Summary
Her, vi beskriver metoder til at udføre ChIP-FF. og CARIP-FF., herunder bibliotek forberedelse til næste generation sequencing, til at skabe global epigenomiske og kromatin-associerede RNA kort i ES-celler.
Abstract
Embryonale stamceller (ES) celle selvfornyelse og differentiering er underlagt udefrakommende signaler og iboende netværk af transkriptionsfaktorer, epigenetiske regulatorer og efter oversættelse ændringer af histoner, combinatorially indflydelse på genet udtrykket tilstand af nærliggende gener. RNA har også vist sig at interagere med forskellige proteiner til at regulere kromatin dynamics og genekspression. Kromatin-associerede RNA immunoprecipitation (CARIP) efterfulgt af næste generation sequencing (CARIP-FF.) er en roman metode til undersøgelse RNA'er tilknyttet kromatin proteiner, mens kromatin immunoprecipitation efterfulgt af næste generation sequencing ( ChIP-Seq) er en kraftfuld genomforskning teknik til at kortlægge placeringen af posttranslationel modifikation af histoner, transkriptionsfaktorer og epigenetiske modifikatorer på et globalt i ES-celler. Her, beskriver vi metoder til at udføre CARIP-FF. og ChIP-FF., herunder bibliotek opbygning til næste generation sequencing, for at skabe globale kromatin-associerede RNA og epigenomiske kort i ES-celler.
Introduction
Embryonale stamceller (ES) celle skæbne beslutninger er reguleret af kommunikation mellem ekstracellulære signaler og et væld af transcriptional-regulatorer, herunder Histon modifikatorer, og efter oversættelse ændring af Histon haler. Disse interaktioner lette kromatin tilgængelighed og emballering af kromatin i en af to tilstande: euchromatin, som er åben og transcriptionally aktive, og heterochromatin, som er kompakt og generelt transcriptionally inaktive. Transkriptionsfaktorer med DNA sekvens-specifikke bindende tilhørsforhold og epigenetiske modifikatorer associeret med euchromatic regioner til at deltage i kontrol af genekspression. Næste generations sekventering metoder, herunder ChIP-Seq1, har været medvirkende til kortlægning genome-wide transcriptional netværk, der er grundlæggende for ES celle selvfornyelse og pluripotency2,3,4 ,5,6. Desuden, mens RNA immunopreciation efterfulgt af næste generation sequencing (RIP-Seq)7 evalueringer af RNA-protein interaktioner tyder på, at DNA-bindende proteiner interagere med RNA'er at regulere transcriptional begivenheder7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, få studier har undersøgt genome-wide lokalisering af RNA'er tilknyttet kromatin12eller globale interaktioner mellem RNA og Histon ændringer. Længe ikke-kodende RNA'er (lncRNAs) er en klasse af RNA'er, som er blevet fundet for at regulerer aktiviteten af kromatin-associerede proteiner13,14,15. For eksempel, er Xist en lncRNA, der regulerer, i kvindelige pattedyrceller, inaktivering af et X-kromosom, gennem ansættelse af epigenetiske repressors16,17. Men det fulde spektrum af RNA'er tilknyttet kromatin er stort set ukendt. Her, beskriver vi en roman protokol, kromatin-associerede RNA immunoprecipitation (CARIP) efterfulgt af næste generation sequencing (CARIP-FF.), at identificere kromatin-associerede RNA'er på basis genome-wide i ES-celler, herunder bibliotek forberedelse til næste generation sequencing, og ChIP-Seq at kortlægge globale belægning af Histon ændringer, transkriptionsfaktorer og epigenetiske modifikatorer. I modsætning til andre RIP-Seq metoder7omfatter CARIP-Seq crosslinking og ultralydbehandling trin, som giver mulighed for direkte identifikation af RNA'er tilknyttet kromatin. Sammen, ChIP-Seq er et kraftfuldt værktøj til at identificere genome-wide protein-DNA interaktion, mens CARIP-Seq er en kraftfuld metode til at kortlægge RNA'er tilknyttet kromatin komponenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kultur af musen ES-celler i Feeder-fri betingelser.
Bemærk: Mus ES celler er konventionelt kulturperler i medierne på en celle kultur fad belagt med gelatine og et mono-lag af musen embryonale fibroblaster (MEF), der har været mitotically inaktiverede (iMEFs). MEFs skal dog fjernes inden downstream epigenetiske eller udtryk analyser at forhindre forurening af MEF-associerede kromatin og RNA.
- Forberedelse af en feeder lag: gelatine coat en 6-godt celle kultur plade ved tilsætning 2 mL af 0,1% gelatine i vandet, og der inkuberes plade ved 37 ° C i 20-30 min.
- Forberede 10% DMEM high-glucose medier indeholdende 2 mM L-glutamin, 10% føtal bovint serum (FBS) og 1 x penicillin/streptomycin.
- Isolere MEFs fra E13.5 til E14.5 mus18,19 eller erhverve fra en kommerciel leverandør. Mitotically Deaktiver MEFs ved at behandle med mitomycin C eller gammastråling ved hjælp af standardprotokoller19. Alternativt, mitotically inaktiverede MEFs (iMEFs) kan erhverves fra en kommerciel leverandør.
- Dyrkning af MEFs. Pre varm MEF medier ved 37 ° C, optø frosne hætteglas med iMEFs og kultur i 10% FBS MEF medier ved 37 ° C med 5% CO2. Plade MEFs på ~ 200.000 celler pr. brønd af et 6-godt kultur parabol.
- Dyrkning af ES-celler på et lag af feeder celler (iMEFs).
- 12-24 timer efter plating iMEFs, pre varme en 50 mL tube ES celle media (DMEM high-glucose, LIF (10 ng/mL), 15% ES celle-kvalificeret FBS, 1 × cellekultur kvalificeret 2-mercaptoethanol, 1 × glutamin, uvæsentlige aminosyrer (NEAA), 1 × penicillin/streptomycin), ved 37 ° C med 5% CO2.
- Opsug medier fra celle kultur plader der indeholder iMEFs, genopslæmmes ES-celler i 2 mL af medier (efter optøning ved 37 ° C) og plade celler i lag af iMEFs. Når du placerer kultur parabol i rugemaskinen, er det vigtigt at flytte fad i et "t" form at jævnt distribuere cellerne og forhindre sammenlægning mod midten af fadet.
- Passage ES-celler på feeder-fri gelatine-belagt retter. Passage ES-celler, før de bliver sammenflydende. ES celle kolonier opretholde selvfornyelse bedste hvis kolonierne er jævnt fordelt og ikke sammenflydende. Tilstedeværelsen af mange ES celle kolonier, der rører angiver, at celle tæthed er for høj.
- Coat et 6-godt kultur parabol med gelatine, som beskrevet ovenfor. Inkuber 0,25% trypsin-EDTA ved 37 ° C ~ 10-15 min til før varm trypsin.
- Næste, passage ES-celler ved første vask med 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og tilsætning af 1 mL 0,25% trypsin-EDTA-oploesning. Vente 1-2 min. til kolonier til at løsne. Adskille kolonier til en enkelt celle suspension af pipettering med 1 mL spids for ~ 5 gange.
- Bruge et mikroskop til at bekræfte enkelt celle dissociation af ES-celler. At slukke reaktionen, eller til at "neutralisere" trypsin, tilføje 10% FBS MEF medier. Centrifugeres celler på 300 x g ved stuetemperatur i 3-5 min, og Opsug mediet.
- Re suspendere den cellulære pellet i 2 mL af medier (ES celle) suppleret med glykogen syntase kinase-3 (GSK3) hæmmer (CHIR99021; GSK3i), eller 2i (MEKi/GSK3i) betingelser (2-3 µM GSK3i: CHIR99021, 1 µM MEKi: PD0325901).
- Aspirér gelatine fra celle kultur parabol, og der tilsættes 2 mL af medier indeholdende sektorrådene til fadet, og Placer fadet i 37 ° C inkubator (figur 1A-D). Dobbelte hæmning af GSK3i og MEKi fremmer grundtilstand naive pluripotency af ES-celler i mangel af feeder celler (iMEFs) og uden serum20. ES-celler bør være passaged to til tre gange for at fjerne MEFs før du fortsætter til crosslinking.
2. Crosslinking af ES-celler for ChIP og CARIP
- Høste ES-celler ved at vaske dem med PBS, derefter tilføje 0,25% trypsin pre varmes ved 37 ° C. Inkuber cellerne i flere minutter ved stuetemperatur. Undgå over trypsinization af ES-celler, hvilket vil føre til celledød. Bruge et mikroskop til at evaluere enkelt celle dissociation.
- Dæmpning trypsin fordøjelse, som beskrevet ovenfor for passaging ES-celler, og der centrifugeres celler på 300 x g ved stuetemperatur i 3-5 min.
- Cellerne i pre varmede (37 ° C) MEF media genopslæmmes (10% FBS/DMEM) på 2 × 106 celler/mL.
- Til bitmapgenkendelse celler, tilføje 37% formaldehyd løsning til en endelig koncentration på 1%, og der inkuberes celler i en konisk slange (15 mL eller 50 mL) ved 37 ° C til 8 min. Vend røret flere gange i 8 min periode at opnå homogen fiksering.
Bemærk: Fiksering tid kan være empirisk optimeret til CARIP. Hvis fiksering tid ændres, justeres antallet af sonikering cykler også. Også, 37 ° C temperatur øger crosslinking effektivitet i forhold til crosslinking ved stuetemperatur. Temperaturen af fiksering kan optimeres empirisk. - At stoppe fiksering reaktionen, tilføje 1,25 M Glycin (pre nedkølet ved 4 ° C) til en koncentration af 0,125 M. invertere tube på 8 rpm ved hjælp af en rotator i 5 min ved stuetemperatur. Centrifugeres stikprøve på 300 x g i 5 min ved stuetemperatur og Opsug mediet.
- Vaske celle pellet med pre kølet PBS (4 ° C), centrifugeres stikprøve på 300 x g i 5 min ved stuetemperatur og Opsug PBS. Cellerne vaskes med PBS igen. Næste, alikvot 15 × 106 celler pr. 15 mL tube.
- Fryse celle pellet ved at placere det i flydende nitrogen for 1 min på tøris i 5 min, eller placere umiddelbart ved-80 ° C.
BEMÆRKNING: Fast ES celle pellets kan opbevares i op til 6 måneder uden nedsat kvalitet i downstream eksperimenter.
3. kromatin sonikering for ChIP og CARIP
- Tø fast ES celle pellet på is. Genopslæmmes celle pellet i sonikering buffer (2,5 mL). For transskriptionsfaktorer eller epigenetiske tilsynsmyndigheder (protein faktorer), genopslæmmes pellet i 1 x TE, 1 mM PMSF, 1 x proteinase hæmmer cocktail. For Histon ændringer, genopslæmmes pellet i 1 x TE, 0,1% SDS, 1 mM PMSF, 1 x proteinase inhibitor.
Bemærk: Mens tilsætning af SDS effektiviserer sonikering, det kan ikke være gavnligt for evaluering af visse kromatin bestanddele eller transkriptionsfaktorer. - For kromatin immunoprecipitation (ChIP), der sonikeres kromatin med 14-18 cykler (30 s på 30 s resten) på 40% amplitude. For kromatin-associerede RNA immunoprecipitation (CARIP), reducere antallet af sonikering cyklusser (8-10 cykler). På grund af cellulære, fiksering og sonifier variation, bør betingelserne for sonikering bestemmes empirisk.
- Supplement sonikering buffer med 28 µL af 10% SDS for protein-faktorer, 28 µL af natrium-deoxycholate, og 0,28 mL 10% Triton-X100 og bland godt.
Bemærk: Tilsætning af disse komponenter til sonikering buffer genererer RIPA buffer. - Der centrifugeres prøve på 10.000 x g i 10 min. ved 4 ° C forud rydde kromatin. Flytte supernatanten til en frisk tube og fortsætte med kromatin immunoprecipitation.
- Alternativt kan sonicated kromatin opbevares ved-80 ° C indtil brug. Men opbevaring af sonicated kromatin ved-80 ° C kan føre til formindsket kvalitet for protein-faktor ChIP.
4. chIP og CARIP proces
- Tilføje 40 µL af protein A eller G magnetiske perler til en 1,5 mL, lave bindende tube. Tilføje 600 µL af PBS til at vaske perlerne. Placer røret over på en rack, der indeholder en magnet, inkuberes røret i 1 minut ved stuetemperatur, fjerne PBS og genopslæmmes de magnetiske perler i 100 µL af PBS.
- Tilføje 2-4 µg antistof til rør med magnetiske perler. Inkuber og rotere rør ved stuetemperatur i 40 min ved 8 rpm ved hjælp af en rotator til lette antistof binding til de magnetiske perler. Indsæt røret på den magnetiske rack, inkuberes i 1 min. ved stuetemperatur, så fjerne PBS.
- Tilføje 200 µL af PBS til at vaske de magnetiske perler. Vask med PBS udføres for at fjerne frie IgGs. Inkuber og rotere rør ved stuetemperatur i 5 min mellem vask trin. Vedhæfte røret til magneten og fjerne PBS.
- Immunoprecipitate kromatin-bundet proteiner af inkubere sonicated kromatin uddrag (4 × 106 celler pr. ChIP), med de magnetiske perler og rotere prøve ved 4 ° C (natten).
- Vaske de magnetiske perler. Inkuber prøve ved stuetemperatur med de følgende buffere og rotere prøve i 10 min med hver buffer: to gange med 1 mL af RIPA buffer (TE (10 mM Tric-HCl, 1 mM EDTA) pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% natrium deocycholate, 0,1% SDS), to gange med 1 mL af RIPA buffer c ontaining 0,3 M NaCl, to gange med 1 mL LiCl buffer (0,5% natrium deocycholate af 0,5% NP40, 0,25 M LiCl), en gang med 1 mL af TE buffer med 0,2% Triton X-100, og en gang med 1 mL af TE.
- De-crosslinking for ChIP. Re suspendere de magnetiske perler i 100 µL af TE. Tilføje 3 µL af 10% SDS og 5 µL af proteinase K (20 mg/mL). Inkuber prøve ved 65 ° C (natten).
Bemærk: Det er vigtigt at dække rør under dette trin med parafilm eller plastic wrap at forhindre fordampning.- Den følgende dag, vend røret flere gange for at blande. Brug derefter magnet rack til at overføre supernatanten til en frisk tube. At vaske de magnetiske perler, Tilsæt 100 µL af TE indeholdende 0,5 M NaCl, og senere kombinere de to supernatanter.
- De-crosslinking for CARIP. Re suspendere de magnetiske perler i 100 µL af TE. Tilføje 3 µL af 10% SDS og 5 µL af proteinase K (20 mg/mL). Inkuber prøve på 65 ° C i 4 til 12 h. inkubation tid ved 65 ° C skal bestemmes empirisk som følge af variabiliteten mellem celletyper, ultralydbehandling og fiksering betingelser, osv.
- Vend røret 3 - 5 gange Bland, anvende røret til den magnetiske rack, og efterfølgende flytter supernatanten til en frisk tube.
- At vaske de magnetiske perler, Tilsæt 100 µL af TE indeholdende 0,5 M NaCl, og senere kombinere de to supernatanter.
Bemærk: Det er vigtigt at bruge nukleasen-fri reagenser (fx., TE buffer, SDS, osv.) til at forhindre tab af DNA eller RNA under de-crosslinking trin.
- Uddrag DNA/RNA bruger 200 µL af phenol: chloroform: isoamyl alkohol (PCI) (25:24:1, v/v).
Bemærk: RNA kan også være udvundet ved hjælp af kommercielle kits ved hjælp af producentens anvisninger. Der omrystes i 30 s, spin på 10.000 x g ved stuetemperatur i 10 min, og flytte supernatanten til en frisk tube.- For at faelde DNA/RNA, tilføje 2 µL af GlycoBlue, 20 µL 3 M natriumacetat og 600 µL af ethanol. Mix af invertere ~ 5-8 gange, og prøven anbringes på tøris eller ved-80 ° C i mindst 1-2 h.
- Der centrifugeres prøve på 10.000 x g i 30 min. ved hjælp af en køle (4 ° C) bordplade centrifuge. Luft tørre pellet for < 1 min og genopslæmmes i 40 µL af EB buffer (10 mM Tris-HCl). For ChIP-Seq bibliotek forberedelse, fortsætte til trin 6.
- Fjerne DNA fra kromatin-associerede RNA IP prøver ved hjælp af DNase. Tilføje 10 x DNase buffer til 1 x koncentrationen i CARIP prøven. Tilføj 1 µL af DNase for op til 10 µg RNA (50 µL reaktion). Inkuber prøve ved 37 ° C i 30 min. ekstrakt RNA prøven med PCI. Resuspend i nukleasen-fri H2O.
5. dobbelt-strenget cDNA syntese for CARIP-Seq
- Syntese af første-streng cDNA. Reverse-transskription reaktion, at angive følgende reaktion i et rør, der er designet til en PCR-maskine: 10,5 µL af RNA og 1 µL tilfældige hexamer primere (3 µg/µL).
- Inkuber tube på 65 ° C i 5 min til at denaturere de sekundære struktur, og gemme det på køl i 2 min. Bland følgende komponenter: 4 µL af første-strand buffer, 2 µL af 0,1 M DTT, 1 µL af dNTP og 0,5 RNase ud. Dernæst, at PCR rør, tilføje 7,5 µL af den master mix. Inkuber rør i 2 minutter ved 25 ° C. Tilføj 1 µL af hævet skrift II (200 U/µL) og inkuberes som følger: 25 ° C i 10 min, 42 ° C til 50 min, 70 ° C i 15 min, og hold på 4 ° C.
- Anden-streng cDNA syntese. Røret anbringes på is. Næste, Tilføj de følgende komponenter i rækkefølge: 91 µL af diethyletheren pyrocarbonate (DEPC) behandlet vand, 30 µL af 5 x sekund-strand reaktion buffer, 3 µL af dNTP mix (10 mM), 1 µL af E. Coli DNA ligase (10 U/µL), 4 µL af E. Coli DNA Polymerase (10U/µL) , og 1 µL af E. Coli RNase H (2U/µL). Mix af forsigtigt vortexing og inkuberes ved 16 ° C i 2 timer.
Bemærk: Blanding af svippede eller invertere røret kan ikke være tilstrækkeligt at blandes grundigt reagenser. - Tilføj 2 µL af T4 DNA Polymerase og inkuberes ved 16 ° C i 5 min. rense cDNA (dobbelt-strenget, dscDNA) ved hjælp af PCR rensning kit. Elueres dscDNA i 40 µL af EB buffer.
- Fragment dobbelt-strenget cDNA. Shear cDNA (dscDNA) ved hjælp af et vand bad sonifier og en 1,5 mL tube til en størrelse på 250-500 bp. sonikering af dscDNA er afgørende for at reducere fragment størrelser for at lette sekvenseringen af hele RNA afskriften.
- Når du bruger en standard model af et vandbad sonifier, der sonikeres prøve for 3 × 10 min, eller 4 × 10 min.
Bemærk: Tre cyklusser bør anvendes for op til 1 µg af total RNA, mens fire cyklusser anbefales til 1-5 µg af total RNA. Centrifugeres røret kort efter hver sonikering cyklus, og opretholde en cool vandbad ved at tilføje friske is. - Når du bruger en Pico sonifier, anbefales det at bruge seks cykler for 1-5 µg total RNA og følgende cykling betingelser (30 s på 90 s off). Der centrifugeres røret kort efter 2-3 sonikering cykler. Effektiviteten af sonikering kan bestemmes ved at indlæse en brøkdel af den afrevne dscDNA (3-4 µL) på en agarosegel (2%). Det er vigtigt at teste empirisk sonikering betingelser som følge af variabiliteten mellem sonifiers.
- Udføre bibliotek forberedelse, som beskrevet i trin 6 til næste generations sekvensering.
6. chIP-FF. og CARIP FF. bibliotek opbygning
- Reparere enderne af DNA ved hjælp af en DNA ende-reparationssæt. Dette kit bruges til at generere blunt-ended DNA. For denne reaktion, Angiv følgende i en 1,5 mL, lav bindende tube: 34 µL DNA, 5 µL af 2,5 mM dNPTs, 5 µL af 10 mM ATP, 5 µL af 10 x ende-reparation buffer (5 mM DTT, 100 mM magnesium acetat, 660 mM kalium acetat 300 mM Tris-acetat, pH 7,8), og 1 µL af ende-reparation enzym mix (T4 polynucleotide kinase, T4 DNA polymerase).
- Inkuber prøve for 45 min ved stuetemperatur.
- Rense DNA ved hjælp af en reaktion oprydning kit. Elueres ende-repareret DNA i 32 µL af pre varmede (65 ° C) EB buffer. Mens vi ikke normalt kvantificere koncentrationen af DNA efter ChIP eller RNA efter CARIP, før biblioteket forberedelse, anbefales det at starte med mindst 5-10 ng af ChIP DNA eller CARIP RNA.
- Tilføjelse af en 3' "A" udhæng til slutningen-repareret DNA. Tilføje komponenter til en 1,5 mL, lave bindende tube: 30 µL DNA fra oven, 5 µL af 10 x NEB buffer 2, 1 µL af dATP fra 10 mM lager, 11 µL af H2O og 3 µL af 5 U / µL Klenow fragment (3' - 5' Exo-) , og bland forsigtigt af pipettering.
- Inkuber prøve i 30 minutter ved 37 ° C.
- Brug en reaktion oprydning kit til at rense DNA. Elueres DNA i 25 µL af pre varmede (65 ° C) EB buffer.
- Ligate adapter. Tilføj følgende komponenter på is: 23 µL DNA fra oven, 3 µL af 10 x T4 DNA ligase buffer, 1 µL af udglødet PE eller multiplexing adapter (4 µM) og 3 µL T4 DNA ligase (400 U/µL), og bland forsigtigt af pipettering.
Bemærk: Adapteren sekvenser kan også opnås fra en kommerciel kilde.
Oligonukleotid sekvenser:
PE adaptere
5' P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Multiplexing adaptere
5' P-GATCGGAAGAGCACACGTCT
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - Inkuber prøve i 30 min. ved stuetemperatur.
- Udføre størrelse udvalg af DNA ved hjælp af en færdigstøbte (2%) agarosegel. Kør gelen i 10 min.
- Punktafgifter regionen svarende til 250-450 bp.
Bemærk: ved at skære gel ovenfor over 200 bp, der er en nedsat muligheden for forurening fra unligated adapter dimerer. Det er vigtigt at fjerne enhver unligated adaptere før trinnet PCR. - Brug en gel udvinding kit til at rense DNA. Elueres i 20 µL af EB buffer.
- PCR og bibliotek rensning for sammenskrevne DNA prøver indeholdende parret-udgangen (PE) adaptere. Tilføje komponenter i et PCR rør: 12 µL af 50% af DNA fra oven, 12 µL vand, 25 µL af master mix (Phusion HF), 1 µL af PE PCR primer 1.0 og 1 µL af PE PCR primer 2.0.
Bemærk: Oligonukleotid sekvenser kan også opnås fra en kommerciel kilde.
Oligonukleotid sekvenser:
PE PCR Primer 1,0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
PE PCR Primer 2.0
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT - PCR og bibliotek rensning for sammenskrevne prøver indeholdende indeks PE adaptere. Tilføj komponenterne: 12 µL af 50% af DNA fra oven, 12 µL vand, 1 µL PCR primer InPE 1,0 (fortyndet 1:2), 1 µL PCR primer InPE 2.0 (fortyndet 1:2) og 1 µL PCR primer indeks (fortyndet 1:2).
Bemærk: oligonukleotid sekvenser kan også opnås fra en kommerciel kilde.
Oligonukleotid sekvenser:
Multiplexing PCR Primer 1,0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Multiplexing PCR Primer 2.0
5' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PCR Primer indeks sekvenser 1-12
PCR Primer, indeks 1
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, indeks 2
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, indeks 3
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, indeks 4
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, indeks 5
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, indeks 6
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, indeks 7
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, indeks 8
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, indeks 9
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, indeks 10
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, indeks 11
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, indeks 12
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC - Udføre PCR cykling ved hjælp af følgende betingelser (denaturere for 30 s på 98 ° C, 18 cyklusser af 10 s på 98 ° C, 30 s på 65° C, 30 s ved 72 ° C, 5 min ved 72 ° C, hold ved 4 ° C).
Bemærk: Antallet af PCR cykler bør fastlægges empirisk. - Størrelse udvælgelse af PCR-produkter. Køre DNA på en færdigstøbte E-Gel EX (2%) eller hjemmelavet 2% gel (Agarosen) og punktafgifter 300-500 bp region.
- Brug en gel udvinding kit til at rense DNA fra gel. Elueres endelige PCR produkt i 20 µL af EB buffer.
- Bruge en fluorometer til at måle koncentrationen af biblioteket. Udføre næste generation sequencing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi forhørt med held genome-wide bindingen af H3K4me3, H3K4me2 og KDM5B i ES-celler ved hjælp af denne ChIP-Seq protokol6. ES-celler blev kulturperler i feeder-fri betingelser (figur 1), og tværbunden som beskrevet ovenfor. Sonikering blev efterfølgende udført som beskrevet i trin 3.2 i ChIP-Seq-protokollen, og evalueres af kører DNA på en 2%-agarosegel (figur 2). Næste, ChIP blev udført som beskrevet i trin 4 og bibliotek forberedelse blev udført som beskrevet i trin 6. ChIP-Seq biblioteker blev sekventeret på en next-generation sequencing platform. Repræsentative brugerdefinerede UCSC browser udsigt afsløre berigelse af H3K4me3, H3K4me2 og KDM5B på core pluripotency genet POU5F1 (figur 3A), og HOXC-klynge (figur 3B). CARIP-Seq blev også udført ved at følge protokollen, som beskrevet i trin 4-6. En repræsentativ UCSC browservisning afslører berigelse af H4K20me3-associerede RNA (CARIP-Seq) og H4K20me3 belægning (ChIP-Seq) på en loci i ES-celler (figur 4). CARIP-Seq signal viser, at mens RNA er forbundet med H4K20me3, det ikke betyder nødvendigvis at det interagerer med locus vist. CARIP-Seq datasæt kan analyseres på samme måde som ChIP-Seq datasæt. Data, der genereres fra mus ES celle CARIP-FF. og ChIP-Seq eksperimenter kan både være justeret til en reference genom (fx., mm9, mm10) ved hjælp af bowtie221. ChIP-FF. og CARIP FF. beriget regioner kan både identificeres ved hjælp af peak kaldende programmer såsom "Rumlige klyngedannelse for identifikation af ChIP-Enriched regioner" (SICER)22 eller MACS23,24. Fordi CARIP-Seq datasæt sandsynligvis omfatter bred toppe, er det vigtigt at bruge en algoritme, der kan identificere bredt og skarpe toppe. Mens de protokoller er beskrevet i dette håndskrift er blevet optimeret til at udføre ChIP-FF. og CARIP FF. ved hjælp af ES-celler, disse protokoller bør ligeledes være egnede til evaluering af protein-DNA og kromatin-associerede RNA interaktioner i andre celletyper.
Figur 1: Feeder-fri kultur af ES-celler. A eksperimentelle design. B ES celler dyrkes på iMEFs i ES celle medier indeholdende LIF, eller i feeder-fri betingelser med ES celle medier indeholdende LIF og (C) GSK3i eller (D) GSK3i og MEKi (2i). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: sonikering af crosslinked ES celle kromatin. Crosslinked ES-celler blev sonicated ved hjælp af en sonifier med en microtip til 18 cykler (40% amplitude, 30 s på og 30 s resten). Crosslinking blev vendt, og RNase fordøjelsen blev efterfølgende udført for at fjerne RNA. DNA blev renset ved hjælp af PCI og køre på en agarosegel (2%). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentant ChIP-Seq analyse af en Histon ændre enzym og Histon ændringer i ES-celler. Brugerdefinerede UCSC browser udsigt over H3K4me3, H3K4me2 og KDM5B på pluripotency-regulator (A) POU5F1 og (B) HOXC klynge i ES-celler (normaliseret tag tæthed (RPBM), læse pr. base pr. million læser). Bemærk overlapning mellem KDM5B bindende og H3K4me3/2 belægning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentant CARIP-Seq analyse af RNA tilknyttet en Histon ændring og ChIP-Seq i ES-celler. UCSC browser udsigt over H4K20me3 CARIP-FF. og H4K20me3 ChIP-Seq signaler i ES-celler (normaliseret tag tæthed (RPBM), læse pr. base pr. million læser). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ChIP-Seq er en nyttig metode til at vurdere placeringen af globale protein-DNA interaktioner (fx., transskription faktorer/Histon ændre enzymer/Histon ændringer og DNA) i ES-celler, mens den nyudviklede CARIP-Seq protokol er nyttige i afhører genome-wide association af RNA'er med kromatin bestanddele. ChIP-Seq er et grundlæggende redskab, der bruges til at evaluere epigenetiske landskaber af ES-celler og andre celletyper. Kvaliteten af ChIP-FF. og CARIP FF. biblioteker er i vid udstrækning afhængig af ChIP-grade antistoffer. Egnetheden af antistoffer for ChIP-Seq kan empirisk bestemmes ved at udføre ChIP-PCR, hvor en ≥ 3 5-fold berigelse på positiv kontrol regioner i forhold til ubesatte regioner skal være tilstrækkelig til at skabe høj kvalitet ChIP-Seq data25. Ligeledes kan antistoffer testes for deres egnethed til CARIP-Seq på samme måde som beskrevet for ChIP-Seq med mindre ændringer. Efter RNA IP skridt i CARIP protokol, som beskrevet i afsnittet metoder ovenfor, bør reverse-transskription PCR udføres for at generere cDNA, der kan bruges som en skabelon til at udføre Q-RT-PCR. Det anbefales at vurdere berigelse efter ChIP eller CARIP på flere genomisk regioner. Der er yderligere overvejelser at teste når de evaluerer kvaliteten af antistoffer til ChIP eller CARIP. For eksempel strengheden af buffere anvendes til ChIP og CARIP kan optimeres ved at ændre koncentrationen af NaCl: en lav NaCl-koncentration er egnet for stærkt-specifikke antistoffer, mens en høj NaCl-koncentration kan være nyttige for antistoffer med ikke-specifik binding. Om biblioteket forberedelse af næste generation sequencing, kan brugerdefinerede primere og indeks også bruges i stedet for kommercielt erhvervede oligonukleotider. Det er dog vigtigt at bemærke, herunder en phosphorothioate ændring mellem to baser på 3'-enden har vist at forhindre nukleasen fordøjelsen26. Tredjeparts-RNA-Seq eller ChIP-Seq bibliotek byggesæt kan også bruges til at generere biblioteker til sekvensering af CARIP og ChIP prøver, henholdsvis. Det er dog vigtigt at empirisk test kits til at vurdere deres effektivitet i genererer kvalitet bibliotekerne til næste generations sekvensering. Supplerende protokoller kan også anvendes til at udføre ChIP-Seq bibliotek forberedelse, såsom ChIPmentation27. Dog, tilpasning af ChIPmentation til ChIP-Seq protokollen beskrevet her vil kræve yderligere ændringer og yderligere optimering.
Her beskriver vi ChIP og CARIP protokoller, der er blevet optimeret med moderat antal celler (4 × 106 celler pr. IP). Mens ChIP-protokollen kan udføres ved hjælp af lav til mellemliggende celle numre (105 til 106 celler), vi har ikke udført CARIP-Seq bruger mindre end 2 × 106 celler. Af empirisk testning forskellige fiksering og ultralydbehandling betingelser, er det imidlertid muligt, at denne protokol kan arbejde ved hjælp af et lille antal celler.
I sammendrag er ChIP-FF. og CARIP FF. nyttigt for at skabe globale kort over kromatin-associerede proteiner og RNA'er i ES-celler, henholdsvis. Mens disse protokoller er blevet optimeret til ES-celler, kan de være optimeret til at generere kromatin kort ved hjælp af en bred vifte af pattedyr cellelinjer og vævstyper. Disse protokoller kan også være optimeret til at generere encellede ChIP-Seq eller CARIP-Seq biblioteker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, et tilskud fra National Heart, Lung og Blood Institute (1K22HL126842-01A1) tildeles B.L.K. Dette arbejde udnyttes Wayne State University høj Performance Computing gitteret for it-ressourcer (< https://www.grid.wayne.edu/>). Vi takker Jiji Kurup for bistand med CARIP-Seq dataanalyse.
FORFATTERNES BIDRAG:
B.L.K. udtænkt af metoden CARIP-FF., designet og udført ChIP-FF. og CARIP FF. eksperimenter, analyseret sequencing data og udarbejdet manuskriptet. Alle forfattere har læst og godkendt den endelige version af dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) - ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] - ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody - ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
References
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32 (2014).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
- Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
- Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28 (2016).
- Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
- Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
- Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
- Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
- Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
