"ל של BTS מוכן בשלב 4.2.1, מתפרעים בעדינות עד התפרקה לחלוטין סוכרוז. לסנן את הפתרון באמצעות מיקרומטר מסנן 0.22 של המזרק.
    3. הכינו את הפתרונות לפי טבלה 1. מכסים צינורות המכיל דימתיל סולפוקסיד ברדיד אלומיניום. לשמור בקירור עד השימוש.

5. מפשיר מהירה רקמות השחלה

  1. להוציא LN2 דיואר בקבוקון המכיל קפוא רקמות השחלה ולשמור אותה בטמפרטורת החדר במשך 30 s.
  2. . תנקה את המבחנה בעזרת נייר טישו.
  3. לטבול את המבחנה באמבט מים של 30 מעלות צלזיוס למשך 1-2 דקות עד שלה ' מופשר הוא תוכן.
  4. לפתוח את הצנצנת ולמקם את רצועת קורטיקלית הבאר הראשונה המכילה 3 מ"ל של הפתרון הראשון (0.1 מול/ליטר סוכרוז + 1 מול/ליטר דימתיל סולפוקסיד, מוכן בשלב 4.2.3).
    הערה: כל השלבים הכרוכים בפתיחת המכסה של הצלחת ייעשה תחת זרימה שכבתית.
  5. דגירה את הצלחת היטב 6 על צלחת מסתובבת ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק לשמור הצלחת מכוסה ברדיד אלומיניום בשלב זה.
  6. להעביר את הרצועה בקליפת המוח השני טוב המכיל 3 מ של הפתרון השני (0.1 מול/ליטר סוכרוז + 0.5 מול/ליטר דימתיל סולפוקסיד, מוכן בשלב 4.2.3).
  7. דגירה את הצלחת היטב 6 על צלחת מסתובבת על עצבנות עדין ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק לשמור הצלחת מכוסה ברדיד אלומיניום בשלב זה.
  8. להעביר את הרצועה בקליפת המוח לתוך הבאר השלישית, המכיל 4 מ"ל של פתרון (BTS עם 0.1 מול/ליטר סוכרוז, מוכן בשלב 4.2.2).
  9. דגירה על צלחת מסתובבת על עצבנות עדין ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  10. להעביר את רצועת בקליפת המוח הרביעי טוב המכיל 4 מ של פתרון (BTS, מוכן בשלב 4.2.1).
  11. דגירה על צלחת מסתובבת על עצבנות עדין ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  12. להעביר רצועת קורטיקלית mL 4 טוב המכיל האחרון של מדיום קר (להכין בשלב 2.1.1). לשמור המופשרים רקמות השחלה על הקרח עד ביצוע של השתלת.

6. כימוס של רקמת השחלה

  1. להכין את הפתרונות הבאים
    1. להכין 25 מ של מאגר HEPES mmol/L 20 ב- saline 0.9%. לסנן ולאחסן ב 4 º C.
    2. להכין 1 מ"ל של CaCl2 -ריכוז 1 mol/ל' מסנן ולאחסן ב 4 º C.
  2. להכין פתרון מניות של 50 מ"ג/מ"ל פיברינוגן
    1. להוסיף 1 g של פיברינוגן לתוך 20 מ של מאגר HEPES mmol/L 20 ב- saline 0.9% על ידי ערבוב לאט פיברינוגן לתוך HEPES באגירה תמיסת מלח על פני מספר שעות ב 37 º C.
    2. תווית 1.7 mL צינורות מיקרו-צנטריפוגה.
    3. לסנן את הפתרון דרך מסנן מזרק מיקרומטר 0.45 ואז דרך פילטר מזרק 0.2 µm.
    4. Aliquot הפתרון לתוך µL 200 מיקרו-צנטריפוגה שפופרת ואת החנות ב-20 ° C.
  3. להכין פתרון מניות 100 תרומבין U/mL
    הערה: פתרונות תרומבין לספוח לזכוכית, aliquot את הפתרון ב צינורות פלסטיק/בקבוקונים.
    1. להוסיף 2.5 מ ל תמיסת סטרילית 0.9% 250 U של תרומבין.
    2. טלטול עדין עד לפתרון נמסים לחלוטין.
    3. תווית 1.7 mL צינורות מיקרו-צנטריפוגה.
    4. לסנן דרך מסנן מזרק 0.2 µm, aliquot 50 µL לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה, חנות ב-80 מעלות צלזיוס.
  4. להפוך את קריש פיברין של 70 µL, להשגת ריכוז סופי של 10 מ"ג/מ"ל פיברינוגן ו 5 תרומבין U/mL
    הערה: הקפד לעבוד מהר, הפתרון קרישי תוך מספר שניות. כמו כן, הימנע התוספת של בועות לתערובת.
    1. להכין פתרון פיברינוגן בשפופרת מיקרו-צנטריפוגה 1.7 מ.
      1. להוסיף 360 µL של 20 mmol/L HEPES מאגר ב- 0.9% תמיסת מלח כדי µL 200 aliquoted המניה פיברינוגן, מוכן בשלב 6.2.4.
      2. מערבבים על-ידי pipetting עדין.
      3. . לשמור את זה על קרח.
    2. להכין פתרון תרומבין בצינור השני מיקרו-צנטריפוגה.
      1. הוספת µL 148.7 של DMEM µL 50 aliquoted של המניה תרומבין, מוכן בשלב 6.3.4.
      2. מערבבים על-ידי pipetting עדין.
      3. הוסף µL 1.3 של 1 מול/ליטר CaCl2.
      4. מערבבים על-ידי pipetting עדין.
      5. . לשמור את זה על קרח.
    3. להכין השעיה תא בודד, בצינור השלישי מיקרו-צנטריפוגה.
      1. ניתוק תאי אנדותל מהונדסים מהצלחת באמצעות בינוני ניתוק התא של אנזים.
      2. ספין למטה ולספור את התאים באמצעות hemocytometer עם כיסוי זכוכית.
      3. להשתמש בתאים 20,000 עבור כל 1 מ2 של רקמת השחלה. חישוב שטח 20,000 x של רקמות השחלה מ מ2.
      4. ספין למטה תאי אנדותל מהונדסים, מחדש להשעות אותו במדיום בסיסי (DMEM) כדי להגיע הנפח הכולל של 16.8 µL.
      5. . לשמור את זה על קרח.
    4. מניחים חתיכת רקמת השחלה על ספוג גזה סטרילית לייבש את זה במשך כמה שניות.
    5. מניחים פיסת הרקמה השחלות על גבי הסרט פלסטיק פרפין בתוך 50 מ מ פטרי.
    6. הוסף µL 39.2 של הפתרון פיברינוגן, מוכן בשלב 6.4.1.2, לתוך התליה תא מוכן בשלב 6.4.3.4, מיקס על ידי עדין pipetting. . לשמור את זה על קרח.
    7. הוסף µL 14 של הפתרון תרומבין מוכן בשלב 6.4.2.4. מערבבים בעדינות על-ידי pipetting פעם. עובד מהר
    8. מניחים את התערובת על גבי רקמת השחלה, pipet אותו בדמות droplet מוארך.
    9. מניחים על צלחת פטרי עם קריש הדם בחממה ב 37 º C.

7. דו צדדיים Oophorectomy והשתלות שיתוף של רקמה אנושית השחלות עם תאי אנדותל מהונדסים NSG לעכברים

הערה: 10 עד 14 בת נקבה NSG עכברים21 שימשו (מעבדות ג'קסון).

  1. הכנת כלי כל ניתוח, כמו הארוטיות בשלב 2.1.3, ודא כי ברשותך כל בתפרים, רפידות, וגם קלטות כירורגי בהישג יד.
  2. עזים ומתנגד העכבר באמצעות מערכת הרדמה עם איזופלוריין.
    1. הנח את העכבר בבית הבליעה אינדוקציה, לסגור את המכסה ולפתוח את צימוד המתאים.
    2. זרימה פתוחה כדי 1000 מ ל לדקה להפעיל את מכשיר אידוי ולהגדיר אותו למסור 2-3.5%.
    3. לבחון את השפעת הרדמה; אובדן ההכרה, איטי, נשימות רגילות.
    4. להעביר חרוט האף כדי לשמור על הרדמה. הפעל את מכשיר אידוי כדי לספק 1-3%, בהתאם סימנים חיוניים.
    5. ודא היעדר רפלקס פדלים או זנב. אם רפלקס, להגדיל איזופלוריין עד שהוא נעדר.
  3. קיצוץ שיער גב של העכבר, לכיוון הזנב עד הקו הכסל, באמצעות טרימר שיער חשמלי.
  4. הנח את העכבר במצב של שכיבה על פלטפורמת כירורגי.
  5. לתקן את האף חרוט פלטפורמת כירורגי באמצעות קלטת כירורגי.
  6. להקליט את הגפיים של העכבר בעדינות לפלטפורמת כירורגי באמצעות קלטת 1.25 ס מ ברוחב נייר כירורגי.
  7. השתמש עם ריבה סיכה סטרילי והכנס מדחום PR. לתקן המדחום על ידי מקליטה אותה פלטפורמת כירורגי באמצעות קלטת כירורגי פלסטיק 1.25 ס מ מחורר.
  8. . טוב, קלטת הזנב פלטפורמת כירורגי באמצעות קלטת נייר רחב כירורגי 2.5 ס מ
  9. חום, באמצעות אינפרא או של מים חמים, חימום pad, ולפקח על טמפרטורת הגוף של העכבר לאורך כל ההליך. לשמור על טמפרטורת גוף בטווח של 35-37 מעלות צלזיוס.
  10. לנקות את האזור המקוצץ עם מקל אוזניים Povidone-יודיפלור תמיסה סטרילית ונגב באמצעות הכנה סטרילית אלכוהול.
  11. חזור על שלב 6.9 עוד פעמיים.
  12. הנח טיפה של משחה סטרילי הוטרינר סיכה עינית מעל כל אחת העיניים של העכבר כדי להגן מפני התייבשות, נזק בקרנית.
  13. מכסים את העכבר באמצעות תלוי כירורגי סטרילי.
  14. להזריק הבופרנורפין (1 מ ג/ק ג) תת עורית (S/C).
  15. לבצע חתך אורכי הגבי המדיאלי באמצעות אזמל (להב #21).
  16. לבצע oophorectomy דו צדדיים, להשתמש בגישה הגבי.
    1. חינם רקמת חיבור תת עורי ע י ניתוח עמום באמצעות המספריים.
    2. לצבוט fascia רוחבית לעשות קו האמצע חתך ולהגיע חלל הצפק באמצעות מספריים חדות.
    3. קחו כרית השומן השחלות ו השחלה בעדינות עם פינצטה, להוציא אותו מתוך חלל הבטן.
    4. לאחוז את השחלה, כרית השומן של מלקחיים לכלי הדם.
    5. מאתרים ומפסיקים את השחלה, כרית השומן באמצעות monofilament 4/0 בתפר שנספג בבסיס של השחלה, דיסטלי אל החצוצרה.
    6. קליפ השחלה דיסטלי השולטת. ודא כי אין דימום מבסיס של הגדם.
    7. מקם את הרקמה בחזרה לתוך חלל הבטן, תפר fascia באמצעות 6/0 בתפר שנספג קלועה.
    8. חזור על שלבים 7.15.1-7.15.7 על הצד contralateral.
  17. השתלות במשותף את רקמת השחלה.
    1. ביצוע חתך אופקי fascia מעל העכוז, ב אורך שמתאים הממדים קרישי דם. יצירת כיס בתוך סביבה וירטואלית זו על-ידי פתיחת את המספריים מתחת fascia.
    2. להרים חתיכה אחת של רקמות קורטיקלית שעברו אנקפסולציה, מוכן בשלב 6.4.8 ולמקם אותו בכיס.
    3. תפר fascia באמצעות 6/0 קלוע תפר שנספג.
  18. חזור על שלבים 7.16.1-7.16.3 בצד contralateral גם כן.
  19. סגור את הקיר הגבי באמצעות תפרים קטע פשוט monofilament 4/0 בתפר שנספג.
  20. להזריק לידוקאין 0.5% (1.2 מ"ל/ק"ג) S/C-החתך.
  21. השתמש הכנה סטרילית אלכוהול כדי לנקות את העור.
  22. לבטל את איזופלוריין תוך ניטור הטמפרטורה של העכבר.
  23. לספק 1-2 דקות של O2, בלי איזופלוריין. לשמור על התחממות העכבר עד שהוא מתחיל לעבור ולחזור להכרה.
  24. למקם את העכבר בתוך כלוב ההתאוששות נקי, מאוחר יותר הבית העכבר בכלוב נפרד עד ריפוי מלא של הפצע כירורגי.
  25. להזריק הבופרנורפין (1 מ"ג/ק"ג) S/C לצורך כל 8-12 שעות, 24 שעות ביממה במשככי.
  26. מחזיקים העכברים בתוך כלובים נפרדים כאשר כל מזון, מים, מצעים, כלובים הם בלוק, עד נקודת הסיום של הניסוי. שמור את הכלובים בחדר מאוורר בלחץ. השתמש ציוד מגן אישי בכל פעם טיפול העכברים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כדי לקבוע אם השתלת שיתוף של המנהלים מספק לתועלת רקמות המטופלים, המופשרים רצועות קורטיקלית השחלות היו מחולקים לחתיכות בגודל שווה, engrafted דו צדדיים לתוך פגועה, הנהון scid גמא (NSG), עכברים. בצד השני מוטבע clot פיברין לבד (לא ECs), את המנהלים המכיל אחרים (איור 1 א'), כל עכבר שימש את שליטתה. המנהלים התקבלו באמצעות בידוד של אנדותל העיקרי של חוטי חבל הטבור אנושי וטיפול הבאים עם ג'ין Adenoviral פרגמנט E4-ORF1, כפי שתואר לעיל22,23. בתוך פסוקים 2-5, הוא יפתור ECs (hUVEC) טופלו חלקיקים lentiviral לקודד cDNA ביטוי מכוננת קידוד השבר ג'ין adenoviral E4-ORF1. טיפול זה משפר את ההישרדות ותיאר הפוטנציאל אנגיוגנזה של אנדותל כאמור22,23. אחרי שבועיים, כלי פונקציונלי perfused נוצרו מתוך GFP שכותרתו המנהלים על הממשק של רקמת מארח את השתל (איור 1b). על מנת תווית כלי הדם פונקציונלי, עכברים הוזרקו לקטין 100 מ ל (0.5 mg/mL) בהרדמה איזופלוריין 10 דקות לפני הקטיף הרקמה. כימות של זקיקים ב 2 שבועות ההשתלה הבאים הדגימו יתרון משמעותי זקיק יחסית בחשבון שתלים בסיוע המנהלים היה בבירור שבועיים (איור 1 c). ECs אקסוגני שנוצר כלי פונקציונלי כאשר המושתלים במשותף עם רקמות השחלה (איור 1b), חלקים קורטיקליים מושתלים במשותף עם העכבר או אדם המנהלים הגדילה את מספר זקיקים ששרד ביחס שתלי שליטה (c איור 1 ). הטבה זו היה קשור אזור שהותירה ירד בשתלים בסיוע המנהלים (איור 1 d) — מ כל השתל מהתורם, היו 3 סעיפים מוכתמים Trichrome, הוקמה כאמצעי בהתוויית רקמות שהותירה24, להעריך אזור שהותירה: מקטע האמצעי, חתך עומק מיקרומטר 600 מן הצד העליון והתחתון של השתל. סעיפים מוכתמים נסרקו ו נותחה באמצעות ImageJ לכמת את פני השטח ואת האזור שהותירה היה באופן ידני המתוארים לכמת כאחוז של אזור השתל כולו (תוכנת ImageJ). הערכים הסופיים חושבו עבור כל שתל כממוצע של הסעיפים 3 מנותח. חשוב, שתלי שהיו המושתלים במשותף עם העורלה האנושי fibroblasts הראה רקמות המסכן הכדאיות זקיקים מעטים יחסית. (איור 1e).

אנחנו הבא העריכו את הפונקציה לטווח ארוך של שתלי רקמות השחלה עם ובלי המנהלים (איור 2 אd, f, h). בעקבות 14 שבועות, עכברים היו מגורה מדי יום עם מנוטרופין לפרקי זמן לפני חיות הוקרבו, עם ההתקדמות של זקיק צמיחה במעקב אצל שני עכברים באמצעות MRI (איור 2b-c) משתנה. זקיקים המתפתח נרשמו שליטה (איור 2e) והן בסיוע המנהלים שתלי (איור 2 g, אני). זקיקים בגודל יותר, גדול יותר היו הבחין ב השתלים בסיוע המנהלים (איור 2 g, אני). . בהשוואה antral זקיקים נגזר של המטופל באותה הרקמה, מגורה עם מנוטרופין, מושתלים במשותף עם המנהלים, granulosa תא השכבה בתוך זקיק מתקדמים יותר מוצגים ביטוי מוגבר של סמנים ovulatory CD4425 ו HABP126, כמו עלה מות תאים (קספאז), עם צמצום התפשטות (Ki67) (דמות 2j).

מספר מחקרים הראו כי הבריכה של זקיקי שיער בטרם עת מופעלת בעקבות שתל של רקמות השחלה27,28,29,30. הבחנו מגמה דומה שתלי מרובים מחולה בודד 2, 3 ו 14 שבועות (איור 3 א). לנצל את הפונקציה המשוער של AMH, מדחיקה הפעלה ו/או צמיחת זקיקי17,31, אנחנו מהונדסים המנהלים עם lentivirus צורונים אקספרס, ובכך מספקים מקור ישיר paracrine מפרישים AMH כדי רקמות השחלה המושתלים (איור 3b). התמרה חושית lentiviral גדל 100-fold GC לעיל ב ExEC אשר אחרת הביע כמויות בלתי מורגשת של AMH. Granulosa תאים תאים סרטניים, מצד שני, מופרש רמה הבזליים של AMH בתרבות תא supernatant. (איור 3 c). שבועיים לאחר ההשתלה שיתוף, כלי נגזר המנהלים נצפו על הממשק מארח-שתל, immunostaining חשף חלבון בשפע AMH לומן של כלי נגזר AMH-המנהלים (איור 3d) ביחס כלי נוצר שליטה המנהלים. על מנת לבדוק את הפונקציה של AMH בנפרד מיתר השפעת pro-אנגיוגנזה של המנהלים, השתמשנו בתאי גזע mesenchymal (MSC) כי הם בודדו אותנו מהמתרחש שברי לשד השחלות. תאים אלה היו transduced עם חלקיקים lentiviral קידוד AMH והתרחבה בתרבות לשימוש בהשתלת משותף. על השתלת שיתוף עם AMH-המנהלים, נצפתה עלייה 2-fold בפרופורציה של זקיקים הקדמוני. זה, עם זאת, מוביל לירידה האחוז של זקיקי שיער ראשי. AMH-MSCs להוביל שמירה מוגברת של זקיקים הקדמוני מאת יחסית 10-fold שליטה MSCs (איור 3f, h). היתרון המשמעותי ביותר השמירה של הבריכה הזקיקים השבתה הדרגתית הוענקה על ידי AMH-ECs כאשר נעשתה השוואה בין MSCs, המנהלים-סלולר שתלי (Ctl), AMH-MSCs ExEC, AMH-המנהלים (איור 3עכשיו).

Figure 1
איור 1: השתלת שיתוף של השחלות רצועות קורטיקלית עם המנהלים משפר את הכדאיות של משמרת הבריכה הזקיקים. (א) ערכה של הנבחנים. קפוא-הקרת רקמות השחלה האנושי היה במארז קריש פיברין, עם או בלי המנהלים. . הקרישים היו מושתלים לתוך oophorectomized NSG עכברים, נקצרו את נקודת הקצה של הניסוי. שתלי בקליפת המוח האנושי (b) , מושתלים בשיתוף עם hUVEC, נגזר המנהלים (ירוק); כדוריות דם אדומות מסומנות על ידי טר-119, גבולות השתל יוקפו בקו לבן. (ג) האחוז החציוני של זקיקי הכולל השתלת עם ובלי על העכבר או המנהלים אנושי + כועס * P < 0.05. (ד) האחוז החציוני של האזור שהותירה של השתלת עם ובלי העכבר או אדם המנהלים + כועס * * P < 0.001. (ה) סעיפים נציג שתלי השחלות מושתלים במשותף עם המנהלים, ללא תאים, ועם fibroblasts העורלה אנושי. דמות זו שונתה מן האיש. et al. נציג Sci 2017 Aug 15; 7 (1): 8203. דוי: 10.1038/s41598-017-08491-z. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: הכדאיות לטווח הארוך והתפקוד של רקמות השחלה שתלי הם שיפור המנהלים. ב דמויות b, c, d, f ו- h השתלים בצד השמאל הם ECs שליטה-. לא, ואילו בצד ימין השתלים מושתלים במשותף עם המנהלים. (א) ערכת ניסיוני עבור xenograft לטווח ארוך של רקמת השחלה קורטיקלית. (b) דמויות b ו- c, הכוכבית (צד ימין) מייצג את רקמות השחלה משותפת מושתלים עם ECs, בעוד ראש החץ (בצד שמאל) מייצג את רקמת השחלה מושתלים עם אין תאים. העכבר #1 היה xenografted עם רקמת מתורם בן 6 ו במעקב על ידי MRI-תחילתה של גירוי (14 שבועות, שמאלה), שוב לאחר עשרה ימים של גירוי (15.5 שבועות, נכון). (ג) העכבר #3 היה xenografted עם רקמת מתורם בן 19 ו בפיקוח MRI-6 (פוסט-השתלת 20 שבועות), 7 (21 w), ו- 8 (22 w) שבועות לאחר תחילת גירוי. (ד) התמונה מאקרוסקופית של רקמת השחלה האנושי engrafted נקצרו 15.5 שבועות העכבר #1, השתל בצד ימין השתל בסיוע ExEC, נוף היסטולוגית של השתל הפקד מוצג (e). דימוי מאקרוסקופית (נ) השתלים, העכבר #2 הוקרב לאחר 20 שבועות, שתלים בסיוע exEC ובקרה נבצרו לבדיקה היסטולוגית; השתל בסיוע ExEC מוצג (g). (h) התמונה מאקרוסקופית שתלי עכבר #3 אשר הוקרב לאחר השבוע ה-22, ניתוח היסטולוגית של השתל בסיוע ExEC מוצג (i). (j) סעיפים שתלי בסיוע ExEC מן העכבר #2 ו- 3 # העכבר היה מוכתם סמנים מולקולריים ו מוגדלות בתיבת המשויך. גודל ברים = 100 מיקרומטר. דמות זו שונתה מן האיש. et al. נציג Sci 2017 Aug 15; 7 (1): 8203. דוי: 10.1038/s41598-017-08491-z. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: המנהלים מהונדסים לבטא AMH לשמר בריכה הזקיקים השבתה הדרגתית. (א) הפרופורציה של זקיקים היה לכמת על שברי רקמת השחלה מרובים מן המטופל באותו שהיו המושתלים בשיתוף עם ה-ECs עבור מרווחים לטווח קצר וארוך; n = 3-2 שבועות, n = 4-3 שבועות ו- n = 2-14 שבועות. (b) ערכה של הנבחנים. קפוא-הקרת רקמות השחלה האנושי היה אנקפסולציה בתוך קריש פיברין, עם המנהלים/MSCs transduced עם חלקיקים lentiviral RFP הגשה פקד או המנהלים/MSCs transduced עם חלקיקים lentiviral AMH-mCherry הפקת AMH-ECs/MSCs. . הקרישים היו מושתלים לתוך oophorectomized NSG עכברים, נקצרו 2 שבועות. (ג) המנהלים היו transduced עם lentivirus קידוד המופרש AMH האנושי; תא תרבות תגובת שיקוע של המנהלים AMH transduced היה לעומת זה-434 תרבות granulosa תא הגידול קו ושליטה המנהלים. (ד) עוד שבועיים לאחר השתלת רקמות השחלה קטעים זה הושתלו במשותף עם גם ECs (משמאל) או AMH-המנהלים (מימין) היו מוכתמים של נוגדנים ספציפיים AMH החלבונים. (ה) חלקם היחסי של זקיקי xenografts מושתלים במשותף עם AMH-אתה תעשה ובקרה היה לכמת לאחר 2 שבועות (n = 6). (נ) חלקם היחסי של זקיקי xenografts מושתלים במשותף עם AMH-MSCs ובקרה היה לכמת לאחר 2 שבועות (n = 6). (ז) חציון + MAD של חלקם היחסי של זקיקי נמשל ב xenografts מושתלים עם המנהלים AMH transduced ובקרה (n = 6) בעקבות 2 שבועות. (h) חלקם היחסי החציוני + כועסת של זקיקי נמשל ב xenografts מושתלים עם AMH-transduced MSCs ובקרה (n = 6) בעקבות 2 שבועות. (i) החציוני האחוז של זקיקי הקדמוני שנצפה לכל שתל ב xenografts מושתלים עם MSCs (n = 6), המנהלים (n = 6), AMH-MSCs (n = 6), ו- AMH-המנהלים (n = 6) נמשל במצטבר לתנאי בקרה (אין תאים, n = 15). כניסות ב (ד) מוגדלות בתיבות מימין AMH-המנהלים, ל שמא עבור רשימת האישורים האמינים המנהלים; קווים קו אדום וכחול (d) חלוקה לרמות רקמות רקמות ומנחה השחלה, בהתאמה. קווי שגיאה ב (ג) לייצג סטיית תקן בין 3 משכפל. שגיאה הברים (a, g-i) מייצגים MAD בין מספר משכפל מפורט או בגרף. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר (d). * P < 0.05, * * P < 0.005. דמות זו שונתה מן האיש. et al. נציג Sci 2017 Aug 15; 7 (1): 8203. דוי: 10.1038/s41598-017-08491-z. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

פתרון סוכרוז-BTS (להכין בשלב 4.2.2) בμl דימתיל סולפוקסיד בμl
סוכרוז-BTS עם 1 מול/ליטר דימתיל סולפוקסיד 2787 213
סוכרוז-BTS עם 0.5 מול/ליטר דימתיל סולפוקסיד 2894 106

טבלה 1: סוכרוז פתרון הכנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כאן אנחנו מוכיחים את השתלת שיתוף של המנהלים מספק יתרון משמעותי רקמות השחלה הכדאיות ותפקוד בעקבות xenograft בעכברים. תקנים עבור יישומים קליניים של רקמות השחלה אוטומטית-השתלת לשימור פוריות לא היה סט של פרמטרים אופטימליים (גודל, השתלת באתר, משך הזמן של השתל, וכו '.) 32 , 33 , 34 עבור שחזור משופר של מאגר הזקיקים נשאר לא מוגדר. כאשר auto-השתלת מבוצע, avascular הארכת רקמות השחלה קורטיקלית המופשרים מתבצע בעיקר באתרים האגן כגון השחלה הנותרת, פוסה השחלות או רצועה רחבה35,36. מאז ההשקה end-to-end לא מתקיים, שיטה זו השתלת תוצאות גל של איבוד רקמות איסכמי והפעלה מוקדמת של זקיקי השוכנים השתל. לכן, בזמן השתלת שיתוף עם המנהלים כרוך משלוח של תאי אנדותל proliferative הדורשים בחינה נוספת הרבה לפני להיות בהתחשב עבור יישום קליני, גישה זו יכול לזרז את רקמת revascularization, עשוי להציל פרופורציה חזקים של זקיקים בתוך השתלים השחלות.

ממצאים אלה מעלים הרומן וסקולרית מבוססת-תא אסטרטגיה לאופטימיזציה בעקבות השתלת רקמות השחלה הכדאיות ותפקוד. בהתחשב הבריכה הגוברת של המטופלים בוחרים כדי cryopreserve רקמות השחלה, שיחות אחרונות עבור השתלת רקמות השחלה כדי לעבור ממצב ניסיוני לפתוח יישום קליני37,38, שיטה זו עשוי להציע טיפולית אסטרטגיה המאפשרת הכדאיות גדולה יותר של שתלים, ובכך להפחית את מספר רצועות קורטיקלית השחלות, זה חייב להיות מושתלים והגדלת תוחלת החיים שלהם ו/או פונקציה.

גיוס מוקדם מדי, או "שחיקה", יש גם קשור דלדול של הבריכה הזקיקים במהלך כימותרפיה39, וכן השתלת הבאים אוטומטי של רקמות השחלה34. מחקרים רבים זיהו איתות המסלולים שהפונקציה להפעלת לדיכוי גיוס הזקיקים, שיבוש שפונקציית הרגולציה יכול לגרום הפעלה של המוני של מאגר הזקיקים במהלך חלון איסכמי קריטי כאשר לצרכים מטבוליים של זקיקים nascent אינם יכולים להתקיים. יישום של המנהלים בהקשר זה לא רק להאיץ פגיעה reperfusion אך עקב שלהם engraftment פוטנציאליים, המנהלים גם ניתן לתכנן לספק אספקה ישירה paracrine של גורמים זה גיוס הזקיקים ישירה. הרעיון של ניצול AMH כמו אפנן צמיחת זקיקים הוחל על ידי קבוצות אחרות גם כן. קיינו. et al. AMH מועברות דרך גם משאבות osmotic המכילים חלבון רקומביננטי או הזרקת ה-IP של נגיפים40. גישות אלה גרמו מגמה דומה השמירה של זקיקי הקדמוני, אבל המסירה היתה מערכתית. כחלופה, המנהלים מפריש AMH לספק מקור מקומי ומתמשכת של AMH, עם זאת, שילוב של תאים מהונדסים וסקולרית רקמות השחלה שתלי מוגבל על ידי הרבות סיכונים הקשורים טיפולים מבוססי תאים. התגובה החיסונית אנטיגנים זרים על המנהלים הינה אפשרית, השימוש תאים proliferative מעלה את האפשרות של תאים במחזור, השתלת וטיפוח צמיחה אמצעים במקומות אחרים בגוף. למרות מגבלות אלה למנוע תרגום של גישה זו עבור הנוכחי חולים שעברו השתלת אוטומטי, ניסויים אלה לבסס את פוטנציאל pro-אנגיוגנזה השפעות ודיכוי גיוס הזקיקים מוקדמת להגדיל הפלט של רקמות השחלה שתלי ולבסס מודל xenograft חזקים לצורך המחקר מכניסטית של פיזיולוגיה אנושית. השחלות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

מיכאל גינסבורג הוא עובד של Angiocrine החיים, inc., סן דייגו, CA, 92130, ארצות הברית, מבודד, transfected עם E4-ORF-1, שכותרתו תאי אנדותל השתמשנו.

Acknowledgments

עומר אדם אלכסנדר על האיורים.
ל. מ נתמכה על ידי פרס טייס מן במישור הקליני של קורנל, מרכז מדעים Translational ו- ASRM של מלגת מחקר.
המחברים רוצה להודות ג'יימס חברי המעבדה לקריאה ביקורתית של כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leibovitz’s L-15 medium Gibco 11415064
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240062 Anti-Anti X100
Sucrose Sigma S 1888
Fibrinogen Sigma F 8630 from bovine plasma
Thrombin Sigma T 1063 from human plasma
DMSO Sigma D 2650
DMEM Gibco 12491015
Enzyme Cell Detachment Medium Invitrogen 00-4555-56 Accutase
Plastic paraffin film Bemis NA Parafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm 3M 1530-1 Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm 3M 1530-0 Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm 3M 1527-0 Transpore
Monofilament Absorbable Suture Covidien UM-203 Biosyn
Braided Absorbable Suture Covidien GL-889 Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10% Purdue Products 67618-153-01 Betadine Solution Swab Stick
Cryoviales Nunc 377267 CryoTube
sterile ocular lubricant Dechra 17033-211-38 Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tube Denville C-2172 Eppendorf
Anasthesia system VetEquip V-1 table top system with scavenging
Endothelial cells Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA Isolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stain Sigma HT15-1kt Trichrome Stain (Masson) Kit
Isolectin Invitrogen I32450 isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67, (1), 7-30 (2017).
  2. Magelssen, H., Melve, K. K., Skjaerven, R., Fossa, S. D. Parenthood probability and pregnancy outcome in patients with a cancer diagnosis during adolescence and young adulthood. Hum Reprod. 23, (1), 178-186 (2008).
  3. Donnez, J., Dolmans, M. M., Diaz, C., Pellicer, A. Ovarian cortex transplantation: time to move on from experimental studies to open clinical application. Fertil Steril. 104, (5), 1097-1098 (2015).
  4. Stoop, D., Cobo, A., Silber, S. Fertility preservation for age-related fertility decline. Lancet. 384, (9950), 1311-1319 (2014).
  5. Aubard, Y., et al. Orthotopic and heterotopic autografts of frozen-thawed ovarian cortex in sheep. Hum Reprod. 14, (8), 2149-2154 (1999).
  6. Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Hum Reprod. 11, (7), 1487-1491 (1996).
  7. Van Eyck, A. S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertil Steril. 92, (1), 374-381 (2009).
  8. Nugent, D., Newton, H., Gallivan, L., Gosden, R. G. Protective effect of vitamin E on ischaemia-reperfusion injury in ovarian grafts. J Reprod Fertil. 114, (2), 341-346 (1998).
  9. Kim, S. S., et al. Quantitative assessment of ischemic tissue damage in ovarian cortical tissue with or without antioxidant (ascorbic acid) treatment. Fertil Steril. 82, (3), 679-685 (2004).
  10. Abir, R., et al. Improving posttransplantation survival of human ovarian tissue by treating the host and graft. Fertil Steril. 95, (4), 1205-1210 (2011).
  11. Friedman, O., et al. Possible improvements in human ovarian grafting by various host and graft treatments. Hum Reprod. 27, (2), 474-482 (2012).
  12. Shikanov, A., et al. Fibrin encapsulation and vascular endothelial growth factor delivery promotes ovarian graft survival in mice. Tissue Eng Part A. 17, (23-24), 3095-3104 (2011).
  13. Soleimani, R., Heytens, E., Oktay, K. Enhancement of neoangiogenesis and follicle survival by sphingosine-1-phosphate in human ovarian tissue xenotransplants. PLoS One. 6, (4), e19475 (2011).
  14. Israely, T., Dafni, H., Nevo, N., Tsafriri, A., Neeman, M. Angiogenesis in ectopic ovarian xenotransplantation: multiparameter characterization of the neovasculature by dynamic contrast-enhanced MRI. Magn Reson Med. 52, (4), 741-750 (2004).
  15. Buratini, J., Price, C. A. Follicular somatic cell factors and follicle development. Reprod Fertil Dev. 23, (1), 32-39 (2011).
  16. Dunlop, C. E., Anderson, R. A. The regulation and assessment of follicular growth. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 244, discussion 17 13-17 (2014).
  17. Durlinger, A. L., et al. Control of primordial follicle recruitment by anti-Müllerian hormone in the mouse ovary. Endocrinology. 140, (12), 5789-5796 (1999).
  18. Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Hum Reprod. 18, (12), 2654-2659 (2003).
  19. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Hum Reprod. 30, (12), 2838-2845 (2015).
  20. Oktay, K., Newton, H., Aubard, Y., Salha, O., Gosden, R. G. Cryopreservation of immature human oocytes and ovarian tissue: an emerging technology? Fertil Steril. 69, (1), 1-7 (1998).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol. 174, (10), 6477-6489 (2005).
  22. Ramalingam, R., Rafii, S., Worgall, S., Brough, D. E., Crystal, R. G. E1(-)E4(+) adenoviral gene transfer vectors function as a "pro-life" signal to promote survival of primary human endothelial cells. Blood. 93, (9), 2936-2944 (1999).
  23. Seandel, M., et al. Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (49), 19288-19293 (2008).
  24. Meirow, D., et al. Cortical fibrosis and blood-vessels damage in human ovaries exposed to chemotherapy. Potential mechanisms of ovarian injury. Hum Reprod. 22, (6), 1626-1633 (2007).
  25. Assidi, M., et al. Identification of potential markers of oocyte competence expressed in bovine cumulus cells matured with follicle-stimulating hormone and/or phorbol myristate acetate in vitro. Biol Reprod. 79, (2), 209-222 (2008).
  26. Thakur, S. C., Datta, K. Higher expression of hyaluronan binding protein 1 (HABP1/p32/gC1qR/SF2) during follicular development and cumulus oocyte complex maturation in rat. Mol Reprod Dev. 75, (3), 429-438 (2008).
  27. Dolmans, M. M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134, (2), 253-262 (2007).
  28. Amorim, C. A., et al. Impact of freezing and thawing of human ovarian tissue on follicular growth after long-term xenotransplantation. J Assist Reprod Genet. 28, (12), 1157-1165 (2011).
  29. Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (43), 17474-17479 (2013).
  30. Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Hum Reprod. 30, (3), 608-615 (2015).
  31. Campbell, B. K., Clinton, M., Webb, R. The role of anti-Müllerian hormone (AMH) during follicle development in a monovulatory species (sheep). Endocrinology. 153, (9), 4533-4543 (2012).
  32. Donnez, J., et al. Restoration of ovarian activity and pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue: a review of 60 cases of reimplantation. Fertil Steril. 99, (6), 1503-1513 (2013).
  33. Ferreira, M., et al. The effects of sample size on the outcome of ovarian tissue cryopreservation. Reprod Domest Anim. 45, (1), 99-102 (2010).
  34. Gavish, Z., Peer, G., Roness, H., Cohen, Y., Meirow, D. Follicle activation and 'burn-out' contribute to post-transplantation follicle loss in ovarian tissue grafts: the effect of graft thickness. Hum Reprod. 30, (4), 1003 (2015).
  35. Donnez, J., Dolmans, M. M. Fertility Preservation in Women. N Engl J Med. 377, (17), 1657-1665 (2017).
  36. Salama, M., Woodruff, T. K. New advances in ovarian autotransplantation to restore fertility in cancer patients. Cancer Metastasis Rev. 34, (4), 807-822 (2015).
  37. Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian cortex transplantation: 60 reported live births brings the success and worldwide expansion of the technique towards routine clinical practice. J Assist Reprod Genet. 32, (8), 1167-1170 (2015).
  38. Meirow, D., et al. Transplantations of frozen-thawed ovarian tissue demonstrate high reproductive performance and the need to revise restrictive criteria. Fertil Steril. 106, (2), 467-474 (2016).
  39. Kalich-Philosoph, L., et al. Cyclophosphamide triggers follicle activation and "burnout"; AS101 prevents follicle loss and preserves fertility. Sci Transl Med. 5, (185), 185ra162 (2013).
  40. Kano, M., et al. AMH/MIS as a contraceptive that protects the ovarian reserve during chemotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, (9), E1688-E1697 (2017).
שיתוף השתלת רקמת השחלה האנושי עם תאי אנדותל מהונדסים: שילוב אסטרטגיה מבוסס תא מואצת זלוף עם מסירה ישירה Paracrine
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).More

Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter